Доклад нижегородских ученых по экспресс-диагностике онкологии с помощью биочипа признается лучшим в секции «Цитология» на 29-ом Европейском конгрессе по патологии! – после этих слов поздравлять россиян бросились коллеги из Италии , Хорватии , Турции , Германии … Оно и понятно – попасть в число лучших на этом конгрессе - все равно, что получить Оскар в кинематографе. Ежегодно за это право в Амстердаме борются главные медицинские светила со всего света.

Разработкой этого биочипа мы занимаемся с 2012 года, но свой нынешний вид он приобрел только пару лет назад, когда появился инвестор, - рассказывает один из авторов проекта, руководитель лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии ННИИ им. Блохиной Олег Уткин . – Аналогов этой тест-системе нет нигде в мире, достоверность диагноза составляет 95%.

То, что в стенах нижегородского института идет разработка уникальной технологии, сразу и не скажешь. Ни тебе секретных паролей на входе, ни автоматчиков на охране. Из всех мер предосторожности - только бахилы и обязательный белый халат на входе в лабораторию.

Вот это и есть наш биочип, - показывает мне Олег крохотную, едва различимую на ладошке стеклянную пластинку. Глядя на эту крошку, с трудом верится, что она способна выявить практически любой вид рака всего за полтора часа. За эту технологию многие президенты отдали бы полцарства и дочку в придачу.

Принцип действия этой системы прост: берем любой биоматериал - серозную жидкость, мочу или послеоперационный материал – и вносим в ячейки биочипа. Всего в чипе 15 секторов, в каждом из которых содержится помеченный флуоресцентным раствором белок. Если будут выявлены какие-то признаки онкологии, то клетки в ячейке покажут свечение под флюоресцентным микроскопом.

Кстати, в отличие ото всех остальных методов диагностики, биочип не только просигнализирует о самом факте онкологического заболевания, но и определит его разновидность и где есть метастазы, - тем самым поможет врачу дать прогноз по течению болезни и по подбору персональной терапии. На сегодняшний день тест-система способна диагностировать едва ли не все виды рака: легких, молочной железы, желудка, толстой кишки, яичников… В зависимости от подозреваемой разновидности онкологии будет меняться и набор белков в биочипе.

Сейчас существует восемь разновидностей таких тест-систем - от обычной скрининговой, которая просто выявляет наличие онкологии, до заточенных под каждую патологию, - объясняют разработчики. – Что самое главное – для проведения исследований не нужно ни дорогущих лабораторий, ни огромного штата высококвалифицированных врачей. Внести биоматериал в нашу тест-систему может любой лаборант, после чего врач-онколог уже может сделать заключение.

За эту разработку ученым уже вручили национальную премию "Призвание". ФОТО: Пресс-служба НижГМА

Эти биочипы просты не только в эксплуатации, но и в производстве. В небольшой лаборатории ежедневно можно делать тысячи таких систем. Отсюда и их дешевизна – один такой чип поликлинике будет стоить чуть больше тысячи рублей. А для самого пациента диагностика и вовсе будет бесплатной – она должна войти в систему ОМС.

Мы уже получили все необходимые патенты – российский и зарубежный, - рассказывает Олег Уткин. – Но чтобы биочипы поступили в поликлиники, нам необходимо регистрационное заключение Росздрава. Надеемся в самое ближайшее время получить и его. После этого буквально за пару месяцев сможем запустить массовое производство.

Со своей стороны российский Минздрав вручил нижегородским разработчикам престижную национальную премию «Призвание», присуждаемую лучшим врачам России , в номинации «За создание нового метода диагностики».

СПРАВКА «КП»

В разработке биочипа принимают участие ведущие ученые трех российских исследовательских центров: ФБУН «ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной», ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина», ФГБОУ ВО «НижГМА». Этой технологией уже заинтересовались ученые из России, Японии , Швейцарии , Китая , Беларуси , Казахстана и Армении .

Российские ученые из МФТИ и еще нескольких академических институтов создали чип, который позволяет с высокой точностью определять один из самых распространенных раков - колоректальный (так называют злокачественные опухоли толстой и прямой кишки).

ЧТО АМЕРИКАНЦАМ ЗАПРОСТО...

Крайне важно, что новый тест очень прост, кровь для него берут из вены точно так же, как для обычного так называемого биохимического анализа. Поэтому он будет хорошо подходить для скрининга - быстрого и простого отбора пациентов даже с ранними формами рака. Сейчас в мире для этого рекомендуют колоноскопию, которую после 50 лет нужно проводить не реже одного раза в десятилетие. Это совсем непростая и не очень приятная процедура, при которой гибкий эндоскоп вводят через прямую кишку в толстый кишечник. В США это профилактическое исследование для людей старше пятидесяти поставлено на поток. Каждый эпизодически получает по почте приглашение на такую диагностическую процедуру.

У нас такое исследование проводят по показаниям, когда есть симптомы какого-либо заболевания толстого кишечника. Если же кто-то хочет просто провести такое профилактическое исследование, как это делают в США, чтобы не проморгать болезнь, это можно сделать на платной основе в индивидуальном порядке. Может быть, всем поголовно его и не стоит делать, но тем, у кого есть факторы риска развития колоректального рака, это исследование лишним не будет.

