Bacteriófagos, aplicação em medicina.

Bacteriófagos. Aplicação em prática médica.

Os bacteriófagos são vírus bacterianos capazes de penetrar especificamente nas células bacterianas, reproduzindo-as e causando lise.

Eles são encontrados onde quer que existam bactérias - no solo, na água, trato intestinal pessoa. O fago possui todas as características biológicas características dos vírus.

Morfologia dos fagos:

Os fagos variam em forma - filamentosos, esféricos, cúbicos, fagos com cabeça e cauda (assemelham-se a um espermatozoide).

Por tamanho - pequeno, médio e grande.

As estruturas mais complexas são fagos grandes, constituídos por uma cabeça e uma cauda. A cabeça tem o formato de um icosaedro. A cabeça é conectada ao processo por meio de uma coleira e guarda-chuva. No interior do processo existe uma haste cilíndrica oca que se comunica com a cabeça; na parte externa, o processo possui uma bainha protéica capaz de se contrair; o processo caudal termina em uma placa basal hexagonal com espinhos curtos, de onde se estendem estruturas fibrilares semelhantes a fios. . A placa e os espinhos contêm lisozima. O processo possui 6 vilosidades, que fornecem fixação apertada fago para célula bacteriana. Pode haver fagos com bainha não contrátil, fagos com processos curtos, fagos com processo análogo e fagos sem processo.

Composição química:

Resistência aos fagos: os fagos toleram temperaturas de 50-60°C. Eles podem resistir ao congelamento e morrer a uma temperatura de 70°C. Eles não são afetados por venenos como cianeto, flúor, clorofórmio e fenol. Os fagos são bem preservados em ampolas seladas, mas podem ser destruídos por fervura, exposição a ácidos ou irradiação UV.

O mecanismo de interação dos fagos com uma célula microbiana:

Com base em suas interações, os fagos virulentos e temperados são diferenciados.

Fagos virulentos - penetram na célula bacteriana, reproduzem-se e causam lise da bactéria.

Os fagos com um processo e uma bainha contratante possuem uma série de características:

Esses fagos são adsorvidos na superfície da célula bacteriana usando fibrilas de processo na presença de receptores apropriados. Em seguida, a enzima ATPase é ativada, o que leva à contração da bainha do processo caudado e à introdução de um bastão oco na célula. Uma enzima, a lisozima, está envolvida no processo de perfuração das paredes celulares.

O DNA do fago passa pela haste oca do apêndice e é injetado na célula. O capsídeo e o processo permanecem na superfície celular. Então ocorre a reprodução das proteínas e ácido nucleico fago dentro da célula. A próxima etapa é a montagem e formação de partículas fágicas maduras. O estágio final: lise celular e liberação de partículas fágicas maduras. A lise pode ocorrer tanto por dentro - a parede celular se rompe e os fagos maduros são liberados no ambiente externo quanto por fora - os fagos fazem muitos buracos na parede celular através dos quais o conteúdo celular flui, com essa lise o fago não multiplicar.

Os fagos moderados não lisam todas as células da população; eles entram em simbiose com algumas células, como resultado da integração do DNA do fago no cromossomo celular. Neste caso, o genoma do fago é denominado profago.

O profago passa a fazer parte do cromossomo da célula e, durante sua reprodução, replica-se de forma síncrona com o genoma da célula, sem causar sua lise e é transmitido à prole.

O fenômeno da simbiose de uma célula microbiana com um profago é denominado lisogenia.

E a cultura de bactérias contendo profago é lisogênica, esse nome reflete a capacidade do profago espontaneamente ou sob a influência de fatores ambiente passam para o citoplasma e se comportam como um fago virulento que lisa bactérias. Ao fazer a transição para uma forma virulenta, um fago temperado pode capturar parte do cromossomo de uma célula bacteriana e, após a lise, transferi-lo para outra.

Os fagos são divididos de acordo com seu espectro de ação:

1. Polivalente - bactérias relacionadas à lise (o fago da salmonela lisa apenas a salmonela).

2.Espécies (monófagos) - lisam bactérias de apenas uma espécie.

3. Específico do tipo - lisar seletivamente variantes individuais de bactérias dentro de uma espécie (patógeno Staphylococcus - 33 conjuntos).

Uso pratico:

As preparações de fagos são utilizadas para o tratamento e prevenção de infecções e seu diagnóstico. A ação dos fagos é baseada em sua estrita especificidade; cepas industriais e culturas bacterianas correspondentes são utilizadas para obter a preparação do fago.

Formas de liberação: líquido, seco, comprimidos, aerossóis, supositórios. Eles são introduzidos no corpo por via parenteral, enteral e local. Utilizado para fins terapêuticos e profiláticos de diversas doenças (disenteria, cólera, diversas doenças inflamatórias purulentas).

Diagnóstico de fagos: o princípio diagnóstico baseia-se no co-cultivo de culturas teste com fagos conhecidos e desconhecidos; o resultado é considerado positivo se houver lise da célula bacteriana. A lise pode ser observada em meios nutrientes líquidos e sólidos. Em meios nutrientes líquidos, aparece a eliminação da suspensão bacteriana e, em meios densos, formam-se áreas sem crescimento.

Tipagem de fagos: determinação da variante tipo de uma espécie usando um conjunto de fagos tipo. São produzidos fagos tifóides, fagos para diagnóstico de cólera, fagos de salmonela e fagos de disenteria. A tipagem de fagos é necessária ao realizar análise epidemiológica doenças e para estabelecer a origem e as vias de transmissão. Ao detectar o fago, o conteúdo dos microrganismos correspondentes é avaliado.

Em meados do século passado, a ciência biológica deu um passo revolucionário, estabelecendo a base molecular para o funcionamento dos sistemas vivos. Os bacteriófagos, descobertos no início do século passado, desempenharam um papel importante nas pesquisas bem-sucedidas que levaram à determinação da natureza química das moléculas hereditárias, à decifração do código genético e à criação de tecnologias para manipulação de genes. Hoje, esses vírus bacterianos dominaram muitas “profissões” úteis para os seres humanos: eles são usados ​​não apenas como seguros drogas antibacterianas, mas também como desinfetantes e até como base para a criação de nanodispositivos eletrônicos.

Quando na década de 1930 um grupo de cientistas abordou os problemas do funcionamento dos sistemas vivos, depois na busca pelos modelos mais simples aos quais prestaram atenção bacteriófagos- bactérias vírus. Afinal, entre objetos biológicos não há nada mais simples que os bacteriófagos; além disso, eles podem ser cultivados e analisados ​​com facilidade e rapidez, e os programas genéticos virais são pequenos.

Um fago é uma estrutura natural de tamanho mínimo que contém um programa genético compactado (DNA ou RNA), no qual não há nada supérfluo. Este programa está contido em um invólucro de proteína equipado com conjunto mínimo dispositivos para sua entrega dentro da célula bacteriana. Os bacteriófagos não podem se reproduzir por si próprios e, nesse sentido, não podem ser considerados objetos vivos completos. Seus genes passam a atuar apenas nas bactérias, utilizando os sistemas biossintéticos disponíveis na célula bacteriana e as reservas de moléculas necessárias à síntese. No entanto, os programas genéticos destes vírus não diferem fundamentalmente dos programas de organismos mais complexos, pelo que as experiências com bacteriófagos permitiram estabelecer os princípios fundamentais da estrutura e funcionamento do genoma.

