Понятие quorum sensing. Химическая коммуникация у бактерий (Quorum Sensing регуляция) - Документ. Ингибиторы QS, вырабатываемые высшими растениями
2.1. Общая характеристика и механизм кворум сенсинга
Система межклеточной коммуникации у микроорганизмов носит название системы quorum sensing (QS ). Сегодня система QS определяется как система координированной экспрессии генов в популяции, зависящая от показателя её плотности, с использованием малых сигнальных молекул. Как уже отмечалось выше, этот механизм был впервые описан в 1970 году Нильсоном у морской бактерии Vibrio fisheri в качестве системы регуляции биолюминисценции. Изначально предполагалось, что данный механизм регуляции свойственен лишь небольшому числу близкородственных видов рода Vibrio , однако дальнейшие исследования показали широкую распространённость этого механизма регуляции в мире микроорганизмов . Было обнаружено, что с помощью системы QS микроорганизмы способны регулировать многие процессы жизнедеятельности, в частности патогенность, вторичный метаболизм, формирование биоплёнки и многое другое. Было показано, что система QS встречается не только у бактерий, но и у некоторых низших эукариот, таких как дрожжеподобные грибы родов Candida и Cryptococcus . Более того, оказалось, что с помощью этой системы микроорганизмы способны взаимодействовать не только с себе подобными, но и осуществлять межцарственную коммуникацию, в том числе и с высшими эукариотами.
В общем случае функционирование системы QS базируется на ряде ключевых принципов (рис. 1):
Использование малых сигнальных молекул – в системе QS передача сигнала от одной клетке к другой осуществляется с помощью сигнальных молекул различной химической природы.
Наличие специфических рецепторов – сигнальные молекулы не влияют на экспрессию генов-мишеней на прямую. Активация генов-мишеней происходит лишь после связывания сигнальных молекул с соответствующими рецепторами.
Влияние плотности популяции клеток – запуск системы QS осуществляется лишь по достижении определённого значения плотности популяции клеток, коррелирующей с концентрацией сигнальных молекул во внешней среде.
Самоподдержание функционирования – контроль синтеза новых сигнальных молекул и рецепторов осуществляется так же, как и генов- мишеней в отсутствии активации систем репрессии.
Наличие механизмов избирательной негативной регуляции – в клетках микроорганизмов имеются как зависимые, так и не зависимые от QS гены негативной регуляции, продукты которых способны избирательно отключать целые звенья системы QS или всю систему в целом.
Рис. 1. Общая схема функционирования системы quorum sensing.
Данные принципы являются общими практически для всех типов систем QS не зависимо от их конкретной структурной организации. Запуск системы QS обычно совпадает по времени с ранней стадией экспоненциального роста, для которой является характерным быстрый рост плотности популяции клеток. Экспрессия генов-мишеней же напротив обычно начинается с выходом популяции клеток в стационарную фазу, и обычно является комплексной, то есть, предполагает начало биосинтеза практически всех регулируемых с помощью QS продуктов в короткий промежуток времени. Таким образом, ранние этапы работы системы QS заключаются в. обеспечении биосинтеза сигнальных молекул и рецепторов к ним, до определённого момента, совпадающего с накоплением максимальной концентрации сигнальных молекул в межклеточном пространстве, по достижению которой работа системы QS переходит в самоподдерживающееся состояние.
Механизмы, лежащие в основе ранней активации системы QS, на сегодня окончательно не выяснены. Не смотря на то, что обнаружено большое количество различных регуляторов, которым приписывается определённая роль в ранней активации системы , многие вопросы остаются не решёнными. Прежде всего, не ясно, каким образом регулируется первичное накопление сигнальных молекул и рецепторов к ним. Существует гипотеза о том, что определённое количество сигнальных молекул и рецепторов к ним присутствует в клетках постоянно, и первичное их накопление происходит по тому же самоподдерживающемуся механизму, при этом на синтез сигнальных молекул и рецепторов расходуется часть внутриклеточного пула этих соединений. Остальная же часть выводится из клеток и по достижении пороговой концентрации реабсорбируется и запускает экспрессию генов-мишеней. Однако, исходя из особенностей функционирования некоторых типов системы QS, подобное видится маловероятным. James P. Pearson, напротив, считает что первичный запуск QS осуществляется с помощью неспецифических регуляторов транскрипции таких как MvaT и Vfr (V irulence f actors r egulator) Pseudomonas aeruginosa , и система переходит в самоподдерживающееся состояние значительно позднее.
2.2. Реакции кворум-сенсинга у грамположительных микроорганизмов
Грамположительные бактерии обычно осуществляют коммуникации, используя олигопептидные сигнальные молекулы. Передача сигналов в большинстве случаев включает двухкомпонентный механизм фосфорилирования. Как правило, состояние кворума достигается при переходе популяции бактериальных клеток в стационарную фазу роста. Именно в это время обнаруживаются сигнальные молекулы, при помощи которых клетки контактируют друг с другом. Общую схему коммуникаций грамположительных бактерий можно представить следующим образом: сначала в клетке синтезируется предшественник, который, модифицируясь, превращается в зрелый олигопептид. Последний экскретируется наружу клетки экспортером. Молекулы олигопептида накапливаются в межклеточном пространстве по мере того, как растёт плотность бактериальных клеток. Двухкомпонентная сенсорная киназа, пронизывающая мембрану, распознает сигнал и осуществляет его передачу в клетку в процессе каскадного фосфорилирования. В клетке олигопептидная молекула взаимодействует с целевым геном (генами).Классической пептидной кворум-зависимой системой можно считать систему, отвечающую за конъюгативный перенос плазмид у Enterococcus faecalis и родственных бактериальных видов. Эта система стимулирует распространение в микробной популяции признаков, важных для взаимодействия микроорганизма и животного-хозяина, а также для устранения конкуренции. Переносимая пептидной кворум-зависимой системой плазмида pPDl отвечает за синтез гемолизинов, плазмида pCDl - за образование бактериоцина, плазмида pCFlO - за устойчивость E.faecalis к тетрациклину. Каждый гекса- или октапептид индуцирует слипание бактериальных клеток и их конъюгацию с переносом от донора к реципиенту определенной плазмиды. Например, октапептид cPDl стимулирует конъюгативный перенос плазмиды pPDl. Плазмида кодирует рецептор, находящийся на белке-репрессоре соответствующего оперона. Взаимодействие олигопептида с рецептором вызывает диссоциацию репрессора от ДНК, тем самым запуская синтез соответствующего продукта. Плазмида pPDl включает также ген traC, продуктом которого является белок, облегчающий проникновение пептида через клеточную стенку. Олигопептидные сигналы интенсивно синтезируются клетками, не несущими соответствующие плазмиды (реципиентами), в то время как у клеток-доноров синтез таких сигналов подавлен, более того, плазмида кодирует ингибирующий пептид.