Почему ранняя диагностика рака толстой и прямой кишки так важна? Во-первых, это заболевание одно из самых распространенных - в развитых странах эта злокачественная опухоль стоит на 3-м месте среди всех видов рака. Во-вторых, болезнь весьма тяжелая и тяжело лечится. Несмотря на большие достижения в ее лечении, результаты далеко не самые лучшие: пятилетнее выживание после хорошей терапии бывает примерно у 60-65% пациентов. И в-третьих, если опухоль выловить на ранних стадиях, то результаты будут гораздо лучшими. Для этого и нужен скрининг. И лучше простой и не очень затруднительный, как колоноскопия.

НАУКА - ПРАКТИКЕ

Над поиском такой методики трудится немало ученых в мире. Например, в США недавно появился метод диагностики по сложному анализу стула. Но наши ученые предложили еще более удачное решение. Про-цедура исследования сведена к забору крови из вены, как это делают при биохимическом анализе крови. Российский биочип построен на совсем иных принципах, чем американский набор для диагностики. Хорошо известно, что в крови есть маркеры, которые могут свидетельствовать о наличии опухоли. Они тем или иным образом связаны с обменом веществ в злокачественных клетках и с ответом организма на опухоль. И таких маркеров много. Беда в том, что они весьма капризны: могут быть не только при колоректальном раке, но и при других опухолях и даже при иных состояниях. То есть их специфичность для данного вида рака не всегда достаточна для уверенной постановки диагноза. Наши ученые нашли выход из этой проблемы: они сделали комбинированный чип, который определяет сразу не один маркер, а много. Благодаря этому точность диагностики повысилась многократно.

Не будем приводить названия маркеров, которые определяются при использовании чипа. Для нас гораздо важнее чувствительность предложенного теста - она составляет 88%. То есть он определяет наличие опухоли у 88% больных из 100. Это очень хороший показатель.

Отчет об исследовании отечественного чипа опубликован на днях во влиятельном международном журнале Cancer Medicine, и есть все основания полагать, что скоро такая полезная диагностическая система поступит в практическое здравоохранение. И самое главное, по этому же принципу можно разработать диагностические чипы и для других видов рака.

Материал подготовил Олег Днепров

Фото THESTAR.COM

ФАКТОРЫ РИСКА КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА:

• наличие таких болезней, как дивертикулы толстой кишки и неспецифический язвенный колит (болезнь Крона);
• возраст старше 50 лет;
• наличие этой опухоли у кровных родственников;
• большое содержание жиров и мяса в питании;
• пристрастие к алкоголю;
• курение;
• сахарный диабет, ожирение, низкая физическая активность.

Биологический микрочип, биочип (biochip, греч. bio(s) - жизнь и logos - понятие, учение; греч. mikros - маленький и англ. chip - осколок) - пластинка-носитель, на которой в определенном порядке расположены многочисленные ячейки (до несколько десятков тыс.) с различными иммобилизованными в них одноцепочечными олигонуклеотидами или олигопептидами, каждый из которых способен избирательно связывать определенное вещество, содержащееся в сложной смеси в анализируемом растворе. Биочип используется для молекулярно-генетических исследований, диагностики различных заболеваний человека, экспресс-диагностики высокопатогенных вирусов, а также в ветеринарии, сельском хозяйстве, криминалистике, токсикологии, охране окружающей среды. Первая работа по биочипам в современном формате (с фрагментами ДНК) была опубликована А. Д. Мирзабековым с сотр. в 1989 г.

Биологические микрочипы (biochips), или, как их чаще называют, DNA microarrays, - это один из новейших инструментов биологии и медицины XXI в. В настоящее время они активно производятся несколькими биотехнологическими фирмами. Биочипную технику можно с успехом применять как для исследовательских целей, так и для диагностики в медицинских учреждениях.

С помощью микрочипов можно проводить одновременный анализ работы тысяч и десятков тысяч генов, сравнивать их экспрессию. Такие исследования помогают создавать новые лекарственные препараты, выяснять, на какие гены и каким образом эти новые лекарства действуют. Биочипы являются также незаменимым инструментом для биологических исследований, за один эксперимент можно увидеть влияние различных факторов (лекарств, белков, питания) на работу десятков тысяч генов.

Биочипы позволяют очень быстро определять наличие вирусных и бактериальных возбудителей. Важное медицинское применение биочипов - это диагностика лейкозов и других вирусных заболеваний. Биочипы позволяют быстро, за считанные дни или даже часы различать внешне неразличимые виды лейкозов. Биочипы применяются для диагностики различных видов раковых опухолей .

Прообразом современных "живых чипов" послужил саузерн-блоттинг , изготовленный в 1975г. Эдом Саузерном. Он использовал меченую нуклеиновую кислоту для определения специфической последовательности среди фрагментов ДНК, зафиксированных на твердой подложке. В России ученые начали активно разрабатывать биочипы в конце 1980-х годов в Институте молекулярной биологии РАН под руководством А.Д.Мирзабекова.