Posteriormente, esse conhecimento e os métodos desenvolvidos durante a pesquisa tornaram-se a base para o desenvolvimento de tecnologias biológicas e Ciência médica, bem como uma ampla gama de aplicações biotecnológicas.

Combatentes de patógenos

As primeiras tentativas de utilização de bacteriófagos para o tratamento de doenças infecciosas foram feitas quase imediatamente após a sua descoberta, mas a falta de conhecimento e as biotecnologias imperfeitas da época não permitiram alcançar o sucesso total. No entanto, a prática clínica adicional mostrou a possibilidade fundamental de uso bem-sucedido de bacteriófagos em doenças infecciosas do trato gastrointestinal, aparelho geniturinário, em condições sépticas purulentas agudas de pacientes, para o tratamento infecções cirúrgicas etc.

Em comparação com os antibióticos, os bacteriófagos apresentam uma série de vantagens: não causam efeitos secundários e também são estritamente específicos para certos tipos de bactérias, pelo que a sua utilização não perturba o microbioma humano normal. Porém, essa alta seletividade também cria problemas: para tratar um paciente com sucesso, é necessário conhecer exatamente o agente infeccioso e selecionar o bacteriófago individualmente.

Os fagos também podem ser usados ​​profilaticamente. Assim, o Instituto de Pesquisa de Epidemiologia e Microbiologia de Moscou leva o seu nome. G. N. Gabrichevsky desenvolveu um produto preventivo “FUDFAG” baseado em um coquetel de bacteriófagos, que reduz o risco de contrair infecções intestinais agudas. Pesquisas clínicas mostrou que tomar o medicamento por uma semana permite que você se livre da hemolisante Escherichia coli e de outras doenças patogênicas e oportunistas bactéria patogênica, causando disbiose intestinal.

Os bacteriófagos são usados ​​​​para tratar doenças infecciosas não apenas em humanos, mas também em animais domésticos e de fazenda: mastite em vacas, colibacilose e escheriquiose em bezerros e porcos, salmonelose em galinhas... É especialmente conveniente usar preparações de fagos no caso de aquicultura - para tratamento de peixes e camarões cultivados industrialmente, pois duram muito tempo na água. Os bacteriófagos também ajudam a proteger as plantas, embora o uso de tecnologias de fagos neste caso seja difícil devido ao impacto fatores naturais, como luz solar e chuva, destrutiva para vírus.

Os fagos podem desempenhar um grande papel na manutenção da segurança microbiológica dos produtos alimentares, uma vez que a utilização de antibióticos e agentes químicos na indústria alimentar não resolve este problema, ao mesmo tempo que reduz o nível de limpeza ambiental dos produtos. A gravidade do problema em si é evidenciada por dados estatísticos: por exemplo, nos EUA e na Rússia, são registrados anualmente até 40 mil casos de salmonelose, dos quais 1% morre. A propagação desta infecção está em grande parte associada à criação, processamento e consumo de vários tipos de aves, e as tentativas de utilização de bacteriófagos para combatê-la têm mostrado resultados promissores.

Sim, uma empresa americana Intralytix produz preparações de fagos para combater listeriose, salmonelose e contaminação bacteriana por E. coli. Eles são aprovados para uso como aditivos que previnem o crescimento de bactérias nos alimentos - são pulverizados em produtos cárneos e avícolas, bem como em vegetais e frutas. Experimentos mostraram que um coquetel de bacteriófagos pode ser usado com sucesso no transporte e venda de peixes vivos de lago para reduzir a contaminação bacteriana não apenas da água, mas também do próprio peixe.

Uma aplicação óbvia de bacteriófagos é desinfecção, ou seja, a destruição de bactérias em locais onde não deveriam estar: em hospitais, em produção de alimentos etc. Para este efeito, a empresa britânica Fago Fixo desenvolveram um método para fixação de preparações de fagos em superfícies, garantindo a preservação da atividade biológica dos fagos por até três anos.

Bacteriófagos – “drosófila” da biologia molecular

Em 1946, no 11º simpósio no famoso laboratório americano em Cold Spring Harbor, foi proclamada a teoria de “um gene - uma enzima”. O bacteriologista A. Hershey e o “ex” físico e biólogo molecular M. Delbrück relataram a troca de características genéticas entre vários fagos enquanto infectam simultaneamente células de E. coli. Esta descoberta, feita numa altura em que o portador físico do gene ainda não era conhecido, indicava que o fenómeno da “recombinação” - a mistura de características genéticas - é característico não só dos organismos superiores, mas também dos vírus. A descoberta deste fenômeno permitiu posteriormente estudar detalhadamente mecanismos moleculares replicação. Posteriormente, experimentos com bacteriófagos permitiram estabelecer os princípios de estrutura e funcionamento dos programas genéticos.

Em 1952, A. Hershey e M. Chase provaram experimentalmente que a informação hereditária do bacteriófago T2 não é codificada em proteínas, como muitos cientistas acreditavam, mas em moléculas de DNA (Hershey & Chase, 1952). Os pesquisadores acompanharam o processo de reprodução em dois grupos de bacteriófagos, um dos quais carregava proteínas marcadas radioativamente e o outro carregava moléculas de DNA. Após a infecção das bactérias com esses fagos, descobriu-se que apenas o DNA viral foi transferido para a célula infectada, o que serviu como prova de seu papel no armazenamento e transmissão de informações hereditárias.

No mesmo ano, os geneticistas americanos D. Lederberg e N. Zindler, em experimento envolvendo duas cepas de Salmonella e o bacteriófago P22, estabeleceram que o bacteriófago é capaz de incorporar fragmentos de DNA da bactéria hospedeira durante o processo de reprodução e transmiti-los a outras pessoas. bactérias durante a infecção (Zinder & Lederberg, 1952). Este fenômeno de transferência de genes de uma bactéria doadora para uma receptora tem sido chamado de “transdução”. Os resultados do experimento foram mais uma confirmação do papel do DNA na transmissão de informações hereditárias.

Em 1969, A. Hershey, M. Delbrück e o seu colega S. Luria tornaram-se laureados com o Nobel “pelas suas descobertas relativas ao mecanismo de replicação e à estrutura genética dos vírus”.

Em 1972, R. Bird e colegas, ao estudarem o processo de replicação (cópia de informações celulares) do DNA de E. coli, utilizaram bacteriófagos como sondas capazes de se integrar ao genoma de uma célula bacteriana e descobriram que o processo de replicação ocorre em dois direções ao longo do cromossomo (Stent, 1974).

Sete dias de criação

Os métodos modernos de biologia sintética tornam possível não apenas introduzir várias modificações nos genomas dos fagos, mas também criar fagos ativos completamente artificiais. Tecnologicamente isso não é difícil, basta sintetizar o genoma do fago e introduzi-lo na célula bacteriana, e aí iniciará todos os processos necessários à síntese de proteínas e à montagem de novas partículas fágicas. Nos laboratórios modernos este trabalho levará apenas alguns dias.

Modificações genéticas são usadas para alterar a especificidade dos fagos e aumentar sua eficiência. ação terapêutica. Para fazer isso, os fagos mais agressivos são equipados com estruturas de reconhecimento que os ligam à bactéria alvo. Além disso, genes que codificam proteínas que são tóxicas para as bactérias e perturbam o metabolismo são adicionalmente inseridos nos genomas virais; tais fagos são mais letais para as bactérias.

As bactérias possuem vários mecanismos de defesa contra antibióticos e bacteriófagos, um deles é a destruição dos genomas virais Enzimas de restrição, agindo em sequências de nucleotídeos específicas. Para aumentar a atividade terapêutica dos fagos, devido à degenerescência do código genético, é possível “reformatar” as sequências dos seus genes de forma a minimizar o número de sequências de nucleótidos “sensíveis” às enzimas, preservando simultaneamente suas propriedades de codificação.