Продуктом плазмиды pPDl является пептид iPDl, HHaKTHBHpyiounmcPDl.
Другим кворум-зависимым процессом, обнаруженным у E.faecalis , является выработка двух вирулентных факторов: желатиназы (GelE) и сериновой протеазы (SprE).
Примером использования пептидного сигнала для осуществления межклеточных взаимодействий может служить система кворум-сенсинга, осуществляющая контроль над синтезом экзотоксинов в поздней логарифмической фазе роста у Staphylococcus aureus . В этой системе белок AgrD синтезируется в виде предшественника, состоящего из 46 аминокислот, который в процессе экспорта белком AgrB превращается в зрелый пептид AIP (autoinducing peptide), состоящий из 8 аминокислот. AIP распознается двухкомпонентной сенсорной киназой AgrC, которая передает сигнал внутрь клетки в процессе фосфорилирования регулятора ответа - AgrA. AgrA~P активирует транскрипцию целевых генов, стимулирует транскрипцию оперона agrB, D, С, А (положительная ауторегуляторная петля), а также «запрещает» транскрипцию генов, кодирующих другие экзотоксины. На основании различий в AIP и его рецепторе штаммы S.aureus могут быть отнесены к четырём или более группам. Олигопептиды, синтезируемые одной из групп, индуцируют патогенность в этой группе и специфически подавляют системы Agr-вирулентности в других группах.
От плотности популяции зависит появление компетентности в поздней логарифмической фазе роста у Streptococcus pneumoniae . Ген соmС кодирует предшественник, состоящий из 41 аминокислотного остатка. Последний преобразуется в зрелый пептид, состоящий из 17 аминокислотных остатков в процессе взаимодействия с системой экспорта пептидов (АВС-система), которую образуют продукты генов соmАВ. Пептид контактирует со своим рецептором на поверхности клетки - гистидинкиназой, продуктом гена comD. Активированная гистидинкиназа фосфорилирует продукт гена соmЕ. По мере накопления клеток количество пептидных сигналов растёт и достигает в среде критического уровня. Соответственно увеличивается и количество фосфорилированного белка cоmЕ, который, начиная с определенной концентрации, связывается с промотором оперона comCDE, стимулируя его работу (положительная ауторегуляторная петля), активирует промотор оперона соmАВ (система экспорта белка из клетки), активирует оперон сотХ, который включает целую цепочку поздних генов компетентности; отвечающих за связывание и поглощение трансформирующей ДНК и все остальные, поздние стадии трансформации.
В добавление к приведённым примерам реакций кворум-сенсинга у грамположительных бактерий нужно отметить, что в качестве сигнальных молекул помимо олигопептидов грамположительными бактериями также используются вещества другой химической природы. Так, у представителей порядка Actinomycetales наряду с пептидными сигнальными молекулами были обнаружены вещества низкомолекулярной природы, большинство из которых содержит лактонную группировку.
У стрептомицетов в системы кворум-сенсинга вовлечены бутиролактоны и соответствующие им белковые рецепторы, которые совместно регулируют морфологическое развитие и образование антибиотиков у их продуцентов . Наиболее хорошо изученным актиномицетным регулятором является А-фактор, представляющий собой 2-изо-каприлоил-3-оксиметил-у-бутиролактон.
Влияние А-фактора на морфологическую дифференцировку и антибиотикообразование подчиняется общей схеме работы стрептомицетных регуляторов, содержащих лактонную группировку. На ранних стадиях роста, когда концентрация А-фактора низка, рецептор А-фактора (АгрА) связывается и репрессирует экспрессию общего гипотетического активатора биосинтеза стрептомицина и спорообразования. При выделении АгрА из клеточного лизата S.griseus IFO 13350 было показано, что этот белок состоит из 276 аминокислот и имеет молекулярную массу 29,1 кДа.
Когда плотность культуры возрастает, концентрация А-фактора достигает критического уровня, при котором он связывает АгрА, вызывая диссоциацию последнего от ДНК и, таким образом включая транскрипцию ключевого гена adpA, кодирующего AdpA (белок, состоящий из 405 аминокислот, содержащий в центральном участке сайт связывания с ДНК, схожий с регуляторами транскрипции из семейства белков AraC/XylS). AdpA, в свою очередь, является позитивным регулятором обнаруженного цитоплазматического активатора кластера генов биосинтеза стрептомицина и активаторов процесса спорообразования. Цитоплазматический активатор, связываясь с ДНК в районе промотора гена специфической регуляции кластера биосинтеза стрептомицина strR, индуцирует транскрипцию данного гена, расположенного вслед за ним гена устойчивости к собственному антибиотику - aphD, гена adsA, кодирующего экстрацитоплазматический а-фактор РНК-полимеразы, необходимой для формирования воздушного мицелия, а также гена sgmA, кодирующего белок-пептидазу, участвующую наряду с другими гидролитическими ферментами в деградации белков субстратного мицелия в результате формирования воздушного мицелия. Регуляторный продукт гена strR обусловливает начало транскрипции структурных генов биосинтеза в составе кластера с StrR-зависимых промоторов. Начало экспрессии с промотора strR гена под влиянием цитоплазматического активатора обеспечивает также наработку продукта гена aphD - аминогликозидфосфотрансферазы, и тем самым создание базового уровня устойчивости штамма к собственному антибиотику.
Показано, что у разных видов стрептомицетов наблюдается гомология между структурными элементами регуляторов. Нуклеотидные последовательности, гомологичные гену агрА у S.griseus , обнаружены также у других стрептомицетов. Например, у S.coelicolor A3 (2) было обнаружено два гена сргА и сргВ, кодирующих АгрА-подобные белки СргА и СргВ, которые на 90,7% сходны между собой и на 35% - с АгрА.
Как уже отмечалось выше, процесс формирования биоплёнки является сложным процессом, в который вовлекаются многие клеточные системы. Несомненно, что такой процесс требует достаточно тонких механизмов регуляции, которые позволяли бы оптимизировать процесс формирования биоплёнки и обеспечивать правильное функционирование этой структуры. Особенно остро, этот вопрос ставится, когда мы имеем дело с природными поливидовыми биоплёнками, состоящими из десятков, а то и сотен видов микроорганизмов. Для нормального функционирования и выживания такого сообщества микроорганизмы, входящие в его состав должны действовать сообща и координировать свою активность принося тем самым пользу всему сообществу. Исследования последних сорока лет позволили выявить и описать механизмы такой регуляции и их роль в существовании микроорганизмов и их сообществ.
Сегодня изучение процессов межклеточной коммуникации у микроорганизмов является одной из наиболее динамично развивающихся областей современной микробиологии, с привлечением самых передовых на сегодняшний день методов биохимии и молекулярной генетики. Углубление знаний о процессе коммуникации у микроорганизмов открывает широкие перспективы для направленной регуляции этих процессов, что является важным, в частности для биотехнологии и медицины. Ниже будет проведён разбор основных принципов функционирования системы межклеточной коммуникации у микроорганизмов.