Точнее всего биочипы описывает английское название DNA-microarrays, т.е. это организованное размещение молекул ДНК на специальном носителе. Профессионалы называют этот носитель платформой. Платформа - это чаще всего пластинка из стекла (иногда используют и другие материалы, например кремний), на которую наносятся биологические макромолекулы (ДНК, белки, ферменты), способные избирательно связывать вещества, содержащиеся в анализируемом растворе.

В зависимости от того, какие макромолекулы используются, выделяют различные виды биочипов, ориентированные на разные цели. Основная доля производимых в настоящее время биочипов приходится на ДНК-чипы (94%), т.е. матрицы, несущие молекулы ДНК. Оставшиеся 6% составляют белковые чипы.

Организованное размещение макромолекул занимает на платформе очень небольшой участок размером от почтовой марки до визитной карточки. Микроскопический размер биочипа позволяет размещать на небольшой площади огромное количество разных молекул ДНК и считывать с этой площади информацию с помощью флюоресцентного микроскопа или специального лазерного устройства для чтения ( рис. 2.50).

Характерные размеры ячеек современных микрочипов лежат в пределах 50-200 мкм, общее число ячеек на чипе составляет 1000-100000, а линейные размеры чипа - порядка 1 см. В поверхностных матричных биочипах ДНК иммобилизуется на поверхности мембран или пластинок из стекла, пластика, полупроводника или металла. В гелевых биочипах ДНК иммобилизуется в слое полиакриламидного геля толщиной 10-20 мкм, нанесенного на специально обработанную поверхность стекла. Также чипы могут наращиваться прямо из стеклянной пластинки методом фотолитографии с использованием специальных микромасок. Иммобилизуемая ДНК наносится на поверхность или через игольчатые растры (пины) механического робота, или с помощью технологии струйного принтера. Контроль качества нанесения осуществляется с помощью специализированной оптики и компьютерного анализа изображения. На биочипе в дальнейшем гибридизуют молекулы ДНК, меченные красителем.

Гибридизуемая ДНК в растворе метится с помощью флюоресцентной или радиоактивной метки. В случае смеси молекул ДНК (например, ДНК дикого типа и ДНК с мутациями) каждая метится своим флюоресцентным красителем. Свойства красителя не должны сильно зависеть от состава (A/Т или G/C) ДНК и температуры. Интенсивность флюоресценции в ячейках измеряют с помощью сканера или люминесцентного микроскопа, передающего сигнал на прибор с зарядовой связью. Однако флюоресценция является основным, но не единственным методом изучения гибридизации. В частности, данные о характере гибридизации можно получить также с помощью масс-спектрометрии, атомной силовой микроскопии и др.

В основе принципа работы всех типов биочипов с иммобилизованной ДНК лежит точное соответствие между комплементарными ДНК по правилу Уотсона-Крика: A-Т, G-С. Если соответствие между нуклеотидами иммобилизованной и гибридизуемой ДНК точно удовлетворяет условиям комплементарности, то образующиеся дуплексы будут термодинамически наиболее устойчивы. В результате при конечных температурах их будет больше, чем несовершенных дуплексов с нарушением условий комплементарности, и, соответственно, совершенным дуплексам будет отвечать более сильный сигнал флюоресценции. В выявлении и сопоставлении наиболее ярко светящихся ячеек и заключается работа прибора - анализатора биочипов.

Гибридизуемая ДНК обычно заранее нарабатывается в достаточных количествах с помощью ПЦР. В более продвинутых технологиях ПЦР осуществляется непосредственно на чипе. Кроме того, непосредственно на чипе можно осуществлять фрагментацию, фосфорилирование, лигирование ДНК или мини-секвенирование, при котором длина дуплекса увеличивается на одну пару оснований. Последнюю технику можно эффективно использовать для поиска мутаций.

На Западе и в России сейчас сформировалось два разных направления и два разных стандарта по созданию и применению биочипов. Российские биочипы дешевле, а западные - объемнее. При этом в России биочипами занимаются пока преимущественно исследовательские лаборатории, а на Западе - это, в первую очередь, военные исследования и коммерческое производство чипов для диагностики.

План.

ВВЕДЕНИЕ.

1.БИОЧИПЫ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ XXI ВЕКА.

1.2. Биочипы определение.

1.3. Виды, свойства и функции биочипов.

2.Основная часть.

2.1. Гелевые биочипы, их свойства, производство и анализ.

2.2. Олигонуклеотиды и ДНКовые микрочипы.

2.3. Клеточные микрочипы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

БИОЧИПЫ В БИОЛОГИИ И

МЕДИЦИНЕ XXI ВЕКА.

