Н. Пулетти

Изготовление мазков крови технически простое и быстрое. Для получения максимальной информации оценку клеток крови необходимо систематизировать.

Подготовка и окраска мазков крови

При заборе материала у идеально спокойного животного со средним диаметром уширения вены кровь должна быстро поступать в пробирку, содержащую антикоагулянт. Чаще всего используется ЭДТА (этилендиаминтетраацетат), потому что этот антикоагулянт позволяет лучше сохранить исследуемые форменные элементы крови. Однако для упреждения разного рода морфологической деградации клеток промежуток времени между взятием свежей и хорошо гомогенизированной крови и изготовлением препарата должен быть максимально коротким (J.W. Harvey, 2001; D. Walker, 2008).

Классическая окраска отличается от быстрой. В последние время такие методы быстрой окраски, как Diff-Quick ® , имеют преимущества, поскольку они устойчивы к вариациям рН растворов и образованию депо окрашивающего вещества. Тем не менее они менее эффективны для выявления полихроматофилов и плохо окрашивают гранулы базофилов и мастоцитов (J.W. Harvey, 2001; D. Walker, 2008). Чтобы получить специфическую визуальную картину ретикулоцитов, необходимо провести окраску с новым метиленовым синим (NBM). В пластиковой пробирке каплю крови перемешивают с двумя каплями NBM. Пробирку оставляют при комнатной температуре на 10 минут. Маленькую каплю после перемешивания помещают на предметное стекло и размазывают так же, как при выполнении мазка крови. Затем предметное стекло быстро высушивают на воздухе и исследуют под микроскопом с большим увеличением (×50–×100).

Систематическое исследование мазков крови

При оценке мазка крови очень важно руководствоваться единой схемой исследования.

Мазок крови, выполненный одним тонким (моноцеллюлярным) слоем с округлостью на конце, утолщается к основанию. Клетки крови оценивают на тонком слое, потому как толстый слой несёт в себе мало информации. При малом увеличении (×10 или ×20) краевую часть мазка, в основном его округлый конец, обычно обследуют на выявление агрегатов тромбоцитов или широких атипичных клеток (лифмобластов или дендритных клеток) (фото 4). Агрегаты тромбоцитов после их активации формируются in vitro. Этот феномен происходит иногда в результате трудного забора крови, что, например, наиболее часто отмечают у кошек (E. Duan Lassen, G. Weiser, 2006; S.L. Stockhman, M.A. Skkott, 2008; D. Walker, 2008).

Фото 4. Микроскопия мазка крови здоровой собаки (× 1000). Сгустки тромбоцитов

Исследование мазков крови - это довольно распространённый метод, позволяющий быстро диагностировать многие часто встречающиеся нарушения у собак и кошек. Основными условиями эффективного использования этого метода диагностики являются строгое соблюдение техники подготовки мазка и систематическое исследование с соблюдением алгоритма исследования.

Основные положения

После забора материала кровь следует быстро поместить в пробирку с антикоагулянтом для того, чтобы сохранить качество клеток.

Окраска новым голубым метиленовым позволяет идентифицировать ретикулоциты.

Оценку осуществляют на тонком слое мазка крови со считыванием под микроскопом на уровне его косичек.

Под систематическим исследованием мазка крови подразумевается алгоритм APEL.

СВМ № 5/2010

More Than Meets the Eye.

John S. Nguyen, M.D., Spyridon S. Marinopoulos, M.D., Bimal H. Ashar, M.D., and John A. Flynn, M.D.

В этой статье представлена постадийно информация о реальном пациенте (жирный шрифт), эта информация обсуждается экспертом-клиницистом, который обращается напрямую к читателю (обычный шрифт). Далее следуют комментарии авторов.

Пациентка 61 года была госпитализирована с жалобами на ощущение сердцебиения и одышку на протяжении двух последних дней. У нее была обнаружена фибрилляция предсердий с быстрым желудочковым ответом, начато лечение внутривенным введением дилтиазема и гепарина. Состояние пациентки улучшилось, но на третий день после госпитализации она сообщила о возникновении легкой слабости и тошноты, а также изменение цвета мочи на темно-красный. Мочевой катетер у пациентки установлен не был, ощущения сердцебиения, одышки, болей в спине или животе, дизурии или головокружения не отмечала.

Темно-красный цвет мочи указывает, чаще всего, на макрогематурию или пигментурию (к которой относятся гемоглобинурия и миоглобинурия). Хотя обычно при пигментурии моча окрашена в цвет чая или колы, иногда она может быть темно-красного, коричнево-малинового и даже ярко-вишневого цвета. О гематурии будет свидетельствовать обнаружение большого количества эритроцитов при микроскопии мочи, тогда как их отсутствие в сочетании с обнаружением гемоглобина при анализе мочи (в оригинале – urinary dipstick testing; прим. перев .) будет свидетельствовать о пигментурии. (Чтобы различить эти состояния, можно также использовать центрифугирование мочи: появление красного осадка будет указывать на гематурию, а красного супернатанта – на пигментурию. В последнем случае, можно провести анализ супернатанта на гемоглобин). Если, при наличии красной окраски мочи, будут получены отрицательные результаты анализа мочи на гемоглобин и при микроскопии не будет обнаружено эритроцитов, то можно предположить более редкую причину изменения окраски, например вследствие употребления свеклы (в оригинале – beeturia; beet – свекла; прим. перев .) или порфирии. Если у этой пациентки окажется макрогематурия, я бы предположил возможное наличие инфекции мочевых путей, злокачественной опухоли или нефролитиаза. Если будет подтверждена макрогематурия и отсутствие инфекции мочевых путей, я бы посоветовал выполнить цистоскопию и компьютерную томографию (КТ) брюшной полости и малого таза.