Uma forma universal de proteger as bactérias de todas as influências externas - a chamada biofilmes, filmes de DNA, polissacarídeos e proteínas que as bactérias criam juntas e onde nem os antibióticos nem as proteínas terapêuticas penetram. Esses biofilmes são uma dor de cabeça para os médicos, pois contribuem para a destruição do esmalte dentário, formam-se na superfície de implantes, cateteres, articulações artificiais, bem como no trato respiratório, na superfície da pele, etc. , bacteriófagos especiais contendo o gene , codificando uma enzima lítica especial que destrói polímeros bacterianos.

Enzimas “de bacteriófago”

Atualmente, um grande número de enzimas é amplamente utilizado em biologia molecular e a engenharia genética foram descobertas como resultado de pesquisas com bacteriófagos.

Um exemplo são as enzimas de restrição, um grupo de nucleases bacterianas que digerem o DNA. No início dos anos 1950. Verificou-se que os bacteriófagos isolados das células de uma cepa de bactérias geralmente se reproduzem mal em uma cepa intimamente relacionada. A descoberta desse fenômeno significou que as bactérias possuíam um sistema para suprimir a reprodução dos vírus (Luria & Human, 1952). Como resultado, foi descoberto um sistema enzimático de modificação de restrição, com a ajuda do qual as bactérias destruíram o DNA estranho que havia entrado na célula. O isolamento de enzimas de restrição (endonucleases de restrição) deu aos biólogos moleculares uma ferramenta inestimável que lhes permitiu manipular o DNA: inserir uma sequência em outra ou cortar os fragmentos necessários da cadeia, o que levou ao desenvolvimento da tecnologia para a criação de DNA recombinante.

Outra enzima amplamente utilizada em biologia molecular é a DNA ligase do bacteriófago T4, que “reticula” as extremidades “pegajosas” e “cegas” das moléculas de fita dupla de DNA e RNA. E recentemente surgiram versões geneticamente modificadas dessa enzima com maior atividade.

A maioria das RNA ligases usadas na prática laboratorial, que “reticulam” moléculas de RNA e DNA de fita simples, também se originam de bacteriófagos. Na natureza, eles servem principalmente para reparar moléculas de RNA quebradas. Os pesquisadores costumam usar a RNA ligase do bacteriófago T4, que pode ser usada para “costurar” polinucleotídeos de fita simples em moléculas de RNA para marcá-los. Esta técnica é usada para analisar a estrutura do RNA, procurar locais de ligação do RNA com proteínas, síntese de oligonucleotídeos, etc. Recentemente, RNA ligases termoestáveis ​​isoladas de bacteriófagos rm378 e TS2126 apareceram entre as enzimas usadas rotineiramente (Nordberg Karlsson, et al. , 2010; Hjorleifsdottir, 2014).

Algumas de outro grupo de enzimas extremamente importantes, as polimerases, também foram obtidas de bacteriófagos. Por exemplo, a DNA polimerase muito “precisa” do bacteriófago T7, que encontrou aplicação em vários campos da biologia molecular, como a mutagênese dirigida ao local, mas é usada principalmente para determinar a estrutura primária do DNA.

A DNA polimerase do fago T7 quimicamente modificada foi proposta como uma ferramenta ideal para sequenciamento de DNA já em 1987 (Tabor & Richardson, 1987). A modificação desta polimerase aumentou sua eficiência várias vezes: a taxa de polimerização do DNA atinge mais de 300 nucleotídeos por segundo, podendo ser usada para amplificar grandes fragmentos de DNA. Esta enzima tornou-se a precursora da sequenase, uma enzima geneticamente modificada e otimizada para sequenciamento de DNA na reação de Sanger. A sequenase é altamente eficiente e tem a capacidade de incorporar análogos de nucleotídeos na sequência de DNA, que são usados ​​para melhorar os resultados do sequenciamento.

As principais RNA polimerases (RNA polimerases dependentes de DNA) usadas em biologia molecular - enzimas que catalisam o processo de transcrição (leitura de cópias de RNA de um molde de DNA) - também se originam de bacteriófagos. Estas incluem as RNA polimerases SP6, T7 e T3, nomeadas em homenagem aos bacteriófagos correspondentes SP6, T7 e T3. Todas essas enzimas são usadas para a síntese in vitro de transcritos de RNA antisense, sondas de RNA marcadas, etc.

O primeiro genoma de DNA completamente sequenciado foi o genoma do fago φ174, com mais de 5 mil nucleotídeos de comprimento (Sanger et al., 1977). Essa decodificação foi realizada pelo grupo do bioquímico inglês F. Sanger, criador do famoso método de sequenciamento de DNA de mesmo nome.

As polinucleotídeos quinases catalisam a transferência de um grupo fosfato de uma molécula de ATP para a extremidade 5' de uma molécula de ácido nucleico, a troca de grupos 5'-fosfato ou a fosforilação das extremidades 3' dos mononucleotídeos. Na prática laboratorial, a polinucleotídeo quinase mais utilizada é o bacteriófago T4. É comumente usado em experimentos de marcação de DNA. isótopo radioativo fósforo. A polinucleotídeo quinase também é usada para encontrar locais de restrição, impressões digitais de DNA e RNA e sintetizar substratos para DNA ou RNA ligases.

Em experimentos de biologia molecular, eles também descobrem ampla aplicação enzimas bacteriófagas, como polinucleotídeo quinase do fago T4, geralmente usadas para marcação de DNA com um isótopo de fósforo radioativo, impressão digital de DNA e RNA, etc., bem como enzimas de clivagem de DNA, que são usadas para obter modelos de DNA de fita simples para sequenciamento e análise do polimorfismo de nucleotídeos.

Utilizando métodos de biologia sintética, foi possível desenvolver bacteriófagos armados com as armas mais sofisticadas que as bactérias utilizam contra os próprios fagos. Estamos falando de sistemas CRISPR-Cas bacterianos, que são um complexo de uma enzima nuclease que cliva o DNA e uma sequência de RNA que direciona a ação dessa enzima sobre um fragmento específico do genoma viral. Um pedaço de DNA do fago, que a bactéria armazena como “memória” em um gene especial, serve como “ponteiro”. Quando um fragmento semelhante é encontrado dentro de uma bactéria, esse complexo proteína-nucleotídeo a destrói.

Tendo compreendido o mecanismo de funcionamento dos sistemas CRISPR-Cas, os investigadores tentaram equipar os próprios fagos com “armas” semelhantes, para o que introduziram no seu genoma um complexo de genes que codificam uma nuclease e abordam sequências de ARN complementares a regiões específicas de o genoma bacteriano. O “alvo” podem ser genes responsáveis ​​por múltiplos resistência a droga. Os experimentos foram um sucesso total - esses fagos atacaram as bactérias às quais estavam “sintonizados” com grande eficiência.

Antibióticos fagos

Os fagos não precisam ser usados ​​diretamente para fins terapêuticos. Ao longo de milhões de anos de evolução, os bacteriófagos desenvolveram um arsenal de proteínas específicas - ferramentas para reconhecer microrganismos alvo e manipular os biopolímeros da vítima, com base nas quais podem ser criados medicamentos antibacterianos. As proteínas mais promissoras desse tipo são as enzimas endolisinas, que os fagos usam para destruir a parede celular ao deixar a bactéria. Essas próprias substâncias são poderosos agentes antibacterianos que não são tóxicos para os humanos. A eficácia e a direção de sua ação podem ser aumentadas alterando suas estruturas de endereçamento – proteínas que se ligam especificamente a certas bactérias.