Биологические микрочипы являются одним из наиболее быстро развивающихся экспериментальных направлений современной биологии. Существует два основных типа биочипов. Первый рассматриваемый тип - это микроматрицы различных соединений, главным образом биополимеров, иммобилизованных на поверхности стекла, в микрокаплях геля, в микрокапиллярах. Другим типом биочипов являются миниатюризованные "микролаборатории". Эффективность биочипов обусловлена возможностью параллельного проведения огромного количества специфических реакций и взаимодействий молекул биополимеров, таких как ДНК, белки, полисахариды, друг с другом и низкомолекулярными лигандами. Удается в достаточно простых параллельных экспериментах собрать и обработать на отдельных элементах биочипа огромное количество биологической информации. В этом заключается фундаментальное информационное сходство биочипов с электронными микрочипами. Однако между ними имеется и ряд принципиальных различий.

На рис. 1 показан принцип действия ячейки ДНК или олигонуклеотидного биочипа, основанный на комплементарных взаимодействиях основания аденина (А) с тимином (Т) и гуанина (G) с цитозином (С) в двух нитях ДНК. Если последовательность оснований в одной нити ДНК (или олигонуклеотида) полностью комплементарна последовательности другой нити, то образуется стабильная совершенная двухнитчатая спираль - дуплекс. Однако присутствие в дуплексе даже одной неправильной пары, например G-G, предотвращает образование дуплекса. Если иммобилизовать в одном из элементов микрочипа специфическую одноцепочечную ДНК или, положим, 20-мерный олигонуклеотид (пробу), то при добавлении к микрочипу меченных флюоресцентными красителями фрагментов ДНК, например генома человека, будет происходить их высокоспецифичное взаимодействие. Заданный олигонуклеотидный элемент биочипа специфически свяжет только одну комплементарную последовательность из 420 = 1.09 х 1012 всех возможных последовательностей этой длины в ДНК. В результате флюоресцентное свечение наблюдается только на этом комплементарном элементе биочипа. Таким образом, один элемент биочипа производит одну выборку примерно из триллиона возможных вариантов, в отличие от элемента электронного чипа, где происходит двоичная выборка: ДА или НЕТ.

Рис. 1. Схема образования двойной спирали ДНК на биочипе

Олигонуклеотид фиксирован на одном из элементов биочипа и избирательно связывает из многих флуоресцентно меченых фрагментов ДНК только комплементарный. В результате только этот элемент начинает светиться. Это происходит благодаря высоко-специфичным взаимодействиям комплементарных пар нуклеотидов А с Т и G с С. Присутствие некомплементарной пары, например G-G, предотвращает взаимодействие и оставляет элемент микрочипа темным

Стремительное развитие биологии во второй половине прошлого века тесно связано с появлением молекулярной и клеточной биологии, которая основана на концепции о редукционизме -сводимости сложных биологических процессов к процессам, протекающим на уровне отдельных молекул биополимеров, прежде всего белков и нуклеиновых кислот и их различных клеточных комплексов и структур. Редукционизму противопоставлялась концепция интегратизма о необходимости комплексного изучения структуры и функционирования в клетке всей совокупности макромолекул. В последние годы появились такие новые интегративные подходы, как геномика, протеомика и селломика, развиваемые большими коллективами или часто целыми "научными фабриками". Эти направления позволяют устанавливать структуру и изучать процессы на уровне генов всего генома, белков всей клетки или клеток всей ткани. Развиваемые в последние годы биологические микрочипы позволяют реализовать в доступной форме весьма сложные интегративные подходы геномики, протеомики и селломики. Например, олигонуклеотидные и ДНКовые микрочипы, выпускаемые рядом фирм, позволяют в достаточно простых, доступных отдельным исследователям экспериментах изучать экспрессию большинства генов различных бактерий и многих генов человека. На очереди создание белковых чипов, содержащих большое количество иммобилизованных клеточных белков или специфичных к ним антител.

Макроматрицы ДНК и белков иммобилизованных на фильтре, или фиксированных в лунках планшет, были известны достаточно давно. Однако первая работа по ДНКовым микрочипам и одна из первых по белковым микрочипам в современном формате были опубликованы нашей лабораторией в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ). Этот принципиальный скачок был предложен для использования в новом методе секвенирования ДНК гибридизацией. В 1968 г. Советский Союз, а вслед за ним США и другие страны приняли государственные программы установления полной последовательности всех 3 миллиардов нуклеотидов генома человека. Широко дискутировался вопрос, должна ли эта задача решаться масштабированием существующих подходов или должны быть разработаны новые, более эффективные методы. В связи с временными ограничениями, ученые пошли по пути существенного улучшения и гигантского масштабирования уже существующего метода, основанного на считывании одного нуклеотида за другим с конца коротких фрагментов ДНК. Этот метод в химическом и ферментативном варианте был предложен В. Гилбертом и Ф. Сенгером, которые и разделили Нобелевскую премию за 1967 г. В развитии химического метода большую роль сыграли академики Е.Д. Свердлов и А.Д. Мирзабеков. В своей Нобелевской речи В. Гилберт отметил, что "идея метода пришла только после второго визита А. Мирзабекова" в его лабораторию.