В анамнезе у пациентки артериальная гипертензия, по поводу которой она получает гидрохлортиазид. В остальном она была здорова, других медикаментов или растительных препаратов не принимала. За последние несколько месяцев ее вес не изменялся. В последнее время за пределы страны не выезжала. Курение, прием алкоголя, прием наркотиков отрицает.

При физикальном обследовании: Температура тела в норме, ЧСС от 90 до 100 ударов в минуту, АД – 120/70 мм Hg, ЧДД – 16/мин, сатурация кислорода (SaO2) – 95% при дыхании атмосферным воздухом. При аускультации легкие чистые. При обследовании сердечно-сосудистой системы отмечался только нерегулярный ритм. При пальпации живота увеличения размеров органов, опухолевидных образований или болезненности в надлобковой области не выявлено. Реберно-позвоночные углы безболезненны. При ректальном обследовании опухолевидных образований не выявлено, гваяковый анализ стула на скрытую кровь отрицательный. Очаговых изменений на коже не обнаружено.

Причиной гематурии все еще может быть злокачественное новообразование мочеполовой системы. Отсутствие лихорадки, озноба и болезненности в реберно-позвоночных углах делает диагноз пиелонефрита маловероятным, хотя по-прежнему возможно наличие инфекции нижних отделов мочевых путей. Пигментурией может проявляться рабдомиолиз (в виде миоглобинурии). Однако при рабдомиолизе обычно возникает миалгия, и, кроме того, пациентка не принимает лекарственных препаратов, которые могут вызвать подобное осложнение. Другой причиной окрашивания мочи в темно-красный цвет является гемоглобинурия, вызванная быстрым внутрисосудистым гемолизом. У пациентки может быть дефицит глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (G6PD), однако в анамнезе нет данных об острой инфекции или приеме таких медикаментов, как сульфонамид или нитрофурантоин, которые могли бы усилить гемолиз при подобной патологии. Также следует обратить внимание на такие возможные причины, как маршевая гемоглобинурия, микроангиопатический гемолиз вследствие патологии клапанов и пароксизмальная ночная гемоглобинурия (PNH). Однако сердечных шумов не выявлено, и в анамнезе нет данных о недавних значительных физических нагрузках.

На третий день после госпитализации в анализе крови уровень лейкоцитов составлял 11,0×10 9 /л, по сравнению с 7,0×10 9 /л при поступлении; гематокрит – 30%, при поступлении – 35%; уровень тромбоцитов оставался в пределах нормы; уровень креатинина – 1,8 мг/дл (160 мкмоль/л), при поступлении – 0,9 мг/дл (80 мкмоль/л). Пока пациентка получала нефракционированный гепарин, показатель активированного частичного тромбопластинового времени составлял 2,7 от контрольного (имеется в виду соотношение АЧТВ/АЧТВдолж, где АЧТВдолж подсчитывается по определенным таблицам; при терапии нефракционированным гепарином это соотношение должно быть, по аналогии с МНО, повышено до 1,5-2,5; прим. перев. ). Уровень креатинфосфокиназы был в пределах нормы. При анализе мочи обнаружены высокие уровни гемоглобина и белка (3+). Результат анализа мочи на миоглобин отрицательный. Результаты микроскопического исследования мочи: эритроциты – 2-3 в поле зрения, лейкоциты – 0-1 в поле зрения, эпителий – 0-1 в поле зрения, бактерии в небольшом количестве, цилиндров и кристаллов не обнаружено.

Хотя у данной пациентки моча имеет темно-красную окраску и при анализе мочи выявлен гемоглобин, однако количество эритроцитов при микроскопии составляет только 2-3 в поле зрения, что указывает на остро развившуюся гемоглобинурию или миоглобинурию. Нормальный уровень креатинфосфокиназы и отрицательный результат анализа мочи на миоглобин означают, что единственной возможной причиной симптомов у пациентки остается гемоглобинурия. Вызывает тревогу возможность развития почечной недостаточности, так как гемоглобинурия может вызывать острый некроз канальцев вследствие формирования конгломератов гемоглобина. Протеинурия у пациентки может отражать наличие как транзиторного процесса, например инфекции или стресса, так и патологии клубочков или канальцев.

Было выполнено промывание мочевого пузыря, после этого выделяемая моча снова стала прозрачной и желтой. На четвертый день после госпитализации лабораторные исследования были выполнены повторно, уровень креатинина в сыворотке составил 3,1 мг/дл (270мкмоль/л), уровень мочевины – 29 мг/дл (10,4 ммоль/л), гематокрит – 23%, лейкоциты – 7,72×10 9 /л, тромбоциты – 203×10 9 /л. Микроскопия мазка периферической крови: лейкоциты не изменены, шистоцитов, дегмацитов (“надкусанных” эритроцитов), клеточных фрагментов и сфероцитов не обнаружено (Рисунок 1).

Рисунок 1.

Мазок периферической крови: нормохромные эритроциты нормальных размеров, шистоцитов, дегмацитов (“надкусанных” клеток) или сфероцитов нет.

У пациентки быстро прогрессирует анемия и почечная недостаточность. Учитывая отсутствие явного кровотечения или агрессивной инфузионной терапии, я предполагаю наличие массивного гемолиза; гемоглобинурия указывает на то, что гемолиз острый и внутрисосудистый. По имеющимся данным, пациентке не проводилось переливания крови, что могло бы вызвать острую гемолитическую трансфузионную реакцию. Повышение уровня креатинина у пациентки может быть следствием пигмент-индуцированного острого тубулярного некроза, сочетающегося со снижением экстрацеллюлярного объема и ишемией почек (в оригинале – The patient"s rising creatinine level may be due to pigment-induced acute tubular necrosis accompanied by extracellular volume depletion with renal ischemia; честно говоря, сам не понял, почему… прим. перев. ). В анамнезе нет упоминаний о воздействии нефротоксических агентов или внутривенном введении контрастных веществ, но я хотел бы проверить правдивость этой информации. Учитывая усиливающуюся почечную недостаточность и продолжающийся гемолиз, возможно развитие гиперкалиемии, поэтому следует постоянно мониторировать уровень калия.