A maioria das bactérias é dividida de acordo com a estrutura de sua parede celular em gram-positivas, cuja membrana é coberta por uma camada muito espessa de peptidoglicano, e gram-negativas, nas quais uma camada de peptidoglicano está localizada entre duas membranas. O uso de endolisinas naturais é especialmente eficaz no caso de bactérias gram-positivas (estafilococos, estreptococos, etc.), uma vez que sua camada de peptidoglicano está localizada externamente. Bactérias Gram-negativas (Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, Escherichia coli, etc.) são um alvo menos acessível, uma vez que a enzima deve penetrar na membrana bacteriana externa para alcançar a camada interna de peptidoglicano.

Para superar esse problema, foram criadas as chamadas artilisinas - versões modificadas de endolisinas naturais contendo peptídeos policatiônicos ou anfipáticos que desestabilizam a membrana externa e garantem a entrega da endolisina diretamente à camada de peptidoglicano. As artilisinas apresentam alta atividade bactericida e já demonstraram sua eficácia no tratamento de otite média em cães (Briers et al., 2014).

Um exemplo de endolisina modificada que atua seletivamente sobre certas bactérias é o medicamento P128 de uma empresa canadense GangaGen Inc.. É um fragmento biologicamente ativo de endolisina combinado com lisostafina, uma molécula de proteína direcionada que se liga à superfície das células estafilocócicas. A proteína quimérica resultante tem alta atividade contra diferentes cepas de estafilococos, incluindo aquelas com multirresistência.

"Contadores" de bactérias

Os bacteriófagos servem não apenas como um agente terapêutico e “desinfetante” versátil, mas também como uma ferramenta analítica conveniente e precisa para um microbiologista. Por exemplo, devido à sua alta especificidade, são reagentes analíticos naturais para identificação de bactérias de um determinado tipo e cepa.

Na versão mais simples de tal estudo, vários bacteriófagos diagnósticos são adicionados gota a gota a uma placa de Petri com um meio nutriente semeado com uma cultura bacteriana. Se a bactéria for sensível ao fago, uma “placa” se formará neste local do “gramado” bacteriano - uma área transparente com células bacterianas mortas e lisadas.

Ao analisar a reprodução dos fagos na presença de bactérias alvo, é possível quantificar o número destas últimas. Como o número de partículas fágicas em uma solução aumentará proporcionalmente ao número de células bacterianas nela contidas, para estimar o número de bactérias basta determinar o título do bacteriófago.

A especificidade e sensibilidade de tal reação analítica são bastante elevadas e os procedimentos em si são simples de executar e não requerem equipamentos complexos. Importante, que sistemas de diagnóstico, baseados em bacteriófagos, sinalizam a presença de um patógeno vivo, enquanto outros métodos, como PCR e imunoanalítico, indicam apenas a presença de biopolímeros pertencentes a esta bactéria. Este tipo de métodos de diagnóstico é especialmente conveniente para utilização em estudos ambientais, bem como na indústria alimentar e na agricultura.

Hoje em dia, métodos especiais são utilizados para identificar e quantificar diferentes cepas de microrganismos. espécie de referência fagos. Sistemas analíticos muito rápidos, quase em tempo real, podem ser criados com base em bacteriófagos geneticamente modificados, que, ao entrarem em uma célula bacteriana, desencadeiam a síntese de proteínas repórteres fluorescentes (ou luminescentes), como luciferase. Quando os substratos necessários são adicionados a tal meio, nele aparecerá um sinal luminescente, cujo valor corresponde ao conteúdo de bactérias na amostra. Esses fagos “marcados com luz” foram desenvolvidos para a detecção de patógenos perigosos - os agentes causadores da peste, antraz, tuberculose e infecções de plantas.

É provável que com a ajuda de fagos modificados seja possível resolver um problema de longa data de importância global - desenvolver métodos baratos e rápidos para detectar patógenos de tuberculose em estágio inicial doenças. Esta tarefa é muito difícil, uma vez que as micobactérias causadoras da tuberculose são caracterizadas por um crescimento extremamente lento quando cultivadas em condições de laboratório. Portanto, o diagnóstico da doença métodos tradicionais pode se arrastar por várias semanas.

A tecnologia Phage facilita essa tarefa. Sua essência é o bacteriófago D29, que é capaz de infectar ampla variedade micobactérias. Os bacteriófagos são então separados e a amostra é misturada com uma cultura de micobactérias não patogênicas de rápido crescimento que também é sensível a esse bacteriófago. Se o sangue continha inicialmente micobactérias infectadas com fagos, então a produção de bacteriófagos também será observada na nova cultura. Desta forma, células micobacterianas isoladas podem ser detectadas e o processo de diagnóstico em si é reduzido de 2–3 semanas para 2–5 dias (Swift & Rees, 2016).

Exibição de fago

Hoje em dia, os bacteriófagos também são amplamente utilizados como sistemas simples para a produção de proteínas com propriedades específicas. Estamos falando de um desenvolvido na década de 1980. técnica de melhoramento molecular extremamente eficaz - exibição de fago. O termo foi proposto pelo americano J. Smith, que comprovou que, com base nos bacteriófagos de E. coli, é possível criar um vírus modificado viável que carregue uma proteína estranha em sua superfície. Para fazer isso, o gene correspondente é introduzido no genoma do fago, que é fundido com o gene que codifica uma das proteínas virais de superfície. Tais bacteriófagos modificados podem ser isolados de uma mistura com fagos do tipo selvagem devido à capacidade da proteína “estranha” de se ligar a anticorpos específicos (Smith, 1985).

Duas conclusões importantes surgiram dos experimentos de Smith: primeiro, o uso da tecnologia DNA recombinante, é possível criar populações extremamente diversas de 10 6 –10 14 partículas de fagos, cada uma das quais transporta diferentes variantes de proteínas na sua superfície. Essas populações foram chamadas bibliotecas combinatórias de fagos. Em segundo lugar, ao isolar um fago específico de uma população (por exemplo, um que tenha a capacidade de se ligar a uma proteína ou molécula orgânica específica), este fago pode ser propagado em células bacterianas e um número ilimitado de descendentes com propriedades específicas pode ser obtido .

Com a ajuda da exibição em fagos, agora são produzidas proteínas que podem se ligar seletivamente a alvos terapêuticos, por exemplo, aqueles expostos na superfície do fago M13, capazes de reconhecer e interagir com células tumorais. O papel dessas proteínas na partícula do fago é “embalar” o ácido nucleico, por isso são adequadas para a criação de medicamentos de terapia genética, só que neste caso formam uma partícula com um ácido nucleico terapêutico.

Hoje, existem duas áreas principais de aplicação da exibição de fagos. A tecnologia baseada em peptídeos é usada para estudar receptores e mapear locais de ligação de anticorpos, criar imunógenos e nanovacinas e mapear locais de ligação de substratos de proteínas enzimáticas. Tecnologia baseada em proteínas e domínios proteicos - para seleção de anticorpos com propriedades específicas, estudo de interações proteína-ligante, triagem de fragmentos expressos de DNA complementar e modificações direcionadas de proteínas.