4.1. Система quorum sensing
Система межклеточной коммуникации у микроорганизмов носит название системы quorum sensing (QS ). Сегодня система QS определяется как система координированной экспрессии генов в популяции, зависящая от показателя её плотности, с использованием малых сигнальных молекул . Как уже отмечалось выше, этот механизм был впервые описан в 1970 году Нильсоном у морской бактерии Vibrio fisheri в качестве системы регуляции биолюминисценции . Изначально предполагалось, что данный механизм регуляции свойственен лишь небольшому числу близкородственных видов рода Vibrio , однако дальнейшие исследования показали широкую распространённость этого механизма регуляции в мире микроорганизмов. Было обнаружено, что с помощью системы QS микроорганизмы способны регулировать многие процессы жизнедеятельности, в частности патогенность, вторичный метаболизм, формирование биоплёнки и многое другое . Было показано, что система QS встречается не только у бактерий, но и у некоторых низших эукариот, таких как дрожжеподобные грибы родов Candida и Cryptococcus . Более того, оказалось, что с помощью этой системы микроорганизмы способны взаимодействовать не только с себе подобными, но и осуществлять межцарственную коммуникацию, в том числе и с высшими эукариотами .
В общем случае функционирование системы QS базируется на ряде ключевых принципов (рис. 12):
Использование малых сигнальных молекул – в системе QS передача сигнала от одной клетке к другой осуществляется с помощью сигнальных молекул различной химической природы.
Наличие специфических рецепторов – сигнальные молекулы не влияют на экспрессию генов-мишеней на прямую. Активация генов-мишеней происходит лишь после связывания сигнальных молекул с соответствующими рецепторами.
Влияние плотности популяции клеток – запуск системы QS осуществляется лишь по достижении определённого значения плотности популяции клеток, коррелирующей с концентрацией сигнальных молекул во внешней среде.
Самоподдержание функционирования – контроль синтеза новых сигнальных молекул и рецепторов осуществляется так же, как и генов- мишеней в отсутствии активации систем репрессии.
Наличие механизмов избирательной негативной регуляции – в клетках микроорганизмов имеются как зависимые, так и не зависимые от QS гены негативной регуляции, продукты которых способны избирательно отключать целые звенья системы QS или всю систему в целом.
Рис. 12. Общая схема функционирования системы quorum sensing.
Данные принципы являются общими практически для всех типов систем QS не зависимо от их конкретной структурной организации. Запуск системы QS обычно совпадает по времени с ранней стадией экспоненциального роста, для которой является характерным быстрый рост плотности популяции клеток . Экспрессия генов-мишеней же напротив обычно начинается с выходом популяции клеток в стационарную фазу, и обычно является комплексной, то есть, предполагает начало биосинтеза практически всех регулируемых с помощью QS продуктов в короткий промежуток времени . Таким образом, ранние этапы работы системы QS заключаются в обеспечении биосинтеза сигнальных молекул и рецепторов к ним, до определённого момента, совпадающего с накоплением максимальной концентрации сигнальных молекул в межклеточном пространстве, по достижению которой работа системы QS переходит в самоподдерживающееся состояние .
Механизмы, лежащие в основе ранней активации системы QS, на сегодня окончательно не выяснены. Не смотря на то, что обнаружено большое количество различных регуляторов, которым приписывается определённая роль в ранней активации системы, многие вопросы остаются не решёнными . Прежде всего, не ясно, каким образом регулируется первичное накопление сигнальных молекул и рецепторов к ним. Существует гипотеза о том, что определённое количество сигнальных молекул и рецепторов к ним присутствует в клетках постоянно, и первичное их накопление происходит по тому же самоподдерживающемуся механизму, при этом на синтез сигнальных молекул и рецепторов расходуется часть внутриклеточного пула этих соединений. Остальная же часть выводится из клеток и по достижении пороговой концентрации реабсорбируется и запускает экспрессию генов-мишеней. Однако, исходя из особенностей функционирования некоторых типов системы QS, подобное видится маловероятным. James P. Pearson, напротив, считает что первичный запуск QS осуществляется с помощью неспецифических регуляторов транскрипции таких как MvaT и Vfr (V irulence f actors r egulator) Pseudomonas aeruginosa , и система переходит в самоподдерживающееся состояние значительно позднее .
Владельцы патента RU 2534617:
Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии и фармацевтики, а именно к малым регуляторным молекулам, способным направленно изменять плотностно-зависимую коммуникацию и регулируемое ей коллективное поведение («чувство кворума») у бактерий. В частности, изобретение относится к применению производного тиазола формулы 1 в качестве регулятора (активатора или ингибитора) коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий. Технический результат - производное тиазола, предназначенное для регуляции опосредуемого гомосеринлактонами «чувства кворума» у виолацеин-продуцирующих биотехнологически полезных, гнилостных и патогенных бактерий. 2 ил., 1 табл., 2 пр.
Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и фармацевтике и касается малых регуляторных молекул, способных направленно изменять (ослаблять или усиливать) плотностно-зависимую коммуникацию и регулируемое ей коллективное поведение («чувство кворума») у бактерий. Изобретение может найти применение при контроле биотехнологических процессов, производстве средств для предупреждения порчи сельскохозяйственной продукции, а также создании новых лекарственных препаратов, предназначенных для контроля и управления бактериальными инфекциями растений, животных и человека.
Обнаружение плотностно-зависимой коммуникации у бактерий с характеристикой лежащих в ее основе молекулярно-генетических механизмов стало одним из наиболее ярких открытий в микробиологии конца XX века . При этом данный феномен коллективного поведения бактерий, обозначенный понятием «чувство кворума» (англ. - quorum sensing), позволил принципиально по-новому оценить целый ряд примеров функциональной и морфологической дифференцировки прокариот, включая развитие биолюминесценции, синтез пигментов и антибиотиков, образование экзоферментов и факторов вирулентности, формирование биопленок, конъюгацию и спорообразование .
Первым из описанных и наиболее распространенным среди микроорганизмов вариантом «чувства кворума» являются luxI/luxR-подобные системы, в которых синтезируемая под контролем гена luxI сигнальная молекула-автоиндуктор диффундирует во внешнюю среду, а при достижении критической плотности популяции и определяемой этим собственной пороговой концентрации совершает обратное движение внутрь бактериальной клетки, где, связываясь с регуляторным белком LuxR, запускает транскрипцию целевых генов . При этом анализ химической природы подобных автоиндукторов позволил охарактеризовать их как разнообразные варианты ацилированных гомосеринлактонов (ГСЛ) .