Уровень калия составлял 4,7 ммоль/л, лактат-дегидрогеназы – 1610 Мед/л (норма 122-220 Мед/л). При дальнейшем обследовании выявлен высокий уровень гемосидерина в моче (4+), сывороточный уровень G6PD в пределах нормы, ретикулоциты – 4,3% (норма 0,5-1,8%), уровень гаптоглобина неопределяем, прямая и непрямая пробы Кумбса отрицательны. Уровень ферритина составил 30 мкг/л (норма 10-300 мкг/л), сывороточного железа – 38 мкг/л (7 мкмоль/л), при норме 50-70 мкг/л (9-30 мкмоль/л), трансферрина – 153 мг/дл (норма 200-400 мг/дл), сатурация железа – 20% (норма 20-55%).

Выраженное повышение уровня лактат-дегидрогеназы, неопределяемый уровень гаптоглобина и гемосидеринурия подтверждают диагноз гемолитической анемии вследствие внутрисосудистого гемолиза. Нормальный уровень G6PD и отсутствие воздействия медикаментов, обладающих оксидантным действием делают диагноз дефицита G6PD маловероятным, хотя иногда у пациентов с этой патологией в условиях острого гемолиза может быть нормальный уровень G6PD.

Уровень ферритина у пациентки находиться на нижней границе нормы, поэтому возможно развитие дефицита железа, что является одной из особенностей хронического внутрисосудистого гемолиза. Большинство гемолитических процессов протекают в основном экстраваскулярно, при этом уровень железа восстанавливается путем метаболизирования молекул гема ретикулоэндотелиальной системой. Напротив, при массивном интраваскулярном гемолизе (что бывает, например, при маршевой гемоглобинурии или PNH, а также, изредка, у пациентов с искусственными клапанами сердца) внутри сосудов могут высвобождаться очень большое количество гемоглобина, и тогда происходит его потеря через почечную экскрецию. Пациентка находится в стационаре, в анамнезе нет данных о недавних физических нагрузках, и у нее не установлены искусственные сердечные клапаны. Дополнительно расспросив пациентку, можно попытаться выявить предшествовавшие эпизоды гемоглобинурии, что свидетельствовало бы в пользу диагноза PNH.

На ультразвуковом исследовании почек признаков гидронефроза, нефролитиаза или объемных образований не обнаружено. Пациентке продолжали проводить инфузионную терапию, при этом сохранялся достаточный объем выделяемой мочи, однако уровень креатинина в сыворотке продолжал повышаться и достиг 3,5 мг/дл (310 мкмоль/л). Нестероидных противовоспалительных препаратов или внутривенных контрастных препаратов во время госпитализации и до нее пациентка не получала.

Отсутствие признаков гидронефроза при ультразвуковом исследовании позволяет исключить обструкцию мочевых путей как причину жалоб пациентки. С целью улучшения перфузии почек и поддержания диуреза, а также для предупреждения дальнейшего повреждения почек вследствие пигментурии, следует продолжать внутривенное введение солевых растворов. Существует предположение, что при лечении пациентов с нетравматическим рабдомиолизом или пигментурией ощелачивание мочи с помощью внутривенного введения натрия бикарбоната может иметь протективный эффект по отношению к почкам, так как ведет к увеличению растворимости миоглобина и гемоглобина. Однако ощелачивание несет потенциальный риск развития гипокальциемии, поэтому сомнительно, что этот метод имеет какие-либо преимущества по сравнению с инфузионной терапией одним физиологическим раствором.

При магнитно-резонансной ангиографии и венографии не было выявлено признаков стеноза почечных артерий или тромбоза почечных вен. Была выполнена биопсия почки, при исследовании образца обнаружено распространенное острое поражение канальцев с формированием гемоглобиновых цилиндров (Рисунок 2). Выявлены скопления железа в клетках канальцев. При последующем расспросе пациентки было выяснено, что за последние несколько лет у нее время от времени были похожие эпизоды потемнения мочи, по словам пациентки, они появлялись “на холоде или при простуде”.

Преимущества автоматизированных методов определения лейкоцитарной формулы - скорость и воспроизводимость. Однако, как уже упоминалось, ни один из автоматизированных методов не способен различать нейтрофильные гранулоциты как отдельный тип лейкоцитов. Пока неясно, насколько важен этот недостаток. Автоматизированное определение лейкоцитарной формулы в настоящее время является методом скрининга: при получении совершенно нормальных результатов вряд ли стоит вручную подсчитывать формулу с помощью микроскопа или во всяком случае вряд ли ее стоит повторять. Однако с помощью

автоматизированных методов не удается обнаружить редко встречающиеся нарушения и морфологические варианты. Для выявления таких аномалий необходимо исследовать мазок периферической крови.

МАЗОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

Изучение мазка периферической крови остается важной частью гематологического исследования. Клиницисту следует учесть, что к изучению мазка имеет смысл приступать после получения результатов автоматизированного анализа крови. Время, затрачиваемое на изучение мазка, необходимо для получения дополнительной информации, а не для дублирования данных автоматизированного анализа. В целом автоматизированный анализ крови гораздо эффективнее ручных методов при определении средних величин и обычных количественных характеристик: эритроцитарных индексов, количества клеток, размеров тромбоцитов и процентного соотношения лимфоцитов и гранулоцитов. Однако автоматизированный анализатор в лучшем случае малонадежен, а часто совершенно непригоден для выявления редких аномалий: ядросодержащих клеток эритроидного ряда, незрелых гранулоцитов, фрагментов эритроцитов.