Usando a exibição em fagos, é possível introduzir grupos de reconhecimento em todos os tipos de proteínas virais de superfície, bem como na proteína principal que forma o corpo do bacteriófago. Ao introduzir peptídeos com propriedades específicas em proteínas de superfície, é possível obter toda uma gama de produtos biotecnológicos valiosos. Por exemplo, se este peptídeo imitasse uma proteína vírus perigoso ou bactérias, reconhecíveis sistema imunológico, então esse bacteriófago modificado é uma vacina que pode ser produzida de forma simples, rápida e segura.

Se a proteína de superfície terminal do bacteriófago for “endereçada” às células cancerígenas, e grupos repórteres (por exemplo, fluorescentes ou magnéticos) forem ligados a outra proteína de superfície, então será obtida uma ferramenta para detecção de tumores. E se um medicamento citotóxico também for adicionado à partícula (e a química bioorgânica moderna torna isso fácil), você obterá um medicamento que tem como alvo as células cancerígenas.

Uma das aplicações importantes do método de exibição de proteínas fágicas é a criação de bibliotecas de fagos de anticorpos recombinantes, onde fragmentos de imunoglobulinas que se ligam ao antígeno estão localizados na superfície de partículas fágicas fd ou M13. Bibliotecas de anticorpos humanos são de particular interesse, uma vez que tais anticorpos podem ser utilizados em terapia sem limitação. Nos últimos anos, cerca de uma dúzia de anticorpos terapêuticos construídos utilizando este método foram vendidos apenas no mercado farmacêutico dos EUA.

Fagos "industriais"

A metodologia de exibição em fagos também encontrou uma aplicação completamente inesperada. Afinal, os bacteriófagos são, antes de tudo, partículas nanométricas de uma determinada estrutura, em cuja superfície estão localizadas proteínas, que, por meio de um phage display, podem ser “equipadas” com propriedades para se ligarem especificamente às moléculas desejadas. Tais nanopartículas abrem enormes oportunidades para a criação de materiais com uma determinada arquitectura e nanodispositivos moleculares “inteligentes”, ao mesmo tempo que as suas tecnologias de produção serão amigas do ambiente.

Como o vírus é uma estrutura bastante rígida e com certa proporção dimensional, esta circunstância permite utilizá-lo para obter nanoestruturas porosas com área superficial conhecida e distribuição desejada de poros na estrutura. Como se sabe, é a área superficial do catalisador o parâmetro crítico que determina sua eficiência. E as tecnologias que existem hoje para formar uma fina camada de metais e seus óxidos na superfície dos bacteriófagos permitem obter catalisadores com uma superfície regular extremamente desenvolvida de uma determinada dimensão. (Lee et al., 2012).

O pesquisador do MIT, A. Belcher, usou o bacteriófago M13 como modelo para o crescimento de nanopartículas e nanofios de ródio e níquel na superfície do óxido de cério. As nanopartículas de catalisador resultantes promovem a conversão de etanol em hidrogénio, pelo que este catalisador pode ser muito útil para atualizar as células de combustível de hidrogénio existentes e criar novas. Um catalisador cultivado em um modelo de vírus difere de um catalisador “regular” com uma composição semelhante em sua maior estabilidade, é menos suscetível ao envelhecimento e à desativação de superfície (Nam et al. . , 2012).

Ao revestir fagos filamentosos com ouro e dióxido de índio, foram obtidos materiais eletrocrômicos - nanofilmes porosos que mudam de cor quando o campo elétrico muda, capazes de responder às mudanças no campo elétrico uma vez e meia mais rápido que os análogos conhecidos. Materiais deste tipo são promissores para a criação de dispositivos de tela ultrafina que economizam energia (Nam et al., 2012).

No MIT, os bacteriófagos tornaram-se a base para a produção de baterias elétricas muito potentes e extremamente compactas. Para tanto, utilizamos fagos M13 vivos e geneticamente modificados, que não são perigosos para os humanos e são capazes de fixar íons de diversos metais à superfície. Como resultado da automontagem desses vírus, foram obtidas estruturas de uma determinada configuração que, quando revestidas com metal, formaram nanofios suficientemente longos que se tornaram a base do ânodo e do cátodo. Na autoformação do material anódico, foi utilizado um vírus capaz de fixar ouro e óxido de cobalto; para o cátodo, foi utilizado um vírus capaz de fixar fosfato de ferro e prata. Este último fago também tinha a capacidade, através do reconhecimento molecular, de “captar” as extremidades de um nanotubo de carbono, o que é necessário para uma transferência eficiente de elétrons.

Materiais para células solares também foram criados com base em complexos de bacteriófago M13, dióxido de titânio e nanotubos de carbono de parede única (Dang et al., 2011).

Os últimos anos foram marcados por extensas pesquisas sobre bacteriófagos, que estão encontrando novas aplicações não apenas na terapia, mas também em bio e nanotecnologias. Seu resultado prático óbvio deveria ser o surgimento de uma nova área poderosa de medicina personalizada, bem como a criação de toda uma gama de tecnologias na indústria alimentícia, medicina veterinária, agricultura e manufatura. materiais modernos. Esperamos que o segundo século de investigação sobre bacteriófagos não traga menos descobertas do que o primeiro.

Literatura
1. Bacteriófagos: biologia e aplicação / Ed.: E. Cutter, A. Sulakvelidze. M.: Mundo científico. 2012.
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4. Mc Grath S., van Sinderen D. Bacteriófago: Genética e Biologia Molecular. Imprensa Científica Horizonte, 2007.

№ 10-2013

Foto tirada com microscópio eletrônico,
mostra o processo de fixação de bacteriófagos (colífagos T1) à superfície da bactéria E. coli.

No final do século XX, tornou-se claro que as bactérias dominam sem dúvida a biosfera da Terra, representando mais de 90% da sua biomassa. Cada espécie possui muitos tipos especializados de vírus. De acordo com estimativas preliminares, o número de espécies de bacteriófagos é de cerca de 10 15 . Para compreender a escala deste número, podemos dizer que se cada pessoa na Terra descobrir um novo bacteriófago todos os dias, serão necessários 30 anos para descrever todos eles.

Assim, os bacteriófagos são as criaturas menos estudadas da nossa biosfera. A maioria dos bacteriófagos conhecidos hoje pertence à ordem Caudovirales - vírus de cauda. Suas partículas têm tamanhos de 50 a 200 nm. A cauda de diferentes comprimentos e formatos garante que o vírus se fixe na superfície da bactéria hospedeira; a cabeça (capsídeo) serve como armazenamento para o genoma. O DNA genômico codifica proteínas estruturais que formam o “corpo” do bacteriófago e proteínas que garantem a reprodução do fago dentro da célula durante a infecção.

Podemos dizer que um bacteriófago é um nanoobjeto natural de alta tecnologia. Por exemplo, caudas de fago são uma “seringa molecular” que perfura a parede de uma bactéria e, contraindo-se, injeta seu DNA na célula. A partir deste momento começa o ciclo infeccioso. Suas etapas seguintes consistem em mudar os mecanismos da atividade vital da bactéria para servir o bacteriófago, propagar seu genoma, construir muitas cópias de invólucros virais, empacotar o DNA viral nelas e, finalmente, destruir (lise) da célula hospedeira.

Um bacteriófago não é uma criatura viva, mas um nanomecanismo molecular criado pela natureza.
A cauda do bacteriófago é uma seringa que perfura a parede da bactéria e injeta DNA viral,
que é armazenado na cabeça (capsídeo), dentro da célula.

