Выполнила студентка группы БМИ-107 Бубякина О.В.

Диагностические биочипы

Введение

Биологические микрочипы являются одним из наиболее быстро развивающихся экспериментальных направлений современной биологии. Существует два основных типа биочипов. Первый тип- это микроматрицы различных соединений, главным образом биополимеров, иммобилизованных на поверхности стекла, в микрокаплях геля, в микрокапиллярах. Другим типом биочипов являются миниатюризованные "микролаборатории". Эффективность биочипов обусловлена возможностью параллельного проведения огромного количества специфических реакций и взаимодействий молекул биополимеров, таких как ДНК, белки, полисахариды, друг с другом и низкомолекулярными лигандами. Удается в достаточно простых параллельных экспериментах собрать и обработать на отдельных элементах биочипа огромное количество биологической информации. В этом заключается фундаментальное информационное сходство биочипов с электронными микрочипами. Однако между ними имеется и ряд принципиальных различий.

Что такое биочип?

Биологические микрочипы — это совокупность ячеек, расположенных на поверхности стекла или пластика, своего рода миниатюрный аналог сразу нескольких сотен, а то и тысяч реакционных пробирок.

Технологии изготовления чипов могут быть разными.

ИСТОРИЯ
"РУССКОГО БИОЧИПА"

Не верилось, что миниатюрное устройство, закрепленное на предметном стекле (таком, на которое обычно помещают препарат для рассмотрения под микроскопом), может заменить собой целую диагностическую лабораторию. Но это действительно так!. Подобно электронным чипам, биочипы обрабатывают большой массив информации методом параллельного анализа. Проще говоря, в одно и то же время на одном чипе проходит множество - до нескольких сотен - всевозможных анализов. Еще более удивительна история происхождения биочипа, который продукт сугубо отечественный, не случайно за рубежом его до сих пор называют "русский биочип". Началось же все в конце 80-х годов прошлого века, когда команда ученых из Института молекулярной биологии РАН (ИМБ) под руководством академика Андрея Мирзабекова, в 2003 году, взялась за изготовление универсального миниатюрного анализатора. Идея, конечно, уже витала в воздухе. Но только специалистам удалось воплотить эту идею в жизнь.

Как рассказывал Андрей Мирзабеков, в то время весь мир был увлечен процессом расшифровки генома человека, и они с коллегами предложили использовать для этих целей биочипы. Но очень скоро поняли, что новые устройства могут пригодиться для решения самых разных практических задач, поэтому поспешили сделать следующий шаг - разработать технологию. И преуспели в этом! Биочипы начали свое победное шествие по миру. В середине 90-х, когда финансирование российской науки практически полностью прекратилось, академика Мирзабекова пригласили в Аргонскую национальную лабораторию США. Он заявил, что будет работать в Чикаго, только если там создадут совместную исследовательскую группу, в которую войдут как американские, так и российские специалисты. Именно так российским молекулярным биологам удалось пережить "веселые 90-е", самые тяжелые для отечественной науки. За время работы в США они получили больше 10 патентов. На заработанные деньги закупили оборудование и создали комплексную лабораторию в ИМБ.

"Русский биочип", как его называли за рубежом, получил признание. Право на использование технологии купили компании Motorola и НР, а затем зарегистрировали свой патент на модифицированную технологию. В ответ на это ученые из ИМБ разработали и запатентовали более совершенную технологию.