Эритроциты

Обнаружение эритроцитов в виде монетных столбиков может быть первым толчком к выявлению лимфоцитарных или плазмоцитарных нарушений. Фрагменты эритроцитов удаётся обнаружить, если они составляют не менее0,5% всех клеток. Примерно при таком же уровне их содержания отклонения выявляются и на эритроцитарной гистограмме. Таким образом, оба метода дополняют друг друга. Аномалии формы могут указывать на конкретные заболевания, например, серповидные гемоглобинопатии, тогда как «каплевидные» клетки свидетельствуют об инфильтрации костного мозга опухолью или о миелофиброзе. Мишеневидные эритроциты и эритроциты в виде точильного камня являются менее специфическими аномалиями. Наиболее частая морфологическая аномалия описывается как«умеренный анизоцитоз, умеренный пойкилоцитоз». К сожалению, эта аномалия настолько неспецифична, что ее обнаружение бесполезно даже для решения вопроса о наличии гематологического заболевания.

Полихромазию необходимо оценивать количественно, клиницисты должны знать, что различная выраженность полихромазии указывает на различную степень стимуляции костного мозга. Базофильная зернистость является еще одним свидетельством присутствия остаточных количеств РНК; она может встречаться при любой форме стимуляции эритроидного ростка. Следует внимательно искать ядросодержащие эритроциты, поскольку их присутствие указывает на выраженную стимуляцию эритроидного ростка, недостаточность функции селезенки или инфильтрацию костного мозга опухолевыми клетками.

WBC (white blood cells) - количество лейкоцитов крови (х10 9 /л). Измерение числа лейкоцитов проводится после полного лизиса эритроцитов специальным реактивом. Все частицы размером более 35 фл считаются как лейкоциты. Тромбоциты, размер которых меньше порогового значения 35 фл, исключаются из подсчета. Коэффициент вариации (CV) при автоматическом определении этого показателя составляет 2-3%.

При наличии резистентных к лизису эритроцитов они определяются как лейкоциты и вызывают повышение числа WBC. В этих случаях следует обратить внимание на изменение формы RBC гистограммы.

Таблица 11. Возможные ошибки измерения лейкоцитов

6.4. Подсчет лейкоцитарной формулы

Многие современные гематологические анализаторы определяют от 6 до 10 показателей лейкоцитарной формулы с учетом относительного и абсолютного количества клеток, так называемые 3Diff или 5Diff .

6.4.1 Гематологические анализаторы, определяющие 18 параметров крови, дифференцируют все WBC на три популяции (3Diff). В основе работы анализаторов 3Diff лежит принцип кондуктометрии. Клетки дифференцируются по объему на 3 категории: лимфоциты, нейтрофилы и средние клетки, состоящие преимущественно из моноцитов с добавлением эозинофилов и базофилов. Определяется как относительное (%), так и абсолютное их содержание (клетки/л).

Автоматические гематологические анализаторы, определяющие 26 и более параметров крови, дифференцируют WBC на пять популяций (5Diff). В основе работы анализаторов 5Diff используется комбинация кондуктометрического метода с другими технологиями, такими как: метод лазерного светорассеивания, радиочастотный анализ, использование дифференцирующих лизатов, цитохимический метод.

Автоматический дифференцированный счет лейкоцитов должен выполняться в день взятия крови. Для получения наиболее точных результатов дифференциального анализа лейкоцитов рекомендуется исследование образцов крови проводить в промежуток времени от 30 минут до 5 часов после взятия материала, при значительном лейкоцитозе после предварительного разведения крови – от 5 минут до 1 часа.

После 24-часового интервала изменения, возникшие при хранении, могут воздействовать на систему «сигналы тревоги» и искажать результат. На дифференциальный счет популяций лейкоцитов влияют те же факторы, что и на общее число лейкоцитов. Появление «сигналов тревоги» указывает на наличие патологических изменений в исследуемом образце и требует микроскопического исследования окрашенного мазка крови.

6.4.2 Некоторые факторы, влияющие на дифференциальный счет лейкоцитов в гематологических анализаторах 3Diff

LY и LY%: микроформы бластов, нормобласты, резистентные к лизису эритроциты (например, эритроциты, содержащие малярийный плазмодий) могут быть причиной ошибочного измерения числа LY.

MO и MO%: крупные лимфоциты, атипичные лимфоциты, плазматические клетки, бластные клетки и избыточное количество базофилов могут оказывать влияние на точность подсчета МО. Часть эозинофилов также может просчитываться в данном канале.

GR и GR%: избыток эозинофилов, метамиелоцитов, промиелоцитов, бластных клеток и плазматических клеток могут быть причиной ошибочного подсчета GR и GR%.

На лейкоцитарной гистограмме в анализаторах 3Diff субпопуляции лейкоцитов попадают в три главные области гистограммы распределения WBC, которые отделены с помощью пороговых значений (дискриминаторов). Если результаты подсчета попадают в область нормальных значений, то никаких маркеров, предупреждающих о возможной патологии не появляется. Форма гистограммы изменяется при нарушении распределения лейкоцитов по популяциям или недостаточном лизисе эритроцитов.

Таким образом, гематологические анализаторы 3Diff в большинстве случаев позволяют выявлять изменения лейкоцитарной формулы крови, однако не способны проводить полную дифференцировку лейкоцитов. При наличии микроформ бластных клеток, по своему размеру сходных с лимфоцитами, анализаторы, принцип измерения которых основан только на кондуктометрическом методе, будут относить их к популяции мелких клеток (лимфоцитов).