Além da constante competição evolutiva entre os mecanismos de defesa das bactérias e de ataque dos vírus, a razão do equilíbrio atual pode ser considerada o fato dos bacteriófagos se especializarem em sua ação infecciosa. Se houver uma grande colônia de bactérias, onde as próximas gerações de fagos encontrarão suas vítimas, então a destruição de bactérias por fagos líticos (matando, literalmente dissolvendo) ocorre rápida e continuamente.

Se não houver vítimas potenciais suficientes ou condições externas não são muito adequados para a reprodução eficiente de fagos, então os fagos com um ciclo de desenvolvimento lisogênico têm uma vantagem. Nesse caso, após a penetração na bactéria, o DNA do fago não desencadeia imediatamente o mecanismo de infecção, mas por enquanto existe dentro da célula em estado passivo, muitas vezes introduzindo-se no genoma bacteriano.

Nesse estado de profago, o vírus pode existir por muito tempo, passando por ciclos de divisão celular junto com o cromossomo bacteriano. E somente quando a bactéria entra em um ambiente favorável à reprodução, o ciclo lítico da infecção é ativado. Além disso, quando o ADN do fago é libertado de um cromossoma bacteriano, secções vizinhas do genoma bacteriano são frequentemente capturadas e o seu conteúdo pode subsequentemente ser transferido para a próxima bactéria que o bacteriófago infecta. Este processo (transdução genética) é considerado o meio mais importante de transferência de informações entre procariontes - organismos sem núcleo celular.

Como funciona um bacteriófago?

Todas essas sutilezas moleculares não eram conhecidas na segunda década do século XX, quando foram descobertos “agentes infecciosos invisíveis que destroem bactérias”. Mas mesmo sem o microscópio eletrônico, com o qual no final da década de 1940 foi possível obter pela primeira vez imagens de bacteriófagos, ficou claro que eles eram capazes de destruir bactérias, inclusive as patogênicas. Esta propriedade foi imediatamente procurada pela medicina.

As primeiras tentativas de tratar a disenteria com fagos, infecções de feridas, cólera, febre tifóide e até peste foram realizados com muito cuidado, e o sucesso pareceu bastante convincente. Mas após o início da produção em massa e do uso de preparações de fagos, a euforia deu lugar à decepção. Muito pouco ainda se sabia sobre o que são os bacteriófagos, como produzir, purificar e utilizar suas formas farmacêuticas. Basta dizer que, de acordo com os resultados de um teste realizado nos Estados Unidos no final da década de 1920, muitas preparações industriais de fagos não continham nenhum bacteriófago.

O problema dos antibióticos

A segunda metade do século XX na medicina pode ser chamada de “era dos antibióticos”. No entanto, mesmo o descobridor da penicilina, Alexander Fleming, alertou na sua palestra do Nobel que a resistência microbiana à penicilina ocorre muito rapidamente. Por enquanto, a resistência aos antibióticos foi compensada pelo desenvolvimento de novos tipos de medicamentos antimicrobianos. Mas desde a década de 1990, tornou-se claro que a humanidade está a perder a “corrida armamentista” contra os micróbios.

Em primeiro lugar, a culpa é da utilização descontrolada de antibióticos, não só para fins terapêuticos, mas também para para fins preventivos, não só na medicina, mas também na agricultura, na indústria alimentar e na vida quotidiana. Como resultado, a resistência a estes medicamentos começou a desenvolver-se não apenas em bactérias patogénicas, mas também nos microrganismos mais comuns que vivem no solo e na água, tornando-os “patógenos condicionais”.

Essas bactérias existem confortavelmente em instituições médicas, preenchendo encanamentos, móveis, equipamento médico, Às vezes até soluções desinfetantes. Em pessoas com sistema imunológico enfraquecido, que são a maioria nos hospitais, causam complicações graves.

Não é nenhuma surpresa que a comunidade médica esteja soando o alarme. No ano passado, em 2012, a Diretora Geral da OMS, Margaret Chan, fez uma declaração prevendo o fim da era dos antibióticos e a indefesa da humanidade contra doenças infecciosas. No entanto, as possibilidades práticas da química combinatória – a base da ciência farmacológica – estão longe de estar esgotadas. Outra coisa é que o desenvolvimento de agentes antimicrobianos é um processo muito caro e que não traz tantos lucros quanto muitos outros medicamentos. Portanto, as histórias de terror sobre “superbactérias” são mais um aviso, encorajando as pessoas a procurar soluções alternativas.

Bacteriófagos e imunidade

Como existem inúmeros bacteriófagos na natureza e eles entram constantemente no corpo humano com água, ar e alimentos, o sistema imunológico simplesmente os ignora. Existe até uma hipótese sobre a simbiose de bacteriófagos no intestino, regulando microflora intestinal. É possível obter algum tipo de resposta imunológica apenas com administração prolongada no corpo. grandes doses fagos.

Mas desta forma você pode obter alergias a quase todas as substâncias. Finalmente, é muito importante que os bacteriófagos sejam baratos. O desenvolvimento e a produção de um medicamento composto por bacteriófagos precisamente selecionados com genomas totalmente decifrados, cultivados de acordo com os padrões biotecnológicos modernos em certas cepas de bactérias em ambientes quimicamente limpos e altamente purificados, é muito mais barato do que os antibióticos complexos modernos.

Isto permite que os medicamentos terapêuticos fago sejam rapidamente adaptados às mudanças nos conjuntos de bactérias patogênicas e ao uso de bacteriófagos na medicina veterinária, onde medicamentos caros não são economicamente justificados.

No serviço médico

Parece bastante lógico ver um renascimento do interesse na utilização de bacteriófagos – os inimigos naturais das bactérias – para tratar infecções. Na verdade, durante as décadas da “era dos antibióticos”, os bacteriófagos serviram ativamente à ciência, mas não à medicina, mas à biologia molecular fundamental. Basta mencionar a decodificação dos “trigêmeos” do código genético e o processo de recombinação do DNA. Sabe-se agora o suficiente sobre bacteriófagos para informar a seleção de fagos adequados para fins terapêuticos.

Os bacteriófagos têm muitas vantagens como medicamentos potenciais. Em primeiro lugar, há uma infinidade deles. Embora mudar o aparato genético de um bacteriófago também seja muito mais fácil do que o de uma bactéria, e ainda mais em organismos superiores, isso não é necessário. Você sempre pode encontrar algo adequado na natureza. Estamos falando antes de seleção, consolidação das propriedades desejadas e reprodução dos bacteriófagos necessários.

Isso pode ser comparado com a criação de raças de cães - cães de trenó, cães de guarda, cães de caça, cães de caça, cães de luta, cães decorativos... Todos eles continuam sendo cães, mas são otimizados para um determinado tipo de ação necessária a uma pessoa. Em segundo lugar, os bacteriófagos são estritamente específicos, ou seja, destroem apenas um determinado tipo de micróbios, sem inibir a microflora humana normal.

Em terceiro lugar, quando um bacteriófago encontra uma bactéria que deve destruir, ela começa a multiplicar-se durante o seu ciclo de vida. Assim, a questão da dosagem torna-se menos aguda. Quarto, os bacteriófagos não causam efeitos colaterais. Todos os casos Reações alérgicas ao usar bacteriófagos terapêuticos, foram causados ​​​​por impurezas das quais a droga não foi suficientemente purificada ou por toxinas liberadas durante a morte massiva de bactérias. Este último fenômeno, o “efeito Herxheimer”, é frequentemente observado com o uso de antibióticos.