Рис. 2. Секвенирование фрагмента ДНК гибридизацией с полным олигонуклеотидным микрочипом, содержащим все 4096 6-меров

6-меры микрочипа, образующие при гибридизации с флуоресцентно меченым фрагментом ДНК совершенные дуплексы, интенсивно светятся. Такие соседствующие 6-меры перекрываются на пять нуклеотидов; это перекрывание позволяет однозначно восстановить нуклеотидную последовательность ДНК

В поисках новых подходов к секвенированию ДНК нами, а также независимо двумя другими группами в Англии и Сербии было предложено в 1988 г секвенирование гибридизацией. В этом методе секвенирование проводится не отдельными нуклеотидами, а словами в составе полного "словаря" нуклеотидных слов определенной величины. Такой словарь может содержать все возможные 4096 гексануклеотидов, т.е. шестибуквенных генетических слов. Для нас стала очевидной необходимость создания микрочипов, и в следующем году появилась первая статья, описывающая приготовление и свойства предложенных нами гелевых микрочипов. Позднее нами были созданы полные микрочипные гексануклеотид-ные словари. С этого момента и по настоящее время наша группа сконцентрировалась на развитии биочипов: создании ДНКовых, белковых и клеточных биочипов, на развитии технологий их производства и на их применении в фундаментальных исследованиях и их различных приложениях в медицине, биотехнологии и др. областях. Эти исследования рассмотрены в обзорной работе.

Рис. 2 показывает такой полный 6-мерный олигонуклеотидный микрочип и секвенирование на нем 50-нуклеотидного фрагмента ДНК. Для приведенного случая идентификация всех 6-меров, комплементарных к ДНК, и перекрывание соседних 6-меров на пять нуклеотидов позволяет восстановить полную нуклеотидную последовательность ДНК. В действительности метод в данном варианте работает только в части случаев, его широкому применению должно предшествовать решение ряда экспериментальных проблем, которые будут рассмотрены далее. .

ГЕЛЕВЫЕ БИОЧИПЫ, ИХ СВОЙСТВА, ПРОИЗВОДСТВО И АНАЛИЗ

Своеобразием и отличием развиваемых нами биочипов является то, что они представляют собой полусферические капли гидрогеля, фиксированные химической связью на поверхности стекла, пластика или силикона. Различные биомолекулы равномерно распределяются и иммобилизуются химическими связями в объеме геля. Иммобилизация не на двумерной поверхности, а в трехмерном объеме геля дает ряд существенных преимуществ. В десятки и сотни раз увеличивается емкость биочипа на единицу поверхности и соответственно увеличивается чувствительность измерений. Иммобилизованные макромолекулы как бы фиксированы в гомогенной водной среде, составляющей около 95% объема геля. Это исключает их взаимодействие как друг с другом, так и с твердой поверхностью, где гетерофазные процессы с участием фиксированных на ней биомолекул протекают более сложным образом. Это особенно существенно для белковых чипов, поскольку молекулы белков имеют тенденцию денатурации в интерфазе, образованной между твердой поверхностью и водной средой. Наконец, гелевые элементы на воздухе или под маслом превращаются как бы в изолированные микро- и нанолитровые пробирки, в каждой из которых можно проводить индивидуально различные специфические взаимодействия, химические и ферментативные реакции. Благодаря этому гелевые биочипы объединяют в себе свойства и микроматриц и микролабораторий.

Технология производства гелевых биочипов прошла три этапа развития.

Громоздкая и малоэффективная технология первого поколения состояла из пяти стадий и была разработана и запатентована в ИМБ в 1989-1993 гг. Она была перенесена в совместную биочипную лабораторию, организованную ИМБ и Аргонской национальной лабораторией (АНЛ, США) в 1994-2000 гг. и стала технологией первого поколения, была лицензирована американскими фирмами "Моторолой" и "Пакардом". Однако из-за ее несовершенства фирмы стали производить биочипы не как микроматрицы гелевых элементов, а как сплошную поверхность полиакриламидного геля.

В ИМБ за последние три года разработаны технологии производства биочипов второго и третьего поколения. Технология второго поколения состоит из трех этапов: модификация иммобилизуемых биополимеров мономерными группами геля, нанесение раствора этих веществ в смеси с мономерными звеньями геля с помощью игольчатого или пьезоэлектрического робота и, наконец, фотоиндуцированная сополимеризация свободных и связанных с биополимерами молекул мономера. Это приводит к равномерной иммобилизации веществ во всем объеме геля. В еще более простой двухэтапной технологии третьего поколения первая и третья стадии получения биочипов объединены с помощью своеобразной химической реакции.

Достаточно простая, универсальная и дешевая технология третьего поколения позволяет производить даже в лабораторных условиях сотни и в скором будущем тысячи олигонуклеотидных, ДНКовых или белковых микрочипов в день. Разработан также метод получения сополимеризацией микрочипов с размерами гелевых микроячеек до 5х5х5 мкм. Биочипы содержат от десятков до нескольких тысяч гелевых элементов с иммобилизованными в них соединениями. Элементы микрочипа представляют собой гидрогелевые полусферы (диаметром около 100 мкм), находящиеся на расстоянии 250 мкм друг от друга на гидрофобизованной поверхности стекла. Одноцепочечные ДНК длиной до 200-300 нуклеотидов и белки с массой до 150 кД легко и достаточно быстро диффундируют в гидрогелевые элементы микрочипов специально разработанного состава. Сам биочип помещен в реакционную камеру с капиллярным входом и выходом, в которой можно проводить различные процессы в строго контролируемых условиях.