6.4.3 В гематологических анализаторах 5Diff подсчитываются все 5 классов лейкоцитов, встречающихся в норме: нейтрофилы, лимфоциты, моноциты, эозинофилы и базофилы. Использование одновременно нескольких методов анализа позволяет значительно улучшить качество дифференцировки клеток и, следовательно, работу анализатора. В анализаторах данного типа более сложная система «сигналов тревоги», позволяющая уточнить наличие патологических клеток (незрелых нейтрофилов, атипичных лимфоцитов, бластных клеток, нормобластов). При плохом качестве материала анализаторы выдают дополнительные «сигналы тревоги», такие, например, как сгустки тромбоцитов, фрагменты эритроцитов-призраков. Они снабжены соответствующими программами обнаружения незрелых клеток, активированных лимфоцитов, бластных клеток.

Обозначения флагов дифференциальных параметров зависят от фирмы-производителя анализатора.

Это могут быть: LIC (Large Immature Cells), которые, в свою очередь, подразделяются на:

IMG (Immature Granulocytes), незрелые гранулоциты,

IMM (Immature Monocytes) незрелые моноциты,

IML (Immature Lymphocytes) незрелые лимфоциты,

LS (Left Shift) – левый сдвиг, указывающий на возможность левого сдвига в формуле крови (палочкоядерные нейтрофилы)

исследование мазка крови.

При лимфоцитозах или наличии измененных по объему лимфоцитов появляются следующие флаги:

Аtipical Lymphocytes, Variant

Lymphocytes, Reactive

Lymphocytes, Abnormal Lymphocytes

Большинство гематологических анализаторов 5Diff имеют жесткую систему как внутреннего, так и внешнего контроля качества, что делает их работу более надежной.

Несмотря на все достоинства, даже самые современные гематологические анализаторы обладают некоторыми ограничениями, которые касаются точной морфологической оценки патологических клеток (например, при лейкозах), и не в состоянии полностью заменить световую микроскопию.

Контроль качества исследования клеточного состава крови на автоматических гематологических анализаторах
1. Порядок проведения контроля качества

Комплексная система контроля качества клинических лабораторных исследований осуществляется путем:

Установления единых требований к аналитическому качеству количественных методов;

Ежесерийного выполнения процедур внутрилабораторного контроля качества с использованием контрольных материалов (оперативный контроль качества);

Регулярного участия в программах внешней оценки качества (ГОСТ Р 53133.1―2008) .

Внутрилабораторный контроль качества представляет собой систему повседневного слежения за точностью получаемых на гематологическом анализаторе результатов для поддержания стабильности аналитической системы, выявления и устранения недопустимых случайных и систематических погрешностей и заключается в сопоставлении результатов исследования проб с результатами исследования контрольного материала и измерении величины отклонения.

Проводится в соответствии с инструкцией к прибору и инструкцией к используемым контрольным материалам и требованиями стандарта ГОСТ Р 53133.2―2008 ..

Внутрилабораторный контроль качества должен быть:

Систематическим, повседневным, проводиться по единым правилам, т.е. анализ контрольных проб должен включаться в обычный ход работы лаборатории;

Охватывать все области измерений (норма, высокие и низкие патологические значения);

Производиться в реальных условиях работы лаборатории (так же, как обычные пробы пациентов, т.е. тем же персоналом и в тех же условиях);

Объективным (желательно "шифровать" контрольный материал, чтобы исполнитель не знал, где опыт, а где контроль).

Принцип проведения внутреннего контроля достаточно прост: периодически (в каждой серии) нужно проводить измерение одного и того же контрольного материала, а результаты этих измерений заносить на контрольную карту.

Хорошо организованная система внутреннего контроля качества позволяет достаточно эффективно выявлять ошибки, связанные с:

внешними варьирующими факторами (реактивы, калибраторы, расходные материалы);

внутренними варьирующими факторами (организация в лаборатории "домашних реактивов", обучение персонала, обслуживание приборов, ведение документации, реакция персонала на возникающие проблемы).

Концентрация гемоглобина в большинстве гематологических анализаторов определяется фотометрически. Различное влияние липидемии на определение гемоглобина связано с техническими особенностями прибора. Величина результирующей ошибки зависит от оптической геометрии прибора: размера выходного отверстия из кюветы для образцов и расстояния до фотодиода.

Контролем за правильностью измерения концентрации гемоглобина может служить величина МСНС.Чаще всего увеличение МСНС свидетельствует об ошибках, допущенных при измерении пробы (погрешности определения гемоглобина или MCV). В подобных ситуациях наиболее точные результаты определения концентрации гемоглобина гемиглобинцианидным методом могут быть получены на фотометре при добавлении в холостую пробу 20 мкл сыворотки больного. Таким образом, данный параметр может быть использован и как индикатор ошибок, допущенных на аналитическом или преаналитическом этапах работы.

Требования к качеству исследований клеточного состава крови

Для оценки качества исследований рассчитываются следующие статистические

показатели:

Среднее арифметическое значение или средняя арифметическая (Х):
- предварительная оценка прецизионности (по 10 измерениям в одной серии) - CV 10 ;

Предварительная оценка относительного смещения – В 10 ;

Окончательная оценка прецизионности (по 20 измерениям) CV 20 ;

Окончательная оценка относительного смещения В 20 .

В таблице 11 представлены рекомендуемые стандартом ГОСТ Р 53133.1─2008 (приложение А) внутрилабораторных погрешностей гематологических исследований. Эти ПДЗ вычислены как компромисс между основанными на коэффициентах биологической вариации пределами погрешностей и фактическими характеристиками точности, достигнутыми большей частью клинико-диагностических лабораторий страны по данным системы внешней оценки качества.