Dois lados da moeda

Infelizmente, os bacteriófagos médicos também apresentam muitas desvantagens. A maioria o problema principal decorre da vantagem da alta especificidade dos fagos. Cada bacteriófago infecta um tipo de bactéria estritamente definido, nem mesmo uma espécie taxonômica, mas uma série de variedades e cepas mais restritas. Relativamente falando, é como se um cão de guarda começasse a latir apenas para bandidos de dois metros de altura vestidos com capas de chuva pretas e não reagisse de forma alguma a um adolescente de shorts entrando na casa.

Portanto, não é incomum que as atuais preparações de fagos falhem aplicação eficaz. Um medicamento feito contra um determinado conjunto de cepas e que trata perfeitamente a dor de garganta estreptocócica em Smolensk pode ser impotente contra todos os sinais da mesma dor de garganta em Kemerovo. A doença é a mesma, causada pelo mesmo micróbio, e as cepas de estreptococos em diferentes regiões são diferentes.

Para o uso mais eficaz do bacteriófago, é necessário um diagnóstico preciso do micróbio patogênico, até a cepa. O método diagnóstico mais comum atualmente, a cultura, leva muito tempo e não fornece a precisão necessária. Métodos rápidos - digitação usando polimerase reação em cadeia ou espectrometria de massa - estão sendo implementadas lentamente devido ao alto custo dos equipamentos e às maiores exigências de qualificação dos técnicos de laboratório. Idealmente, a seleção dos componentes fágicos de um medicamento poderia ser feita contra a infecção de cada paciente individual, mas isto é caro e inaceitável na prática.

Outra desvantagem importante dos fagos é a sua natureza biológica. Além do fato de que os bacteriófagos necessitam condições especiais armazenamento e transporte, este método de tratamento abre espaço para muita especulação sobre o tema “DNA estranho em humanos”. E embora se saiba que um bacteriófago, em princípio, não pode infectar uma célula humana e nela introduzir seu DNA, não é fácil mudar a opinião pública.

A natureza biológica e o tamanho bastante grande, em comparação com medicamentos de baixo peso molecular (os mesmos antibióticos), levam a uma terceira limitação - o problema de entrega do bacteriófago no corpo. Se uma infecção microbiana se desenvolver onde o bacteriófago pode ser aplicado diretamente na forma de gotas, spray ou enema - na pele, feridas abertas, queimaduras, mucosas da nasofaringe, ouvidos, olhos, intestino grosso - então não há problemas.

Mas se a infecção ocorrer em órgãos internos, a situação é mais complicada. São conhecidos casos de tratamento bem-sucedido de infecções renais ou do baço com a administração oral usual de um medicamento bacteriófago. Mas o mecanismo de penetração de partículas fágicas relativamente grandes (100 nm) do estômago para a corrente sanguínea e órgãos internos é pouco compreendido e varia muito de paciente para paciente. Os bacteriófagos também são impotentes contra os micróbios que se desenvolvem dentro das células, por exemplo, os agentes causadores da tuberculose e da lepra. Atraves da parede célula humana o bacteriófago não consegue passar.

Deve-se notar que o uso de bacteriófagos e antibióticos para fins médicos não deve ser contestado. Quando agem juntos, observa-se um aumento mútuo do efeito antibacteriano. Isto permite, por exemplo, reduzir a dose de antibióticos para valores que não provocam efeitos secundários significativos. Consequentemente, o mecanismo para as bactérias desenvolverem resistência a ambos os componentes do medicamento combinado é quase impossível.

A expansão do arsenal de medicamentos antimicrobianos proporciona mais liberdade na escolha dos métodos de tratamento. Assim, o desenvolvimento com base científica do conceito de utilização de bacteriófagos em terapia antimicrobiana- uma direção promissora. Os bacteriófagos servem não tanto como alternativa, mas como complemento e aprimoramento no combate às infecções.

Os bacteriófagos na prática médica são utilizados no diagnóstico, tratamento e prevenção de doenças infecciosas.

R. No diagnóstico, o bacteriófago é utilizado no método de pesquisa cultural para determinar o tipo de cultura pura isolada, bem como para sua tipagem. O método descrito a seguir para usar um bacteriófago para indicar a presença de um determinado tipo de bactéria em um material patológico sem isolá-lo em uma cultura pura não se difundiu.

1. A reação de aumento do título de fago é baseada na capacidade de um bacteriófago específico de se replicar apenas nas células de bactérias de “sua própria” espécie. É realizado de acordo com o seguinte princípio. Uma certa quantidade de um bacteriófago específico é adicionada ao material patológico, ele é incubado em um termostato e então a quantidade de fago é novamente determinada. Se aumentou, significa que o bacteriófago “encontrou” uma célula da “sua” espécie para se replicar, portanto, bactérias da espécie desejada estão presentes no material patológico.

2. No processo de identificação de uma cultura pura, são utilizadas espécies e tipos de bacteriófagos.
A. Bacteriófagos específicos da espécie são usados ​​para indicação de fagos. A cultura pura isolada é inoculada em uma placa de ágar e uma gota de um bacteriófago específico é colocada sobre ela. Se a cultura pertencer à espécie desejada, então não haverá crescimento no local onde a gota é aplicada, caso contrário serão observados fagos no local onde a gota é aplicada. crescimento bacteriano. Às vezes, após a aplicação do bacteriófago, a placa de Petri contendo a placa de ágar é inclinada, permitindo que a gota escorra para a borda da placa (razão pela qual esse método é chamado de “gotejamento”).

b. Bacteriófagos típicos são usados ​​para tipagem de fagos. O princípio do método é o seguinte.
1. A cepa a ser digitada é inoculada em placa de ágar.
2. Em seguida, gotas de bacteriófagos típicos são colocadas sobre a superfície inoculada (cada uma em seu próprio quadrado, previamente marcado, por exemplo, com um gráfico de vidro no fundo de uma placa de Petri).
3. A placa inoculada é incubada num termóstato.
4. Leve em consideração a experiência registrando “manchas estéreis” ou “placas” - locais de falta de crescimento no local de aplicação de uma gota do bacteriófago ao qual é sensível esta opção bactérias.
5. Fagovar (fagótipo) é designado pela listagem dos fagos típicos que lisam uma determinada variante.
B. O uso de bacteriófagos (geralmente espécies) para tratamento é denominado terapia fágica. Para efeito de tratamento, os bacteriófagos são utilizados localmente (na forma de irrigação da superfície afetada, injeção no foco local do processo patológico, etc.), pois sua administração por via parenteral leva ao desenvolvimento de uma resposta imunológica para a proteína do fago estranho. Se um bacteriófago terapêutico for administrado por via oral (para tratar infecções intestinais), então é melhor usar um comprimido do medicamento, revestido com um revestimento resistente a ácidos que se dissolve em ambiente alcalino intestinos - os bacteriófagos são muito sensíveis ao pH baixo e são rapidamente inativados no ambiente ácido do estômago.
B. A profilaxia fágica é o uso de um bacteriófago (também, via de regra, específico) para prevenir o desenvolvimento de uma infecção bacteriana. Atualmente usado para profilaxia de emergência febre tifóide e disenteria (sob prevenção de emergência refere-se a um conjunto de medidas para prevenir o desenvolvimento da doença após a ocorrência do ato de infecção, ou seja, entrada do patógeno no corpo do paciente).