АНАЛИЗ БИОЧИПОВ

Регистрация происходящих на биочипах процессов осуществляется с помощью флюоресцент-ных, а также в некоторых случаях хемилюминис-центных и масс-спектрометрических методов. Для количественного флюоресцентного анализа нами были разработаны совместно с РНЦ "Государственный оптический институт им. С.И. Вавилова" флюоресцентные широкопольные высоко-апертурные микроскопы, снабженные ПЗС-камерой и компьютером. Прибор позволяет проводить в реакционной камере количественный анализ в реальном времени сразу всех элементов биочипа в автоматическом режиме, одновременно при четырех длинах волн, при заданной или меняющейся температуре. Более 20 таких достаточно дорогих исследовательских анализаторов биочипов поставлены в лаборатории России и США. Для клиник нами разработан более простой и дешевый лазерный анализатор. Он позволяет проводить количественную регистрацию флюоресценции одновременно со всего биочипа с помощью более простой ПЗС-камеры и обрабатывать результаты на прилагаемом портативном компьютере с помощью специально созданных программ.

Хемилюминисцентные методы, хотя и уступают по чувствительности люминесцентным, позволяют значительно упростить и удешевить регистрирующую аппаратуру. Кроме того, разработан специальный метод прямого анализа соединений непосредственно в гелевых элементах с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии. Этот важный в протеомике метод позволяет проводить дополнительную идентификацию взаимодействующих с биочипами соединений по их массе.

ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ И ДНКовые МИКРОЧИПЫ

Процесс комплементарных взаимодействий двух нитей ДНК (гибридизация) осложняется существенно меньшей стабильностью совершенного дуплекса А-Т по сравнению с G-C дуплексом и неодинаковым дестабилизирующим эффектом различных неправильных пар оснований. Поэтому в некоторых типах экспериментов была введено измерение кривых плавления, то есть количественной регистрации флюоресценции параллельно во всех ячейках микрочипа в градиенте повышающейся температуры. Это позволяет вычислить термодинамические параметры образования дуплексов: свободную энергию, энтропию и энтальпию. Проведение таких исследований на производимых нами микрочипах, содержащих всевозможные 6-мерные нуклеотиды (всего их 4096), открывает уникальные возможности. Сейчас измеряются термодинамические параметры для 4096 совершенных гексамерных дуплексов и 73728 дуплексов, содержащих всевозможные неправильные пары оснований во всех положениях гексануклеотидов. Составление полного каталога термодинамических параметров гексамерных дуплексов позволит создать более точную теорию гибридизации и оценить влияние на гибридизацию первичной и вторичной структур в ДНК. Эта теория необходима для практических работ с ДНК и, в свою очередь, будет способствовать завершению развития метода секвенирования ДНК гибридизацией.

Для широкого применения секвенирования ДНК гибридизацией с полными, например 6-мерными или более сложными, микрочипами требуется решение ряда проблем. Важной задачей является надежная дискриминация совершенных и неправильных дуплексов, образующихся на био-чипе, что затруднено различиями в стабильности А-Т и G-C пар оснований. Измерение кривых плавлений дуплексов и применение алгоритмов, вычисляющих поверхность под кривой плавления для каждого дуплекса, увеличивают надежность анализа. Другим серьезным препятствием является частое присутствие в ДНК повторяющихся гексануклеотидных и более длинных последовательностей. Эту частоту можно оценить количественно, измеряя и сравнивания интенсивности флуоресценции различных элементов биочипа.

Гибридизация с полным 6-мерным биочипом становится привлекательным методом для выявления известных и открытия новых мутаций и нуклеотидного полиморфизма в участках ДНК с известной структурой. Последовательная гибридизация с одним и тем же полным биочипом двух фрагментов одного и того же участка генома с известной и анализируемой структурой позволяет выявить различия во флюоресцентной картине и установить структуру и положение измененного основания в ДНК. Таким методом можно выявлять присутствие патогенных мутантов в стандартном штамме полиовируса, используемого как полиомиелитная вакцина.

Полные 6-мерные биочипы были также использованы для выявления специфичности ДНК-связывающихся соединений к определенным нуклеотидным последовательностям. Таким способом была изучена специфичность гистоноподоб-ного бактериального белка HU, низкомолекулярного красителя Хекст 33258, а также белка р50, являющегося регулятором транскрипции и трансляции и открытого группой академика Л.П. Овчинникова (рис. 3).