Таблица 12

Оперативные пределы допускаемых значений

Вид исследования
Вид исследования	В 10	CV 10	B 20	CV 20	B 1
Общий гемоглобин в крови	± 5	4	± 4	4	± 9
Эритроциты в крови	± 7	4	± 6	4	± 11

В таблице 13 представлены ПДЗ, рассчитанные на основе имеющихся в литературе данных о биологической вариации. Их можно рассматривать как желательные нормативы.

Таблица 13

Оперативные пределы допускаемых значений, рассчитанные на основе данных о биологической вариации

Вид исследования	Оперативные пределы допускаемых значений
	для установочной серии внутрилабораторного контроля качества, коэффициент вариации, %				для результата единичного измерения, относительное смещение, %
	В 10	CV 10	B 20	CV 20	B 1
Эритроциты, подсчет в крови	± 2,7	2,2	± 2,4	2,0	± 4,9
Эритроциты, средний объем клетки	± 1,6	0,9	± 1,5	0,8	± 2,5
Гемоглобин, концентрация в крови	± 2,7	1,9	± 2,4	1,8	± 4,5
Гемоглобин, средняя концентрация в эритроците (МСНС)	± 1,3	1,2	± 1,2	1,1	± 2,5
Гемоглобин, среднее содержание в одном эритроците (МСН)	± 1,9	1,1	± 1,7	1,0	± 2,9
Гематокрит	± 2,6	1,9	± 2,4	1,8	± 4,5
Лейкоциты, подсчет в крови	± 9,0	7,5	± 8,0	6,9	± 16,3
Лимфоциты, подсчет в крови	± 10,6	7,1	± 9,7	6,5	± 17,6
Моноциты, подсчет в крови	± 18,7	12,2	± 17,1	11,2	± 30,7
Нейтрофилы, подсчет в крови	± 14,1	11,0	± 12,7	10,1	± 24,9
Тромбоциты, подсчет в крови	± 8,7	6,2	± 7,9	5,7	± 14,8
Тромбоциты, средний объем	± 3,6	2,9	± 3,2	2,7	± 6,5
Ретикулоциты, подсчет в крови	± 11,2	7,5	± 10,2	6,9	± 18,5

Содержание гемоглобина, скорость оседания эритроцитов (СОЭ) число эритроцитов и лейкоцитов в 1 мкл крови, лейкоцитарная формула (процентное содержание различных групп лейкоцитов), а также цветной показатель (коэффициент, свидетельствующий о степени насыщения гемоглобином эритроцитов) составляют данные общего клинического анализа крови.
Кровь для анализа берется в утренние часы (необязательно до завтрака), в поликлинических же условиях кровь следует брать после 10- 15-минутного отдыха.
Для исследования кровь берут из безымянного пальца левой руки после тщательной обработки его спиртом. Прокол делают на боковой поверхности мякотной части первого фаланга стерильной иглой-скарификатором, причем плоскость иглы следует располагать перпендикулярно рисунку кожи пальца - в этом случае ранка зияет и кровь выделяется длительно.

Определение концентрации гемоглобина

Среди методов определения гемоглобина наиболее широкое распространение получили методы, основанные на колориметрии, т. е. определении интенсивности окраски.
Наиболее простым из них является определение гемоглобина при помощи визуальной колориметрии в гемометре Сали, который представляет собой деревянный штатив с центральной градуированной пробиркой, по бокам которой расположены запаянные стеклянные трубочки с цветным стандартом (солянокислый гематин в глицерине).
В центральную пробирку предварительно наливают 0,1% раствор соляной кислоты до метки, соответствующей 2 или 3 г%, затем осторожно вносят (точно!) 0,02 мл крови, взятой из пальца специальной пипеткой, приложенной к гемометру. Поверхностным слоем кислоты промывают пипетку и, перемешав стеклянной палочкой кровь и кислоту, оставляют на 5 мин для образования солянокислого гематина. Затем добавляя дистиллированную воду и постоянно перемешивая палочкой, добиваются полного совпадения цвета жидкости в центральной пробирке со стандартами. Концентрация гемоглобина соответствует отметке уровня раствора по нижнему мениску. Концентрацию гемоглобина можно выражать или в г% гемоглобина или в условных единицах. 16,67 г гемоглобина принято за 100 единиц.
Концентрация гемоглобина в крови у женщин бывает от 11,7 до 15,8 г°/о или от 117 до 158 г/л,-у мужчин - от 13,3 до 18 г% или от 133 до 180 г/л.

Взятие крови для подсчета форменных элементов

Для подсчета форменных элементов кровь разводят в смесителях (меланжерах) или пробирках, что последнее время получило более широкое применение.
Для подсчета эритроцитов кровь разводят в 200 раз 3% раствором хлорида натрия; если для взятия крови мы пользуемся пипеткой от гемометра, объем которой 0,02 мл, то мы должны брать 4 мл раствора хлорида натрия.
Для подсчета лейкоцитов кровь разводят в 20 раз, следовательно берут 0,02 мл крови и 0,38 мл 3% подкрашенного раствора метиленовой синькой уксусной кислоты, которая необходима, чтобы вызвать разрушение эритроцитов.
Взятие крови должно производиться с большой точностью, так как при таких небольших объемах попадание пузырька воздуха или остатка крови на внешней стороне пипетки ведет к увеличению ошибки определения.
Перед заполнением камеры необходимо протереть в камере шлифованное стекло так, чтобы появились радужные кольца.
Перед заполнением камеры разведенную кровь тщательно перемешивают, так как клетки оседают на стенки пробирки или ампулы смесителя, после этого каплю крови вносят под притертое шлифованное стекло камеры и оставляют на 1 мин в покое для оседания клеток.
Подсчет форменных элементов производят при малом увеличении микроскопа (объектив 8Х, окуляр 15Х или 10Х) в затемненном поле зрения.