Расшифровка молекулярно-генетических механизмов коллективного поведения, а также выявление важной биологической роли систем плотностно-зависимой коммуникации, определили актуальность поиска подходов к управлению чувством кворума. Предложенными решениями стали: 1) подавление синтеза автоиндуктора; 2) его деградация специфическими ферментами (лактоназами или ацилазами); 3) использование агонистов и антагонистов ГСЛ, способных прямо интерферировать с естественным сигналом за связывание с luxR-подобными белками . Именно последний подход, наиболее интенсивно разрабатываемый во многих лабораториях по всему миру и к настоящему моменту приведший созданию уже нескольких сотен активных соединений , составляет теоретическую основу для настоящего изобретения.
Анализ открытых патентных источников позволяет констатировать, что наиболее близким аналогом заявляемого изобретения является патент , формула и описание которого содержат сведения о ряде соединений, в зависимости от объекта воздействия способных вызывать либо активационные (агонистические), либо ингибирующие (антагонистические) эффекты в отношении опосредуемого гомосеринлактонами «чувства кворума» у определенных видов бактерий. При этом в основу подобных веществ заявителями положено аналогичное природным ГСЛ лактонное кольцо, для придания которому дополнительных модулирующих активностей осуществлена ковалентная модификация ацильными группами различного строения и состава. Однако значительное структурное сходство предложенной группы молекул с естественными сигналами не только обеспечивает обозначенную заявителями возможность интерференции между ними, но потенциально сохраняет возможность развития неучтенных эффектов в отношении других микроорганизмов, плотностно-зависимая коммуникация между которыми опосредуется структурно схожими ГСЛ.
В свою очередь относительно химической структуры заявляемого соединения наиболее близким известным техническим решением является патент , формула и описание которого содержат сведения о ряде соединений, в основу которых положено пятичленное кольцо тиазола, ковалентно связанное с замещенными или незамещенными циклоалкильными, арильными и др. группировками. Однако в данном патенте отсутствуют указания о возможности использования данных соединений для регуляции коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий, а основным назначением заявленных соединений является их применение в качестве антагонистов аденозиновых рецепторов.
Таким образом, заявляемое изобретение не известно из уровня техники, что определяет его соответствие требованию новизны.
Задачей данного изобретения является разработка структурно отличного от гомосеринлактнов соединения, обладающего избирательной и выраженной способностью к регуляции (как усилению, так и ослаблению) опосредуемого ГСЛ коллективного поведения («чувства кворума») у определенного круга биотехнологически полезных, гнилостных и патогенных бактерий.
В настоящем изобретении эта задача решается применением соединения на основе тиазола, полностью описываемого формулой 1:
В данном изобретении раскрывается структурная формула соединения формулы 1 и способы его практического применения для регуляции коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий.
В соответствии с настоящим изобретением регуляторный препарат (композиция) на основе производного тиазола содержит по весу от 0.0001 до 100% соединений формулы 1, остальное - нейтральные компоненты или вещества, позитивно модифицирующие (повышающие биодоступность, увеличивающие сроки действия и т.д.) свойства данной композиции.
По сравнению с соединениями, составляющими сущность известных патентов , заявляемое соединение формулы 1 имеет ряд существенных отличий, а именно:
во-первых, в отличие от известных соединений, созданных на основе лактонного кольца и, в этой связи, являющихся близкими структурными аналогами природных авторегуляторных молекул - гомосеринлактонов , заявляемое соединение представляет собой структурно отличный от них синтетический лиганд. Из доступной научной и патентной литературы регуляторы «чувства кворума» на основе тиазола не известны;
во-вторых, в отличие от известных производных тиазола общей формулы 2
заявляемое соединение имеет только один вариант ковалентно присоединяемого радикала, по своему положению соответствующего R 4 и полностью описываемого аналогичным имеющемуся в молекуле естественного сигнала (гексаноил-гомосеринлактона) остатком гексановой кислоты, при отсутствии иных изменений по радикалам R 1 , R 2 и R 3 =Н. Кроме того, в отличие от известного патента , оговаривающего использование соединений общей формулы 2 в качестве антагонистов аденозиновых рецепторов, заявляемое соединение формулы 1 предназначено для регуляции опосредуемого ГСЛ коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий;
в-третьих, благодаря структурным отличиям от природных авторегуляторных молекул, проявляющих активность во многих luxI/luxR-подобных системах, заявляемое соединение формулы 1 обладает избирательной (селективной) регуляторной активностью, реализуемой в отношении cviI/cviR-регулируемой системы биосинтеза виолацеина Chromobacterium violaceum, а также других биотехнологически полезных, гнилостных и патогенных виолацеин-продуцирующих, бактерий (см. пример 1). При этом вероятной причиной селективного действия соединения формулы 1 в названных системах «чувства кворума» лежит избирательное взаимодействие с регуляторным белком CviR и его близкими гомологами, но не другими LuxR-подобными белками. В свою очередь природное разнообразие CviR-подобных белков определяет возможность их как позитивного, так негативного регулирования заявляемым соединением, что у различного круга биотехнологически полезных, гнилостных и патогенных виолацеин-продуцирующих бактерий будет проявляться либо как усиление (см. пример 1), либо как ослабление (см. пример 2) коллективного поведения.
Для понимания сути изобретения также необходимо указать, что достигаемая применением соединения формулы 1 регуляция «чувства кворума» включает, но не исчерпывается только воздействием на продукцию виолацеина, т.к. под контролем регуляторного белка CviR и его гомологов находится ряд целевых генов (оперонов), в том числе ответственных за продукцию экзоферментов и образование биопленок. Использование же теста индукции или ингибирования биосинтеза виолацеина в настоящем изобретении определяется простотой и информативностью регистрируемого проявления регуляторной активности соединения формулы 1.
Таким образом, результатом действия соединения формулы 1 является специфическая регуляция определенной системы «чувства кворума», направленность которой (усиление или ослабление) определяется рецепторными особенностями воспринимающих его CviR-подобных белков. Таким образом, с использованием одного и того же соединения оказывается возможным разнонаправленное воздействие на коллективное поведение различных микроорганизмов, в том числе изолированно или в их смешанной культуре.
Защищаемое применение соединения формулы 1 подразумевает, в том числе, его использование для управления биотехнологическими процессами, реализуемыми с помощью виолацеин-продуцирующих микроорганизмов (справочное: виолацеин-производное индола, образующееся при окислении триптофана, сине-фиолетовый пигмент с антибактериальной, протистоцидной, противовирусной и другими биотехнологически и фармакологически полезными активностями). В этом случае соединение формулы 1 может вводиться в плотные или жидкие питательные среды в виде растворов, а также применяться в виде чистого вещества или иммобилизованным на различных носителях.