Рис. 3. Идентификация узнавания белком Р50 специфичных участков в ДНК

Флуоресцентно окрашенный белок Р50 связывается с полным 6-мерным олигонуклеотидным микрочипом. Проводиться измерение флуоресценции белка на каждом элементе биочипа в градиенте повышающейся температуры и ТD -температур плавления комплексов белка с олигонуклеотидами. Олигонуклеотиды микрочипа, проявляющие наибольшую температурную стабильность в комплексе с ДНК, локализованные в светлом кресте и содержащие тетрануклеотидные последовательности TGGT и GGTC, демонстрируют также и наибольшую специфичность связывания

Гибридизация с олигонуклеотидными микрочипами служит для качественной и количественной идентификации нуклеиновых кислот и для анализа структурных вариаций в них. Рибосомы присутствуют во всех живых клетках, а рибосомальные РНК являются одними из наиболее эволюционно консервативных макромолекул. Вместе с тем в рибосомальных РНК существуют несколько вариабельных участков. Различия в нуклеотидной последовательности этих участков применяются для идентификации микроорганизмов и для прослеживания их эволюции. Нами разработан ряд микрочипов для экспрессного метода идентификации нитрифицирующих бактерий, бактерий групп Bacillus и архебактерий. Присутствие рибосомальных РНК в клетке в количестве тысяч копий позволяет проводить анализ в ряде случаев без их амплификации. Разработана также простая система выделения рибосомальных РНК и их флюоресцентного мечения на одной и той же колонке, что позволило создать биочипный экспресс-метод анализа таких типов биологического оружия, как сибирская язва. Мы изучаем также возможность создания биогенов для идентификации всех или большей части известных микроорганизмов.

Для качественного и количественного анализа экспрессии генов и содержания различных информационных РНК существует несколько зарубежных коммерческих биочипных систем. Гелевые микрочипы были использованы нами также для анализа мРНК, например, для идентификации хромосомных перестроек, вызывающих восемь различных типов лейкемий. Соответствующая микрочипная диагностика лейкемий внедрена в Детском республиканском гематологическом центре.

Олигонуклеотидные микрочипы являются эффективным подходом для одновременной идентификации от десятков до тысяч генов и их структурного анализа, для выявления специфичных нуклеотидных последовательностей и нуклеотидных вариаций в их структуре. Однако когда гены присутствуют в геноме в количестве одной или нескольких копий, требуется их предварительная амплификация. Наиболее эффективным методом амплификации ДНК является полимеразная цепная реакция, в процессе которой происходит экспоненциальное увеличение количества молекул ДНК от нескольких до миллионов и более копий, достаточных для проведения их гибридизационного анализа.

В более традиционном и простом подходе амплификация ДНК и гибридизация амплифицированной ДНК с биочипом проводятся в две отдельные стадии. Такие двухстадийные методы были разработаны нами в совместных исследованиях с рядом российских и зарубежных лабораторий для идентификации мутаций в b-глобиновом гене, вызывающем наследственное заболевание b-талассемию, определения аллелей в гене гистосовместимости HLA DQAI, нуклеотидного полиморфизма в гене m-опиоидного рецептора, обуславливающего, вероятно, склонность к наркомании, определения ряда бактериальных генов, ответственных за резистентность к антибиотикам и синтез некоторых токсинов.

Гибридизация амплифицированной ДНК с reлевыми биочипами нашла применение в практике для идентификации мутаций, ответственных за резистентность туберкулезных бацилл к одному из основных противотуберкулезных препаратов - рифампицину. Этот метод прост, недорог и ускоряет анализ от нескольких недель до 1 дня. Метод был разработан совместно с Московским научно-практическим центром борьбы с туберкулезом и ГНЦ вирусологии и биотехнологии "Вектор" и опробован более чем на 150 больных в ряде клиник. Налажен коммерческий выпуск таких наборов для анализа, содержащих олигонуклеотидные микрочипы, компоненты для амплификации ДНК, включая синтетические флюоресцентно меченные олигонуклеотиды, клинический анализатор биочипов с портативным компьютером и программой для автоматического анализа биочипов. Этот метод нетрудно адаптировать для обнаружения многих других микроорганизмов, генов лекарственной резистентности и синтеза токсинов, а также для идентификации различных мутаций в вирусах, микроорганизмах, животных (включая человека) и растениях. Введение соответствующих изменений, необходимых для выполнения этих задач, можно провести за короткое время - от нескольких недель до нескольких месяцев.

В двух других разработанных методах гибридизацию на микрочипе объединяют с амплификацией на микрочипе в одну стадию, что ускоряет и упрощает анализ. Во втором методе амплификация происходит параллельно в растворе в реакционной камере и в гелевых элементах микрочипа, содержащих иммобилизованные и участвующие в амплификации олигонуклеотиды (праймеры). Такой подход был был использован для сокращения идентификации туберкулезной бациллы до 2 часов и определения ее резистентности сразу к двум лекарственным препаратам - рифампицину и изониазиду. В методе используется также аллель-специфичная амплификация, протекающая на иммобилизованных в геле олигонуклеотидах. Помимо этого, мутации и полиморфные нуклеотиды могут выявляться с помощью ферментативных реакций удлинения иммобилизованных на чипе олигонуклеотидов на один нуклеотид и их соединения с другими олигонуклеотидами - лигирования.