Эритроциты считают в 5 больших квадратах (16x5 = 80 малых квадратов), расположенных в разных участках камеры, можно брать квадраты, расположенные по диагонали.
Счету подлежат эритроциты, лежащие внутри квадрата, и те, которые находятся на верхней и левой его сторонах; эритроциты, лежащие на нижней и правой сторонах, не считают, так как они относятся уже к другим квадратам.
Подсчитав число эритроцитов (А) в 5 больших квадратах, находят среднее арифметическое число эритроцитов в одном малом квадрате A/80, т. е. в 1/4000 мкл. Поэтому, чтобы найти число эритроцитов в 1 мкл, мы должны умножить полученное от деления число на 4000 и на 200 (разведение) .

Таким образом, мы получаем следующую формулу:

X=A*4000*200/80,

где X - число эритроцитов в 1 мкл, а А - число эритроцитов в 5 больших квадратах.
Если мы считали эритроциты в 5 больших квадратах и разводили кровь в 200 раз, то общий множитель для числа А будет 10 000.
Нормальное содержание эритроцитов в крови женщин 4-5*10 6 , мужчин - 4,5-5,5*10 6 .
Лейкоциты считают в 100 больших квадратах, не разделенных на малые, что соответствует 1600 малым. Таким образом, число лейкоцитов, найденное в 100 квадратах, делят на 1600, умножают на 4000 и на 20 (разведение). В данном случае для получения результата достаточно число сосчитанных лейкоцитов умножить на 50. Нормальное содержание лейкоцитов в крови 5*10 3 - 8*10 3 в 1 мкл.

Цветовой показатель крови. Цветовым показателем крови называют число, которое показывает, каково в среднем насыщение гемоглобином отдельного эритроцита данной крови по сравнению с насыщением отдельного эритроцита нормальной крови.
За нормальное содержание гемоглобина принимают 100 единиц, а нормальное количество эритроцитов равно 5 000 000.
Величина цветового показателя здоровых людей колеблется от 0,9 до 1,1.
Изучение мазка периферической крови. В мазках крови изучают морфологию эритроцитов и считают лейкоцитарную формулу, т. е. процентное соотношение между различными видами лейкоцитов.
Для того чтобы исследование было успешным, приготовление, фиксация и окраска мазков крови должны проводиться с большой тщательностью.
Для приготовления мазка поверхностью чистого, обезжиренного стекла на расстоянии 0,5 см от края предметного стекла прикасаются к капле крови у места прокола на пальце, а затем шлифованное покровное стекло помещают под углом 45° к предметному и подводят первое к капле крови так, чтобы она растекалась по заднему краю покровного стекла и легким движением, без резкого нажима делают мазок. Мазок должен кончаться на предметном стекле «метелочкой». Мазок высушивают на воздухе, при высыхании хороший, тонкий мазок имеет желтую окраску.
Простым, остро отточенным карандашом по середине мазка надписывают фамилию больного и дату исследования, после этого мазки фиксируют в метиловом спирте не менее 5 мин и красят по методу Романовского-Гимзы.

Краска состоит из смеси кислого (эозина) и основного (Азур II) красителей. Такой метод окраски дает возможность дифференцировать клетки. Первым этапом работы с мазком является оценка морфологии эритроцитов. Для этого выбирают тонкое место, где клетки лежат отдельно, а не в виде монетных столбиков. Нормальные эритроциты - безъядерные, окрашенные в розовый цвет клетки, округлые, приблизительно одинакового диаметра - 7,5 мкм, эритроциты имеют форму двояковогнутого диска, поэтому в мазке имеют просветление в центре и более интенсивно окрашенную периферию.

{module директ4}

Приготовление толстой капли

Для исследования крови на плазмодии малярии делают толстую каплю. Кровь берут обычным способом из мякоти пальца. К капле крови, выступившей из места укола, прикасаются поверхностью предметного стекла. Нанесенные отдельно 2-3 капли размазывают углом другого стекла. Сухой мазок заливают (без фиксирования) краской Романовского на 30-40 мин, потом окрашенную каплю осторожно ополаскивают водой и просушивают препарат в вертикальном положении.

Примерные данные анализа

Повышенное количество эритроцитов и гемоглобина в крови может быть при заболевании красных элементов крови - эритремии, тогда число эритроцитов достигает до 9-106 и больше.
Увеличенное содержание эритроцитов в крови может возникнуть вторично, т. е. тогда, когда нет заболевания красного листка кроветворения, а количество эритроцитов повышается в результате болезни других органов и систем (при декомпенсированном диффузном пневмосклерозе, эмфиземе легких, некоторых видах врожденных пороков сердца, склерозе сосудов системы легочной артерии, пороках правого сердца, недостаточности кровообращения III степени и др.). Этот симптом называется эритроцитозом.
Морфологически измененные эритроциты появляются при гиперхромной (мегалобластической) анемии. При этом в крови находят крупные эритроциты с большим содержанием гемоглобина (макроциты), эмбриональные эритроциты (мегалобласты), которые обычно в периферической крови не встречаются. Морфология эритроцитов изменяется также и при гипохромной анемии: появляются малые эритроциты (микроциты), измененные по своей форме (пойкилоциты) и эритроциты с малым содержанием гемоглобина (гипохромные эритроциты).