В состав патентуемого изобретения входит также применение соединения формулы 1 для регуляции активности других целевых генов (оперонов), в том числе вовлеченных в процессы порчи сельскохозяйственной продукции, а также развитие инфекционных заболеваний растений, животных и человека. С этой целью данное соединение может вводиться в организм для обеспечения системного эффекта, а также применяться местно для воздействия на определенные области (например, в составе перевязочных материалов для обработки ран, при обработке операционного поля и т.д.). Соединение может использоваться в виде твердых веществ, растворов или суспензий в воде или других растворителях, а также нанесенным на различные носители. Возможно также использование соединения формулы 1 в составе композиций с другими веществами, в том числе позитивно модифицирующими (увеличивающими биодоступность, сроки действия) его биологическую активности.
Заявляемое изобретение иллюстрируется, но никак не ограничивается следующими примерами.
Пример 1. Стимуляция коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий.
Определение способности соединения формулы 1 к регуляции «чувства кворума» проводилось с использованием двух бактериальных тест-систем, в присутствии гексаноил-гомосеринлактона (С 6 -ГСЛ)? отвечающих синтезом пигмента виолацеина {Chromobacterium violaceum NCTC 13274) или развитием биолюминесценции {Escherichia coli pAL103). При этом особенностью первого являлась инсерция транспозона Тn5 в ген cvil, ответственного за синтез собственного С 6 -ГСЛ, с сохранением функционально активного гена cviR и кодируемого им регуляторного белка, ответственного за восприятие автоиндуктора .
Quomm sensing and Chrornobacteriurn violaceum: exploitation of violacein production and inhibition for the detection of N-acyl homoserine lactones. Microbiology, 1997, V.143, P.3703-3711]. В свою очередь особенностью второго штамма являлось наличие генетической конструкции luxR+luxI_luxCDABE, кодирующей рецепторный белок LuxR Vibrio fischeri и в присутствии экзогенно вносимого С 6 -ГСЛ или С 6 -оксо-ГСЛ отвечающей развитием свечения (биолюминесценции) .
При проведении тестирования С. violaceum NCTC13274 и Escherichia coli pAL103 выращивались на жидких питательных средах в отсутствие (контроль) и в присутствии С 6 -ГСЛ или соединения формулы 1 (опыт), использованных в диапазоне концентраций от 2 до 1000 мкМ. Характеристикой регуляторного действия служила величина ЕС50 - концентрация сравниваемых соединений, вызывающая индукцию образования пигмента виолацеина или биолюминесценции на 50% от максимально выраженного эффекта в присутствии естественного сигнала. Результаты подобного тестирования иллюстрируются Фиг.1, а в обобщенном виде приведены в таблице 1.
Таблица 1. Оценка влияния соединения формулы 1 на коллективное поведение («чувство кворума») у бактерий в тестах на С. violaceum NCTC13274 и E.coli pAL103.
Из приведенных данных видно, что оба использованных микроорганизма интенсивно реагируют кворум-зависимым синтезом виолацеина (С. violaceum NCTC) или развитием биолюминесценции (Е. coli рAL103) в присутствии естественного авторегулятора С 6 -ГСЛ. В свою очередь тестируемое соединение формулы 1 действует менее активно, но более специфично, вызывая индукцию синтеза виолацеина, но не развитие биолюминесценции. При этом в основе подобных различий предположительно лежит избирательное сродство соединения 1 к воспринимающему регуляторный сигнал белку CviR при отсутствии такового к LuxR.
Положительным результатом подобного использования заявляемого изобретения является возможность избирательной индукции «чувства кворума» определенных видов бактерий, входящих в состав полимикробных ассоциаций.
Пример 2. Подавление коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий.
Определение способности соединения формулы 1 к регуляции «чувства кворума» проводилось с использованием штамма Jantinobacterium lividum, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под №В-10136. Данный штамм представляет собой природный изолят, характеризующийся способностью к синтезу пигмента виолацеина под контролем автоиндуктора неидентифицированной природы.
При проведении тестирования J. lividum В-10136 выращивался на жидких питательных средах в отсутствие (контроль) и в присутствии соединения формулы 1 (опыт), использованных в диапазоне концентраций от 2 до 1000 мкМ. Характеристикой регуляторного действия служила величина ЕС50 - концентрация соединения формулы 1, вызывающая подавление продукции виолацеина на 50% от максимально выраженного эффекта в контроле.
Результаты подобного тестирования иллюстрируются Фиг.2. Из приведенных данных следует, что тестируемое соединения формулы 1 подавляет продукцию виолацеина (ЕС50=87,5 мкМ), что характеризует его как ингибитор коллективного поведения («чувства кворума») J. lividum B-10136.
Положительным результатом подобного использования заявляемого изобретения является возможность подавления «чувства кворума» определенных видов бактерий, в частности J. lividum, для предупреждения вызываемой ими порчи сельскохозяйственной продукции. Та же активность может быть использована при лечении и профилактике инфекционных заболеваний растений, животных и человека, вызываемых J. lividum и другими виолацеин-продуцирующими микроорганизмами.
Применение производного тиазола формулы 1 в качестве регулятора (активатора или ингибитора) коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий:
Похожие патенты:
Изобретение относится к области органической химии, а именно к новым биологически активным веществам класса 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеноатов гетериламмония, а именно к 2-гидрокси-4-метилфенил-4-оксо-2-бутеноат тиазолиниламмония формулы (1).
Изобретение относится к области органической химии, к новым биологически активным веществам класса 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеноатов гетериламмония, а именно к 2-гидрокси-4-оксо-4-(4-хлорфенил)-2-бутеноату тиазолинаммония (1) формулы обладающему антикоагулянтной активностью, что позволяет предположить его использование в медицине в качестве антикоагулянтного средства.
Изобретение относится к новым производным 2-(имино-замещенных)тиазолидинов, способу их получения, фармацевтическим средствам, содержащим эти вещества, применения указанных производных 2-(имино-замещенных) тиазолидинов для лечения различных заболеваний, а также получения фармацевтических составов на их основе, применяемых для лечения.
Изобретение относится к способу получения новых биологически активных химических соединений, конкретно к способу получения новых производных иминотиазолидина или их гидрохлоридов, обладающих антидепрессивной, антиэпилептической, антипаркинсоновой и анальгетической активностью.
Изобретение относится к соединению, представленному формулой (I), где представляет собой α-конфигурацию; представляет собой β-конфигурацию; и представляет собой α-конфигурацию, β-конфигурацию или их произвольную смесь, его соль, или его смесь с диастереомером в произвольном соотношении, или его циклодекстриновый клатрат.
Изобретение относится к способу получения кристаллов А-формы 2-(3-циано-4-изобутилоксифенил)-4-метил-5-тиазолкарбоновой кислоты. Способ включает: стадию растворения при нагревании 2-(3-циано-4-изобутилоксифенил)-4-метил-5-тиазолкарбоновой кислоты в 1-пропаноле или 2-пропаноле, стадию охлаждения полученного раствора и стадию добавления к этому раствору гептана.