В третьем методе амплификация происходит исключительно в гелевых элементах микрочипа, используемых в этом случае как пробирки объемом от нескольких нанолитров до долей микролитра. Каждая из этих гелевых нанопробирок содержит необходимые для амплификации два и более специфических олигонуклеотида. Метод пока достаточно сложен в исполнении и требует дальнейшей доработки. Однако его реализация позволит анализировать на одном биочипе и в одном эксперименте тысячи полиморфных нуклео-тидов в геноме, что позволит использовать его для массового скрининга популяций. Известно, что полиморфизм примерно 3 млн. нуклеотидов из 3 млрд., составляющих человеческий геном, отличает одного человека от другого. Полиморфизм отвечает за наследственные дефекты и патологии, предрасположенность ко многим заболеваниям, в том числе злокачественным, и определяет многие Другие генетически заданные особенности человека. Поэтому создание простого и эффективного микрочипного анализа полиморфизма сразу по многим участкам для каждого индивидума приблизит человека к цели "Познай самого себя", начертанной приблизительно 2500 лет назад на стене Дельфийского храма в Греции.

Биочипы, разработанные для идентификации некоторых патогенных бактерий, вирусов и биологического оружия, а также для обнаружения мутаций, вызывающих раковые заболевания а - вируса натуральной оспы, осповакцины, оспы коров;

б - сибирской язвы, чумы, бруцеллеза на одном чипе;

в - детекция патогенов в донорской крови;

г - мутации в ген brcal, ответственных за возникновение рака молочной железы;

д - транслокаций при лейкозах

Некоторые из этих биочипов могут быть использованы для быстрого и чувствительного выявления биологического оружия, оспы, сибирской язвы и других подобного рода болезней.

Технология производства микрочипов позволяет с небольшими изменениями получать как олигонуклеотидные и ДНКовые, так и белковые микрочипы, содержащие ферменты, антитела, антигены и т.д. Стабилизирующий эффект иммобилизации в геле позволяет хранить большинство белковых микрочипов в течение месяцев без потери функциональной активности.

В сотрудничестве с лабораториями членов-корреспондентов РАН Е.В. Гришина и В.А. Несмеянова (ИБХ, РАН), а также А.Ю. Барышникова (Онкоцентр РАМН) нами было продемонстрировано эффективное применение белковых гелевых чипов для количественной диагностики ряда токсинов, а также раковых антигенов и антител в крови пациентов. Эти начальные эксперименты свидетельствуют, что биочипы конкурентоспособны в клинической иммунодиагностике со стандартными методами.

Перспективно использование белковых чипов в бурно развивающейся протеомике. В этой связи особый интерес представляют следующие две задачи:

Качественное и количественное определение параллельно большого количества белков в клетках различных тканей или в различных функциональных состояниях, для чего можно использовать специфические антитела, как продемонстрировано на рис. 7, для количественной идентификации антигена рака простаты; в ряде стран уже развернуты программы получения большинства белков человеческих и бактериальных клеток и производства специфических антител к ним; мы надеемся использовать отечественную биочипную технологию для сотрудничества с этими программами с целью создания системы количественного определения клеточных белков;

Изучение взаимодействий клеточных белков друг с другом и другими клеточными лигандами, такими как ДНК и низкомолекулярные соединения; определение специфичности ДНК связывающихся белков с помощью полных олигонуклеотидных микрочипов описано ранее; значительно более сложной задачей является идентификация белков, специфически взаимодействующих друг с другом и лигандами, если хотя бы один компонент неизвестен; для этих случаев разработан метод идентификации связывающихся с микрочипом молекул с помощью масс-спектрометрии; на белковых микрочипах, содержащих иммобилизованные ферменты, можно проводить также кинетический анализ их субстратов и ингибиторов.

КЛЕТОЧНЫЕ МИКРОЧИПЫ

Многие прокариотические и эукариотические клетки, как известно, сохраняют свою жизнедеятельность и даже могут делиться, будучи фиксированы в гидрогеле. Это открывает ряд интересных возможностей, в том числе для создания клеточных биочипов как матричных биосенсоров для параллельного определения, например, ряда антибиотиков и ксенобиотиков. Бактериальный микрочип, содержащий иммобилизованные и резистентные к различным антибиотикам штаммы Е. сoli. Фотография прокрашенного гелевого элемента свидетельствует о распределении растущих клеток по всему объему геля. Кинетика деления и роста бактерий в геле микрочипа регистрируется окрашиванием клеток флюоресцентной краской. Рост бактерий зависит от резистентности клеток к антибиотику и его присутствия в среде. Рисунок показывает бактериальный микрочип, содержащий иммобилизованные в геле 4 штамма Е. coli, чувствительные и резистентные к антибиотикам тетрациклину, хлорамфениколу и смеси хлорамфеникола и ампициллина. Подавление роста бактерий в соответствующих элементах биочипа позволяет идентифицировать присутствие этих антибиотиков в среде. После построения калибровочной кривой содержание антибиотиков в среде может быть измерено количественно. Представляет интерес также создание микрочипов, содержащих животные и растительные клетки для определения широкого диапазона различных веществ в окружающей среде.