Подсчет лейкоцитарной формулы

При подсчете лейкоцитарной формулы необходимо определение структурных особенностей цитоплазмы и ядер клеток. Принадлежность клетки к той или иной группе определяется на основании совокупности всех признаков цитоплазмы и ядра.
При подсчете формулы надо придерживаться одного и того же способа передвижения стекла под микроскопом. Чаще всего применяется способ микроскопирования в 4 местах мазка. Известно, что лейкоциты распределяются в мазке неравномерно: лимфоцитов по краям меньше, чем в середине, а моноцитов в конце мазка больше, чем в начале. Поэтому при подсчете лейкоцитарной формулы лучше всего передвигаться по ломаной линии, просчитывая все встречающиеся клетки.
Подсчет 200 клеток - практический минимум для обычных клинических исследований.
Лейкоциты периферической крови в зависимости от наличия или отсутствия зернистости в цитоплазме делятся на гранулоциты (нейтрофильные, эозинофильные, базофильные) и агранулоциты (моноциты и лимфоциты).
Нейтрофилы . Размер клеток 10-12 мкм. Цитоплазма клеток бледно-розового цвета с мелкой, обильной, фиолетового цвета зернистостью. В норме в крови встречаются палочкоядерные (2-4%) и сегментоядерные (60-65%) нейтрофилы.
Эозинофилы . По величине клетки такие же, как нейтрофилы, иногда немного крупнее, цитоплазма заполнена крупными гранулами желтовато-красного цвета, ядро обычно имеет два сегмента одинаковой величины. Эозинофилов в норме 2-4%.
Базофилы . По размеру это самый маленький гранулоцит. Ядро неправильной, многолопастной формы, занимает почти всю клетку, бледно-розовая цитоплазма содержит крупные темно-фиолетовые гранулы. Гранулы базофилов растворяются в воде, и иногда в результате смывания при окраске препарата на месте гранул остаются не смытые бесцветные ячейки. В норме базофилов 0,1%.
Лимфоциты . Размер клеток колеблется от 7 до 10 мкм. Ядро компактной структуры, округлое или бобовидное. Цитоплазма клеток нежно-голубая с зоной просветления вокруг ядра (перинуклеарной), иногда в цитоплазме встречаются отдельные азурофильные зерна красно-фиолетового цвета. В периферической крови в норме 20-35% лимфоцитов.
Моноциты. Размер клеток колеблется от 12 до 20 мкм. Ядро чаще подковообразной, иногда неправильной формы. Цитоплазма более обширна чем у лимфоцитов, пепельно-голубого цвета с мелкой, нежной, красноватой зернистостью.
Моноцитов в норме 6-8%.
Повышенное содержание в крови лейкоцитов называется - лейкоцитозом, а пониженное - лейкопенией.

Окраска и подсчет ретикулоцитов

Ретикулоциты представляют собой молодые эритроциты с тонкой синей сетчаткой или зернистостью в цитоплазме. Эти клетки характеризуют активность красного кроветворения.
Для выявления подсчета ретикулоцитов пользуются методом суправитальной (прижизненной) окраски. На предметных стеклах делаются мазки краски бриллианткрезилблау в абсолютном спирте, а затем на покрытом краской стекле делают обычным образом мазок крови и помещают его на 3-5 минут во влажную камеру, после чего сушат и микроскопируют с иммерсионным объективом. В норме на 1000 эритроцитов встречается 8-10 ретикулоцитов, число их принято выражать в процентах (0,8-1%) или в промиллях (8-10%о) по отношению к эритроцитам.
Ретикулоциты - клетки, которые характеризуют повышенную выработку эритроцитов в костном мозге.
Они в большом проценте появляются в периферической крови при гипохромной анемии («злокачественной анемии»), при гемолитической анемии и др. заболеваниях. Пониженное содержание ретикулоцитов и полное их исчезновение в периферической крови наблюдаются при обострении гиперхромной анемии.

Для предупреждения агрегации (склеивания) кровяных пластинок прокол кожи делают через каплю 14% раствора сернокислой магнезии, нанесенной на палец. Кровь смешивают с магнезией и готовят тонкие мазки на предметных стеклах, которые затем фиксируют и окрашивают по Романовскому в течение 2-х часов.
Определяют количество кровяных пластинок на 1000 эритроцитов, а зная число эритроцитов в 1 мкл, подсчитывают число тромбоцитов в 1 мкл крови. В норме тромбоцитов содержится от 250 000 до 400 000.
Повышение содержания в крови тромбоцитов обнаруживается при эритремии, при заболеваниях селезенки, при некоторых формах злокачественных заболеваний (например, поджелудочной железы). Пониженное количество тромбоцитов возникает при анемиях.

Определение СОЭ

Скорость оседания эритроцитов определяется в крови, смешанной в соотношении 4:1с лимоннокислым натрием.
Реакция ставится в аппарате Панченкова. Капилляр Панченкова промывают цитратом натрия, затем набирают цитрат до метки 50, где стоит буква Р (реактив) и выдувают его в видалевскую пробирку. Этим же капилляром берут кровь дважды до метки К (кровь) и смешивают ее с цитратом. Смешанной с цитратом кровью заполняют этот же капилляр до деления 0 и ставят вертикально в штатив на час. Через час отмечают в миллиметрах величину столбика плазмы, образовавшегося над осевшими эритроцитами, что и является мерой скорости оседания эритроцитов.
В норме СОЭ у мужчин равна 10 мм/ч, у женщин-14 мм/ч.
Скорость оседания эритроцитов повышается при воспалительных, острых и хронических заболеваниях, при злокачественных опухолях и других заболеваниях.

Проба на совместимость резус-фактора

В пробирку без цитрата берут 2-3 мл крови реципиента, после свертывания крови сгусток обводят стеклянной палочкой и кровь центрифугируют. Две капли сыворотки из этой пробирки наносят на чашку Петри, добавляют к ней полкапли крови донора, перемешивают и чашку помещают в водяную баню (42-45°). Через 10 мин чашку вынимают и просматривают на свету при легком покачивании. Появление агглютинации укажет на недопустимость переливания данной крови.