АТАКА НА ТУБЕРКУЛЕЗ

Первым объектом для апробации нового метода стал туберкулез. Ежегодно в мире им заражаются около 30 млн человек, порядка 2 млн от него умирают. Особенно тяжелая ситуация по туберкулезу сложилась в России, где в 90-е годы из-за многочисленных социальных проблем возбудители туберкулеза - микобактерии, или, как их еще называют, палочки Коха, мутировали, став невосприимчивыми к традиционным препаратам. На сегодняшний день известно около 40 мутантных штаммов. При традиционном подходе после выявления у пациента туберкулеза рентгенологическими методами его лечат препаратами так называемого первого ряда, к которым относятся рифампицин и изониазид. Параллельно проводят микробиологическое исследование возбудителя, чтобы установить его чувствительность к этим лекарствам. Это занимает от двух до трех месяцев. А когда выясняется, что эти лекарства на данную форму микобактерии не действуют, больной уже в течение нескольких месяцев принимал ненужные и, более того, вредные препараты, успев передать лекарственно-устойчивую форму туберкулеза всем, с кем контактировал. Конечно, в запасе у медиков остаются препараты "второго ряда", но и с ними может произойти та же история. Поэтому быстрая и точная диагностика туберкулеза очень и очень важна. Если использовать биочипы, диагноз можно поставить менее чем за сутки. Из пробы больного выделяют ДНК и проводят полимеразно-цепную реакцию (ПЦР), чтобы многократно размножить участок ДНК, на котором могут встречаться мутировавшие гены устойчивости к антибиотикам. Последующий анализ на биочипе поможет определить, каким именно из десятков мутантных штаммов туберкулеза заражен пациент. Но эти волшебные биочипы надо было еще создать. В 2004 году труды ученых из ИМБ увенчались успехом - диагностика с использованием биочипов была сертифицирована. Сегодня выпускается два вида устройств: для выявления чувствительности микобактерий к препаратам первого и второго ряда

НА ВСЕ РУКИ МАСТЕР

Выпускаются биочипы для самых разных целей. Для выявления возбудителей гриппа А, в том числе птичьего гриппа, герпеса, гепатита В и С, разнообразных инфекций у беременных женщин и новорожденных, для определения предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям. А есть и такие, которые могут сослужить службу криминалистам, поскольку определяют пол и группу крови. Ученые работают над биочипами для обнаружения стафилококкового, холерного, дифтерийного, столбнячного токсинов, возбудителей сибирской язвы и чумы, разновидностей вируса оспы.

ЛАБОРАТОРИЯ РАЗМЕРОМ С ПОЧТОВУЮ МАРКУ

Биочип устроен следующим образом. На матрице-подложке расположено множество ячеек с гидрогелем (диаметром около 100 микрон, так что на одном квадратном сантиметре могут разместиться до тысячи ячеек). В ячейках содержатся молекулы-зонды: в зависимости от назначения биочипа это могут быть фрагменты ДНК, РНК или белки. Каждая ячейка - это аналог микропробирки, в которой происходит реакция между молекулами-зондами и молекулами исследуемой пробы. Если эти молекулы подходят друг к другу как ключ к замку, происходит так называемая гибридизация - молекулы соединяются химическими связями. Ячейка, в которой произошла реакция, флуоресцирует (потому что пробу предварительно обрабатывают светящейся меткой). В специальном приборе-анализаторе под названием "чип-детектор" конфигурация светящихся точек покажет, какие мутации есть в клетках пациента, обнаружит бактерии и вирусы, выявит генетические формы микроорганизмов - возбудителей болезни.

1.Забор анализируемогообразца.
2 Обработка образца.
3 Взаимодействие образца
с иммобилизованными зондами биологического микрочипа.
4 Анализ биочипа после взаимодействия. Картина распределения свечения ячеек микрочипа является индивидуальной характеристикой анализируемого образца.
Управляющая программа контролирует эксперимент и обрабатывает данные в реальном масштабе времени и отображает их на экране монитора.

Корреспондент телеканала «МИР 24» Ольга Климкина рассказывает о новейшей российской медицинской разработке. Речь идет о специальном биочипе, который позволит диагностировать рак за рекордно короткое время. Систему должен одобрить Росздрав, после этого тогда начнутся клинические испытания.

Российские ученые разработали специальный биочип, который позволит диагностировать рак за рекордно короткое время. Систему должен ободрить Росздрав, после этого тогда начнутся клинические испытания. Новый метод оценила корреспондент телеканала «МИР 24» Ольга Климкина.
Два года исследований, проб и ошибок. Результат — в лаборатории онкоцентра имени Блохина. Вот так выглядит биочип, и вот так выглядит транспортно-питательная среда. К ним подводят специальный сканер. Все вместе единый комплекс, который может помочь победить рак. Для Марины Савостиковой, одного из авторов разработки, это борьба не только профессиональная, но и личная. Сама дважды пережила страшное заболевание. Она знает: исход зависит от вовремя поставленного диагноза.