Изобретение относится к применению соединений общей формулы (I), обладающих свойствами ингибитора моноаминоксидаз (МАО), и/или липидного перокисления, и/или свойствами модуляторов натриевых каналов, а также к лекарственному средству на их основе, обладающему теми же свойствами, более конкретно соединения и лекарственное средство могут быть использованы для лечения болезни Паркинсона, старческого слабоумия, болезни Альцгеймера, хореи Гентингтона, бокового амиотрофического склероза, шизофрении, депрессий, психозов, боли и эпилепсии.
Изобретение относится к соединению, представленное формулой (I), в которой A1 обозначает бензол или гетероцикл, выбранный из группы, состоящей из пиридина, пиразина, имидазола, тиазола, пиримидина, тиофена, пиридазина, бензоксазина и оксобензоксазина; A2 обозначает бензол, в случае необходимости замещенный фтором, или тиофен; B1 обозначает водород, низший алкил, в случае необходимости замещенный пиперазинилом или морфолино, галогензамещенный низший алкил, низший алкокси, замещенный карбамоилом, ациламино, карбамоил или низший алкилкарбонилокси (при условии, что, когда A1 обозначает тиазол, B1 не обозначает ациламино); B2 обозначает водород или функциональную группу, содержащую по меньшей мере один атом азота, выбранную из группы, состоящей из ациламино, пирролидинила, морфолино, пиперидинила, в случае необходимости замещенного ацилом, пиперазинила, в случае необходимости замещенного низшим алкилом или ацилом, пиразолила, диазабициклогептила, в случае необходимости замещенного ацилом, и ди-(низший алкил)амино, в случае необходимости замещенного амино или ациламино (при условии, что, когда A1 обозначает тиазол, B2 не обозначает ациламино); Y обозначает группу, представленную формулой (II), в которой J обозначает этилен или низший алкинилен; L обозначает связь; M обозначает связь; X обозначает -(CH2)m-, -(CH2)m-O- или -(CH2)m-NR2- (где m означает целое число от 0 до 3, и R2 обозначает водород); D обозначает -NR3-, где R3 обозначает водород; и E обозначает амино, или его фармацевтически приемлемой соли.
Изобретение относится к соединениям формулы 1.0: где Q представляет собой тетрагидропиридинильное кольцо замещенное. R5, R1 выбирают из группы, состоящей из: (1) пиридила, замещенного заместителем, выбираемым из группы, состоящей из: -O-СН3, -O-C2H5, -O-СН(СН3)2, и -О-(СН2)2-O-СН3, R2 выбирают из группы, состоящей из: -ОСН3 и -SCH3; и R5 выбирают из группы, состоящей из: (a) замещенного триазолилфенила-, где триазолил замещен одной или двумя алкильными группами, выбранными из группы, состоящей из: -С1-С4алкила, (b) замещенного триазолилфенила-, где триазолил замещен на атоме азота -С1-С4алкилом, (c) замещенного триазолилфенила-, где триазолил замещен на атоме азота -С2алкилен-O-С1-С2алкилом, (d) замещенного триазолилфенила-, где триазолил замещен на атоме азота -С2-С4алкилен-O-СН3, и (e) замещенного триазолилфенила-, где триазолил замещен на атоме азота гидрокси-замещенным -С1-С4алкилом, и где фенил необязательно замещен от 1 до 3 заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из галогена; и их фармацевтически приемлемым солям и сольватам, которые заявлены в качестве ингибиторов ERK.
Изобретение относится к новому средству, представляющему собой производные роданина формулы (I), для лечения опухолевых заболеваний различной локализации. Технический результат - средство антипролиферативного и антиметастатического действия для лечения опухолевых заболеваний.
Предложены применение (R)-5--2-(-пропилимино)-3-орто-толилтиазолидин-4-она (Соединение 1) или его соли для получения лекарственного препарата для предупреждения и/или лечения болезни или расстройства, связанного с активацией иммунной системы, где лекарственный препарат представляет собой набор доз Соединения 1, причем в течение начальной фазы лечения доза индуцирует десенсибилизацию сердца и она ниже конечной дозы, и при указанной начальной фазе лечения доза вводится с частотой, которая обеспечивает поддерживание десенсибилизации сердца до тех пор, пока не произойдет следующее острое снижение частоты сердечных сокращений, а затем дозу титруют с повышением до конечной дозы Соединения 1; соответствующие способ лечения и набор доз.
Изобретение относится к соединению формулы I или его терапевтически приемлемым солям, где А1 представляет собой фурил, имидазолил, изотиазолил, изоксазолил, пиразолил, пирролил, тиазолил, тиадиазолил, тиенил, триазолил, пиперидинил, морфолинил, дигидро-1,3,4-тиадиазол-2-ил, бензотиен-2-ил, бензотиазол-2-ил, тетрагидротиен-3-ил, триазолопиримидин-2-ил или имидазо-тиазол-5-ил; где А1 незамещен или замещен одним, или двумя, или тремя, или четырьмя или пятью заместителями, независимо выбранными из R1, OR1, C(O)OR1, NHR1, N(R1)2, C(N)C(O)R1, C(O)NHR1, NHC(O)R1, NR1C(O)R1, (O), NO2, F, Cl, Br и CF3; R1 представляет собой R2, R3, R4 или R5; R2 представляет собой фенил; R3 представляет собой пиразолил или изоксазолил; R4 представляет собой пиперидинил; R5 представляет собой C1-C10алкил или C2-C10алкенил, каждый из которых не замещен или замещен заместителями, выбранными из R7, SR7, N(R7)2, NHC(O)R7, F и Cl; R7 представляет собой R8, R9, R10 или R11; R8 представляет собой фенил; R9 представляет собой оксадиазолил; R10 представляет собой морфолинил, пирролидинил или тетрагидропиранил; R11 представляет собой C1-C10алкил; Z1 представляет собой фенилен; Z2 представляет собой пиперидин, не замещенный или замещенный OCH3, или пиперазин; Z1A и Z2A оба отсутствуют; L1 представляет собой C1-C10алкил или C2-C10алкенил, каждый из которых не замещен или замещен R37B; R37B представляет собой фенил; Z3 представляет собой R38 или R40; R38 представляет собой фенил; R40 представляет собой циклогексил или циклогексенил; где фенилен, представленный Z1 не замещен или замещен группой OR41; R41 представляет собой R42 или R43; R42 представляет собой фенил, который не конденсирован или конденсирован с пирролилом, имидазолилом или пиразолом; R43 представляет собой пиридинил, который не конденсирован или конденсирован с пирролилом; где каждый вышеуказанный циклический фрагмент, представленный R2, R3, R4, R8, R9, R10, R38, R40, R42 и R43, независимо не замещен или замещен одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из R57, OR57, С(О)OR57, F, Cl CF3 и Br; R57 представляет собой R58 или R61; R58 представляет собой фенил; R61 представляет собой C1-C10алкил; и где фенил, представленный группой R58, не замещен или замещен одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из F и Cl. Также изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей указанные соединения, и к способу лечения заболеваний, при которых экспрессируются антиапоптотические белки Bcl-2. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 48 пр.
Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии и фармацевтики, а именно к малым регуляторным молекулам, способным направленно изменять плотностно-зависимую коммуникацию и регулируемое ей коллективное поведение у бактерий. В частности, изобретение относится к применению производного тиазола формулы 1 в качестве регулятора коллективного поведения у бактерий. Технический результат - производное тиазола, предназначенное для регуляции опосредуемого гомосеринлактонами «чувства кворума» у виолацеин-продуцирующих биотехнологически полезных, гнилостных и патогенных бактерий. 2 ил., 1 табл., 2 пр.
|
Многие живые организмы принимают коллективные решения демократическим путем при помощи так называемого «чувства кворума». Часто это проявляется в том, что при увеличении скученности совокупность особей превращается в организованный коллектив (сообщество, стаю, толпу). Базовые принципы такого превращения сходны у разных организмов - от бактерий до животных. Об этом свидетельствуют результаты двух новых исследований, одно из которых выполнено на светящихся бактериях, другое - на атлантической сельди. Бактерии начинают дружно светиться по достижении пороговой концентрации выделяемых ими веществ, а у рыб сигналом к формированию многомиллионных организованных стай служит время суток и пороговая плотность популяции.
«Чувство кворума» (Quorum sensing ) - широко распространенный в природе механизм, позволяющий группам организмов выполнять координированные, слаженные действия - подобно тому, как это постоянно делают клетки многоклеточного организма. Однако в многоклеточном организме слаженность поведения клеток обеспечивается специальными системами централизованного управления (например, нервной системой). В группе отдельных самостоятельных организмов таких централизованных систем управления обычно нет, поэтому согласованность действий обеспечивается иными способами, в том числе при помощи «чувства кворума».
Это явление лучше всего изучено на одноклеточных организмах, у которых согласованное групповое поведение, как правило, основано на своеобразном химическом «голосовании». Например, все бактерии в популяции выделяют сигнальное вещество, и когда концентрация этого вещества в окружающей среде достигает некого порогового значения, все клетки дружно меняют свое поведение (например, начинают испытывать «тягу» друг к другу и собираться в большие скопления). На молекулярном уровне изменение поведения микробов обеспечивается резким (иногда скачкообразным) изменением уровня активности определенных генов в ответ на пороговый уровень возбуждения рецепторов, реагирующих на сигнальное вещество. Одним из первых объектов, на которых стали изучать чувство кворума, была светящаяся бактерия Vibrio fischeri , о которой рассказано в заметке Симбиоз кальмаров со светящимися бактериями зависит от единственного гена , «Элементы», 06.02.2009.
Ключевым сигналом, запускающим механизм превращения множества разрозненных индивидуумов в единую сплоченную общность, обычно является скученность. Например, Vibrio fischeri не светится, пока плотность популяции микробов остается низкой. Однако по достижении определенного порога плотности (что происходит, например, в светящемся органе кальмара, где бактериям обеспечены идеальные условия для жизни) все микробы разом начинают светиться, и кальмар получает фонарик для охоты в темноте.
У многоклеточных организмов «чувство кворума» и быстрые согласованные изменения поведения тоже широко распространены, хотя и хуже изучены, чем у одноклеточных. Иногда переход от индивидуальной жизни к согласованному групповому поведению может иметь поистине драматические последствия, как, например, у саранчи (см.: Серотонин за два часа превращает скромную пустынную саранчу в хищных налетчиков , «Элементы», 10.02.2009). Характерно, что у саранчи переход к стадному поведению регулируется плотностью популяции (скученностью), точно так же, как и свечение Vibrio fischeri .
На прошлой неделе опубликованы две интересные статьи, посвященные изучению чувства кворума у двух весьма непохожих друг на друга организмов - светящихся бактерий Vibrio harveyi (близких родственников V. fischeri ) и у атлантической сельди. Обе работы основаны на применении новых методов, причем в обоих случаях речь идет о радикальном изменении масштабов рассмотрения изучаемых объектов. В случае с микробами масштаб был изменен в сторону большей детальности: обычно изучают совокупную реакцию больших популяций микробов (например, суммарную силу свечения), однако в данном случае исследователи регистрировали изменения в поведении отдельных микробов. При изучении очень крупных объектов, таких как многомиллионные стаи сельди, обычно приходится ограничиваться небольшими выборками, по которым трудно судить о стае в целом. Однако на этот раз исследователи воспользовались изобретенным три года назад методом высокочувствительного эхолокационного сканирования больших акваторий (Makris et al., 2006 ), который позволил наблюдать за формированием стай протяженностью в десятки километров в реальном времени.
За поведением сельди наблюдали в районе ее нереста в заливе Мэн осенью 2006 года. Оказалось, что в течение нерестового периода сельдь каждый вечер самоорганизуется в громадные скопления численностью до четверти миллиарда особей, которые согласованно и дружно плывут на мелководье, где сельдь нерестится.
В течение дня рыбы плавают порознь вблизи дна в глубоких местах, где хищников гораздо меньше, чем на мелководье. Незадолго до захода солнца сельдь начинает постепенно скапливаться на глубине от 160 до 190 м. Поначалу плотность рыб растет медленно. Однако в тот момент, когда плотность достигает порогового значения 0,2 рыбы на квадратный метр, поведение рыб радикально меняется. Рыбы вдруг устремляются навстречу друг другу и образуют плотное скопление (до 2–5 рыб на кв. м), которое становится своеобразным «центром кристаллизации» для гигантской стаи. От этого первичного скопления стремительно распространяется «волна» измененного поведения: рыбы видят, что их сородичи уже поспешили на сбор, и сами начинают плыть друг к другу.
В результате скопление рыб разрастается со скоростью, на порядок превышающей ту скорость, с которой может плыть отдельная рыба. Наконец образуется плотная стая длиной до 20–30 км и шириной порядка 3–4 км, вытянувшаяся с запада на восток на глубине 160–190 м вдоль северного склона нерестовой отмели. Затем вся эта громадная масса рыб начинает согласованное движение на юг и вверх, к месту нереста. Теперь движение происходит как раз с той скоростью, с какой обычно плавает сельдь. Передний край движущейся стаи ровный и четкий, задний - неровный и размытый из-за «отстающих», которые продолжают подтягиваться из глубины. Нерестится сельдь ночью на глубине около 50 м, а к рассвету стая рассеивается до следующего вечера.
В чем смысл такого поведения? Во-первых, нерест у сельди - дело коллективное, самки должны дружно выметать икру, а самцы - совместными усилиями оплодотворить ее, поэтому синхронизация поведения этим рыбам очень важна. Во-вторых, большинство хищников предпочитает ловить сельдь на мелководье, поэтому рыбам выгодно прибывать на место нереста большими группами (см.: Общественный образ жизни повышает стабильность системы «хищник–жертва» , «Элементы», 29.10.2007), как можно быстрее делать свое дело и возвращаться на относительно безопасную глубину.