«Можем сказать: боже мой, у вас аденомокарценома. И у вас аденомокарценома легкого. Или, допустим, коллега, вам надо исключать колоректальный рак», — пояснила к.м.н., заведующая лабораторией ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина Марина Савостикова.

Над тем, чтобы с такой легкостью определять диагноз, трудились ученые в Москве в онкоцентре имени Блохина и Институте микробиологии и эпидемиологии и в Нижнем Новгороде в Медицинской академии. В итоге создали биочип — пластину с 15 ячейками. В каждой находятся разные антитела. Они реагирует на определенный вид рака в клетках. Плюс специальные красители, которые показывают реакцию.

«В данный момент у нас плевральная жидкость от женщины 1929 года рождения и от другой женщины с карценомой яичников. Мы будем проводить их исследование на биочипах», — указывает врач.
Для постановки диагноза требуется не кровь, а выпотная жидкость, которая скапливается в больном организме. Из нее берут образцы, перемешивают, помещают в центрифугу и отбирают осадок.

«Вартексируем, перемешиваем, чтобы клеточная взвесь, которую мы наносим на биочип, имела равномерное распределение во всех ячейках», — отметила научный сотрудник ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина Елена Фурминская.
После нагреть его до 37 градусов и на суд врача под флюоресцентный микроскоп. На экране красные и зеленые пятна. Для специалиста рак выглядит именно так.

Не так страшен рак, как его малюют

«Это комплекс рака серозного яичников. Вот единичные клетки, нам их надо было подтвердить, и мы их подтвердили», — указала Марина Савостикова.
Пока это не официальный диагноз, а только результат исследований. Разработчики ждут одобрения Росздравнадзора и планируют начать клинические испытания уже в апреле. После этого биочипы могут появиться в любой российской поликлинике.

Ежегодно в России от рака умирает более 300 тысяч человек. Получается, что каждый день в стране погибает почти тысяча больных. Если у пациента выявили первую стадию, с вероятностью в 93% он выживет, пишет Российский онкологический портал.

Российские ученые из МФТИ и еще нескольких академических институтов создали чип, который позволяет с высокой точностью определять один из самых распространенных раков - колоректальный (так называют злокачественные опухоли толстой и прямой кишки).

ЧТО АМЕРИКАНЦАМ ЗАПРОСТО...

Крайне важно, что новый тест очень прост, кровь для него берут из вены точно так же, как для обычного так называемого биохимического анализа. Поэтому он будет хорошо подходить для скрининга - быстрого и простого отбора пациентов даже с ранними формами рака. Сейчас в мире для этого рекомендуют колоноскопию, которую после 50 лет нужно проводить не реже одного раза в десятилетие. Это совсем непростая и не очень приятная процедура, при которой гибкий эндоскоп вводят через прямую кишку в толстый кишечник. В США это профилактическое исследование для людей старше пятидесяти поставлено на поток. Каждый эпизодически получает по почте приглашение на такую диагностическую процедуру.

У нас такое исследование проводят по показаниям, когда есть симптомы какого-либо заболевания толстого кишечника. Если же кто-то хочет просто провести такое профилактическое исследование, как это делают в США, чтобы не проморгать болезнь, это можно сделать на платной основе в индивидуальном порядке. Может быть, всем поголовно его и не стоит делать, но тем, у кого есть факторы риска развития колоректального рака, это исследование лишним не будет.

Почему ранняя диагностика рака толстой и прямой кишки так важна? Во-первых, это заболевание одно из самых распространенных - в развитых странах эта злокачественная опухоль стоит на 3-м месте среди всех видов рака. Во-вторых, болезнь весьма тяжелая и тяжело лечится. Несмотря на большие достижения в ее лечении, результаты далеко не самые лучшие: пятилетнее выживание после хорошей терапии бывает примерно у 60-65% пациентов. И в-третьих, если опухоль выловить на ранних стадиях, то результаты будут гораздо лучшими. Для этого и нужен скрининг. И лучше простой и не очень затруднительный, как колоноскопия.

НАУКА - ПРАКТИКЕ

Над поиском такой методики трудится немало ученых в мире. Например, в США недавно появился метод диагностики по сложному анализу стула. Но наши ученые предложили еще более удачное решение. Про-цедура исследования сведена к забору крови из вены, как это делают при биохимическом анализе крови. Российский биочип построен на совсем иных принципах, чем американский набор для диагностики. Хорошо известно, что в крови есть маркеры, которые могут свидетельствовать о наличии опухоли. Они тем или иным образом связаны с обменом веществ в злокачественных клетках и с ответом организма на опухоль. И таких маркеров много. Беда в том, что они весьма капризны: могут быть не только при колоректальном раке, но и при других опухолях и даже при иных состояниях. То есть их специфичность для данного вида рака не всегда достаточна для уверенной постановки диагноза. Наши ученые нашли выход из этой проблемы: они сделали комбинированный чип, который определяет сразу не один маркер, а много. Благодаря этому точность диагностики повысилась многократно.

Не будем приводить названия маркеров, которые определяются при использовании чипа. Для нас гораздо важнее чувствительность предложенного теста - она составляет 88%. То есть он определяет наличие опухоли у 88% больных из 100. Это очень хороший показатель.

Отчет об исследовании отечественного чипа опубликован на днях во влиятельном международном журнале Cancer Medicine, и есть все основания полагать, что скоро такая полезная диагностическая система поступит в практическое здравоохранение. И самое главное, по этому же принципу можно разработать диагностические чипы и для других видов рака.

Материал подготовил Олег Днепров

Фото THESTAR.COM

ФАКТОРЫ РИСКА КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА:

• наличие таких болезней, как дивертикулы толстой кишки и неспецифический язвенный колит (болезнь Крона);
• возраст старше 50 лет;
• наличие этой опухоли у кровных родственников;
• большое содержание жиров и мяса в питании;
• пристрастие к алкоголю;
• курение;
• сахарный диабет, ожирение, низкая физическая активность.

Биологический микрочип, биочип (biochip, греч. bio(s) - жизнь и logos - понятие, учение; греч. mikros - маленький и англ. chip - осколок) - пластинка-носитель, на которой в определенном порядке расположены многочисленные ячейки (до несколько десятков тыс.) с различными иммобилизованными в них одноцепочечными олигонуклеотидами или олигопептидами, каждый из которых способен избирательно связывать определенное вещество, содержащееся в сложной смеси в анализируемом растворе. Биочип используется для молекулярно-генетических исследований, диагностики различных заболеваний человека, экспресс-диагностики высокопатогенных вирусов, а также в ветеринарии, сельском хозяйстве, криминалистике, токсикологии, охране окружающей среды. Первая работа по биочипам в современном формате (с фрагментами ДНК) была опубликована А. Д. Мирзабековым с сотр. в 1989 г.

Биологические микрочипы (biochips), или, как их чаще называют, DNA microarrays, - это один из новейших инструментов биологии и медицины XXI в. В настоящее время они активно производятся несколькими биотехнологическими фирмами. Биочипную технику можно с успехом применять как для исследовательских целей, так и для диагностики в медицинских учреждениях.

С помощью микрочипов можно проводить одновременный анализ работы тысяч и десятков тысяч генов, сравнивать их экспрессию. Такие исследования помогают создавать новые лекарственные препараты, выяснять, на какие гены и каким образом эти новые лекарства действуют. Биочипы являются также незаменимым инструментом для биологических исследований, за один эксперимент можно увидеть влияние различных факторов (лекарств, белков, питания) на работу десятков тысяч генов.

Биочипы позволяют очень быстро определять наличие вирусных и бактериальных возбудителей. Важное медицинское применение биочипов - это диагностика лейкозов и других вирусных заболеваний. Биочипы позволяют быстро, за считанные дни или даже часы различать внешне неразличимые виды лейкозов. Биочипы применяются для диагностики различных видов раковых опухолей .

Прообразом современных "живых чипов" послужил саузерн-блоттинг , изготовленный в 1975г. Эдом Саузерном. Он использовал меченую нуклеиновую кислоту для определения специфической последовательности среди фрагментов ДНК, зафиксированных на твердой подложке. В России ученые начали активно разрабатывать биочипы в конце 1980-х годов в Институте молекулярной биологии РАН под руководством А.Д.Мирзабекова.