Исследование показало, что у сельди, как и у других организмов, обладающих «чувством кворума», внезапное изменение поведения и превращение неорганизованного множества особей в упорядоченное целое происходит в ответ на достижение пороговой концентрации особей (в данном случае пороговая плотность составляет 0,2 особи на кв. м.). На какие сигналы - зрительные или, скажем, обонятельные - ориентируется сельдь, оценивая плотность популяции, пока неизвестно, и выяснить это очень трудно.
Намного проще разобраться в физиологических механизмах «чувства кворума» у бактерий, у которых нет ни зрения, ни слуха, ни нервной системы и которым поэтому доступен только один способ общения - химический, аналогичный запаховой коммуникации у животных.
Однако молекулярно-генетические системы, обеспечивающие «чувство кворума» у бактерий, могут быть очень сложными, что хорошо видно на примере светящегося микроба Vibrio harveyi. Эти бактерии выделяют в окружающую среду три сигнальных вещества-«автоиндуктора» (autoinducers, AI). Каждому веществу соответствует рецептор, реагирующий на наличие «своего» вещества в среде. Все три рецептора передают полученный сигнал внутрь клетки, активируя регуляторный белок LuxU. Он, в свою очередь, активирует другой белок (LuxO), который активирует работу нескольких генов, кодирующих малые регуляторные РНК. Эти регуляторные РНК блокируют работу гена, кодирующего белок LuxR. Последний является ключевым участником регуляторного каскада: от него зависит активность множества генов, в том числе и тех, благодаря которым бактерия светится.
Разумеется, эта непростая система нужна не только для регуляции свечения. От нее зависит множество других аспектов поведения бактерии, просто свечение легче всего регистрировать и измерять. В этой регуляторной системе уже известны многие детали, но кое-что остается загадочным. Например, непонятно, зачем нужны целых три разных сигнальных вещества и три рецептора для них, если всё в конечном итоге сводится к одному и тому же результату: либо ген LuxR оказывается включен, и тогда микробы светятся, либо он выключен, и тогда бактерии гаснут. И дело принципиально не меняется от того, что LuxR регулирует множество разных генов, а не только «гены свечения». Всё равно работа всех подконтрольных систем зависит только от одной переменной: от степени активности гена LuxR . Казалось бы, бактерии вполне могут обойтись одним сигнальным веществом и одним рецептором, то есть одной переменной «на входе», чтобы регулировать одну-единственную переменную «на выходе». Однако бактерии почему-то считают иначе и общаются между собой при помощи трех разных сигнальных веществ.
Чтобы разобраться в этой непростой проблеме, исследователи сконструировали несколько генно-модифицированных штаммов Vibrio harveyi, у которых система химической коммуникации была существенно упрощена. Во-первых, всем бактериям удалили ген, кодирующий один из трех рецепторов. Теперь микробы могли реагировать только на два из трех сигнальных веществ (AI-1 и AI-2). Во-вторых, были отключены гены, необходимые для производства сигнальных веществ. Это было сделано для того, чтобы исследователи могли держать концентрацию веществ AI-1 и AI-2 под своим полным контролем. В-третьих, они прикрепили к регуляторному участку (промотору) одной из малых регуляторных РНК, участвующих в регуляторном каскаде, ген зеленого флуоресцирующего белка. Это дало им возможность по силе флуоресценции отдельных бактериальных клеток судить о степени активации регуляторного каскада «чувства кворума» с гораздо большей точностью и детальностью, чем это можно было бы сделать по силе естественного свечения бактерий.
Оказалось, что оба сигнальных вещества (AI-1 и AI-2) действуют на систему практически одинаково, причем система может находиться в одном из трех устойчивых состояний:
1) Если концентрация обоих веществ низкая, бактерии активно производят зеленый флуоресцирующий белок. Это значит, что синтез белка LuxR приостановлен, и, следовательно, все гены, которые блокируются белком LuxR, работают активно, а все гены, которые этим белком активируются, отключены (в том числе и гены, отвечающие за естественное свечение).
2) Если концентрация любого из двух веществ - AI-1 или AI-2 - поднимается до порогового значения (которое соответствует примерно одной молекуле вещества на объем, занимаемый одной бактерией), то зеленая флуоресценция заметно слабеет, но не прекращается совсем. Это «промежуточное» состояние довольно стабильно. Уровень флуоресценции остается почти неизменным в широком диапазоне концентраций сигнальных веществ - лишь бы концентрация одного из веществ была больше, а второго - меньше порогового уровня.
3) Наконец, если концентрация обоих сигнальных веществ превышает пороговый уровень, зеленый флуоресцирующий белок практически перестает синтезироваться. Это означает, что регуляторный каскад полностью активирован. Только в этом случае включается естественное свечение.
Иными словами, оказалось, что использование двух сигнальных веществ позволило бактериям создать молекулярный «переключатель», способный принимать не два, а три устойчивых состояния. Каждому из этих трех состояний, по-видимому, соответствуют свои наборы включенных и выключенных генов, то есть своя «манера поведения» микробов.
Авторы предполагают, что на самом деле у этого переключателя может быть даже не три, а четыре устойчивых состояния - ведь существует еще и третье сигнальное вещество, которое в экспериментах не учитывалось.
По мнению авторов, такая замысловатая система химической коммуникации позволяет бактериям регулировать свое поведение в зависимости от фазы развития микробного сообщества (биопленки; см. Biofilm ). Теоретически, концентрации сигнальных веществ - равно как и поведение бактерий - могут закономерным образом меняться в ходе развития колоний Vibrio harveyi , и в настоящее время авторы заняты поиском доказательств этого предположения.
«Чувство кворума» у сельдей и у светящихся бактерий вызывает синхронизацию поведения, заставляя всех индивидуумов вести себя одинаково. Однако известны и случаи «бимодальной» реакции популяции на коллективные сигналы. Это означает, что один и тот же сигнал вызывает у разных особей одну из двух альтернативных реакций, причем выбор того или иного варианта может определяться даже не генотипом особи, а простой случайностью. Тем самым достигается разнообразие фенотипов (поведения), независимое от разнообразия генотипов. Обычно при бимодальной реакции устойчивость каждого из двух альтернативных состояний организма обеспечивается за счет положительных обратных связей. Пример такого поведения рассмотрен в заметке Бактерии-альтруисты помогают своим сородичам-каннибалам себя съесть («Элементы», 27.02.2006).
Существует ли «чувство кворума» у людей? По-видимому, ответ на этот вопрос следует искать в научной литературе по так называемой «психологии толпы» (см., например: А. П. Назаретян. Толпа и закономерности ее поведения ).