Точнее всего биочипы описывает английское название DNA-microarrays, т.е. это организованное размещение молекул ДНК на специальном носителе. Профессионалы называют этот носитель платформой. Платформа - это чаще всего пластинка из стекла (иногда используют и другие материалы, например кремний), на которую наносятся биологические макромолекулы (ДНК, белки, ферменты), способные избирательно связывать вещества, содержащиеся в анализируемом растворе.

В зависимости от того, какие макромолекулы используются, выделяют различные виды биочипов, ориентированные на разные цели. Основная доля производимых в настоящее время биочипов приходится на ДНК-чипы (94%), т.е. матрицы, несущие молекулы ДНК. Оставшиеся 6% составляют белковые чипы.

Организованное размещение макромолекул занимает на платформе очень небольшой участок размером от почтовой марки до визитной карточки. Микроскопический размер биочипа позволяет размещать на небольшой площади огромное количество разных молекул ДНК и считывать с этой площади информацию с помощью флюоресцентного микроскопа или специального лазерного устройства для чтения ( рис. 2.50).

Характерные размеры ячеек современных микрочипов лежат в пределах 50-200 мкм, общее число ячеек на чипе составляет 1000-100000, а линейные размеры чипа - порядка 1 см. В поверхностных матричных биочипах ДНК иммобилизуется на поверхности мембран или пластинок из стекла, пластика, полупроводника или металла. В гелевых биочипах ДНК иммобилизуется в слое полиакриламидного геля толщиной 10-20 мкм, нанесенного на специально обработанную поверхность стекла. Также чипы могут наращиваться прямо из стеклянной пластинки методом фотолитографии с использованием специальных микромасок. Иммобилизуемая ДНК наносится на поверхность или через игольчатые растры (пины) механического робота, или с помощью технологии струйного принтера. Контроль качества нанесения осуществляется с помощью специализированной оптики и компьютерного анализа изображения. На биочипе в дальнейшем гибридизуют молекулы ДНК, меченные красителем.

Гибридизуемая ДНК в растворе метится с помощью флюоресцентной или радиоактивной метки. В случае смеси молекул ДНК (например, ДНК дикого типа и ДНК с мутациями) каждая метится своим флюоресцентным красителем. Свойства красителя не должны сильно зависеть от состава (A/Т или G/C) ДНК и температуры. Интенсивность флюоресценции в ячейках измеряют с помощью сканера или люминесцентного микроскопа, передающего сигнал на прибор с зарядовой связью. Однако флюоресценция является основным, но не единственным методом изучения гибридизации. В частности, данные о характере гибридизации можно получить также с помощью масс-спектрометрии, атомной силовой микроскопии и др.

В основе принципа работы всех типов биочипов с иммобилизованной ДНК лежит точное соответствие между комплементарными ДНК по правилу Уотсона-Крика: A-Т, G-С. Если соответствие между нуклеотидами иммобилизованной и гибридизуемой ДНК точно удовлетворяет условиям комплементарности, то образующиеся дуплексы будут термодинамически наиболее устойчивы. В результате при конечных температурах их будет больше, чем несовершенных дуплексов с нарушением условий комплементарности, и, соответственно, совершенным дуплексам будет отвечать более сильный сигнал флюоресценции. В выявлении и сопоставлении наиболее ярко светящихся ячеек и заключается работа прибора - анализатора биочипов.

Гибридизуемая ДНК обычно заранее нарабатывается в достаточных количествах с помощью ПЦР. В более продвинутых технологиях ПЦР осуществляется непосредственно на чипе. Кроме того, непосредственно на чипе можно осуществлять фрагментацию, фосфорилирование, лигирование ДНК или мини-секвенирование, при котором длина дуплекса увеличивается на одну пару оснований. Последнюю технику можно эффективно использовать для поиска мутаций.

На Западе и в России сейчас сформировалось два разных направления и два разных стандарта по созданию и применению биочипов. Российские биочипы дешевле, а западные - объемнее. При этом в России биочипами занимаются пока преимущественно исследовательские лаборатории, а на Западе - это, в первую очередь, военные исследования и коммерческое производство чипов для диагностики.