Bacteriófagos ou fagos (do outro grego φᾰγω “eu devoro”) são vírus que infectam seletivamente células bacterianas. Na maioria das vezes, os bacteriófagos se multiplicam dentro das bactérias e causam sua lise. Normalmente, um bacteriófago consiste em um invólucro protéico e material genético de ácido nucleico de fita simples ou dupla (DNA ou, menos comumente, RNA). O número total de bacteriófagos na natureza é aproximadamente igual ao número total de bactérias (1.030 – 1.032 partículas). Os bacteriófagos participam ativamente da circulação substancias químicas e energia, têm um efeito notável na evolução de micróbios e bactérias.A estrutura de um miovírus bacteriófago típico.

Estrutura dos bacteriófagos 1 - cabeça, 2 - cauda, ​​3 - ácido nucléico, 4 - capsídeo, 5 - “colar”, 6 - bainha protéica da cauda, ​​7 - fibrila da cauda, ​​8 - espinhos, 9 - placa basal

Os bacteriófagos diferem em estrutura química, tipo de ácido nucleico, morfologia e natureza da interação com bactérias. Os vírus bacterianos são centenas e milhares de vezes menores em tamanho que as células microbianas. Uma partícula fágica típica (vírion) consiste em uma cabeça e uma cauda. O comprimento da cauda é geralmente 2 a 4 vezes o diâmetro da cabeça. A cabeça contém material genético - RNA ou DNA de fita simples ou dupla com a enzima transcriptase em estado inativo, cercado por uma proteína ou cápsula lipoproteica - o capsídeo, que armazena o genoma fora da célula. O ácido nucleico e o capsídeo juntos formam o nucleocapsídeo. Os bacteriófagos podem ter um capsídeo icosaédrico montado a partir de múltiplas cópias de uma ou duas proteínas específicas. Normalmente, os cantos são feitos de pentâmeros de uma proteína, e o suporte de cada lado é feito de hexâmeros da mesma proteína ou de uma proteína semelhante. Além disso, os fagos podem ser esféricos, em forma de limão ou pleomórficos. A cauda, ​​​​ou apêndice, é um tubo protéico - uma continuação da casca protéica da cabeça, na base da cauda existe uma ATPase que regenera energia para a injeção de material genético. Existem também bacteriófagos com processo curto, sem processo e filamentosos.

Taxonomia dos bacteriófagos O grande número de bacteriófagos isolados e estudados determina a necessidade de sua sistematização. Isso é feito pelo Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV). Atualmente, de acordo com a Classificação Internacional e Nomenclatura de Vírus, os bacteriófagos são divididos dependendo do tipo de ácido nucléico e da morfologia. Neste momento, distinguem-se dezanove famílias. Destes, apenas dois contêm RNA e apenas cinco famílias estão envelopadas. Das famílias de vírus de DNA, apenas duas famílias possuem genomas de fita simples. Nove famílias contendo DNA possuem um genoma de DNA circular, enquanto as outras nove possuem DNA linear. Nove famílias são específicas apenas para bactérias, as nove restantes são específicas apenas para archaea e (Tectiviridae) infecta bactérias e archaea

Interação de um bacteriófago com células bacterianas Com base na natureza da interação de um bacteriófago com uma célula bacteriana, os fagos virulentos e temperados são diferenciados. Os fagos virulentos só podem aumentar em número durante o ciclo lítico. O processo de interação entre um bacteriófago virulento e uma célula consiste em vários estágios: adsorção do bacteriófago na célula, penetração na célula, biossíntese dos componentes do fago e sua montagem e liberação dos bacteriófagos da célula. Inicialmente, os bacteriófagos se ligam a receptores específicos do fago na superfície da célula bacteriana. A cauda do fago, com a ajuda de enzimas localizadas em sua extremidade (principalmente lisozima), dissolve localmente a membrana celular, se contrai e o DNA contido na cabeça é injetado na célula, enquanto a casca protéica do bacteriófago permanece do lado de fora. O DNA injetado provoca uma reestruturação completa do metabolismo celular: a síntese de DNA, RNA e proteínas bacterianas é interrompida. O DNA do bacteriófago começa a ser transcrito por meio de sua própria enzima transcriptase, que é ativada após entrar na célula bacteriana. Os primeiros são sintetizados primeiro e depois os últimos. RNAs que entram nos ribossomos da célula hospedeira, onde são sintetizadas proteínas bacteriófagas precoces (DNA polimerases, nucleases) e tardias (proteínas do capsídeo e da cauda, ​​enzimas lisozima, ATPase e transcriptase). A replicação do DNA do bacteriófago ocorre segundo um mecanismo semiconservador e é realizada com a participação de suas próprias DNA polimerases. Após a síntese das proteínas tardias e a conclusão da replicação do DNA, o processo final começa - a maturação das partículas fágicas ou a combinação do DNA do fago com a proteína do envelope e a formação de partículas fágicas infecciosas maduras

Ciclo de vida Bacteriófagos temperados e virulentos em Estágios iniciais as interações com uma célula bacteriana têm o mesmo ciclo. Adsorção de bacteriófagos em receptores celulares específicos de fagos. Injeção de ácido nucleico de fago em uma célula hospedeira. Co-replicação de fago e ácido nucleico bacteriano. Divisão celular. Além disso, o bacteriófago pode se desenvolver de acordo com dois modelos: via lisogênica ou lítica. Os bacteriófagos temperados após a divisão estão em estado de prófase (via lisogênica).Os bacteriófagos virulentos se desenvolvem de acordo com o modelo lítico: o ácido nucléico do fago direciona a síntese das enzimas do fago, usando o aparelho de síntese de proteínas da bactéria. O fago, de uma forma ou de outra, inativa o DNA e o RNA do hospedeiro, e as enzimas do fago o decompõem completamente; O RNA do fago “subordina” o aparato celular para a síntese de proteínas. O ácido nucleico do fago replica e dirige a síntese de novas proteínas do envelope. Novas partículas fágicas são formadas como resultado da automontagem espontânea do invólucro proteico (capsídeos) ao redor do ácido nucleico do fago; A lisozima é sintetizada sob o controle do RNA do fago. Lise celular: a célula explode sob a influência da lisozima; são libertados cerca de 200-1000 novos fagos; fagos infectam outras bactérias.

Aplicação Na medicina Uma das áreas de utilização dos bacteriófagos é a terapia antibacteriana, uma alternativa ao uso de antibióticos. Por exemplo, são utilizados bacteriófagos: estreptocócico, estafilocócico, klebsiella, disenteria e polialente, piobacteriófago, coli, proteus e coliproteus e outros. 13 são registrados e usados ​​na Rússia suprimentos médicos baseado em fagos. Atualmente são usados ​​para tratar Infecções bacterianas, que não são sensíveis a tratamento tradicional antibióticos, especialmente na República da Geórgia. Normalmente, o uso de bacteriófagos é acompanhado por maior sucesso do que antibióticos onde estão presentes. membranas biológicas, revestido com polissacarídeos, através dos quais os antibióticos geralmente não penetram. Atualmente, o uso terapêutico de bacteriófagos não recebeu aprovação no Ocidente, embora os fagos sejam usados ​​para matar bactérias que causam intoxicação alimentar, como a Listeria. Em muitos anos de experiência no âmbito de uma grande cidade e áreas rurais a eficácia terapêutica e profilática incomumente alta do bacteriófago da disenteria foi comprovada (P. M. Lerner, 2010). Na Rússia, as preparações terapêuticas de fagos são feitas há muito tempo; elas eram tratadas com fagos antes mesmo dos antibióticos. Nos últimos anos, os fagos têm sido amplamente utilizados após as inundações em Krymsk e Khabarovsk para prevenir a disenteria.

Em biologia, os bacteriófagos são usados ​​em Engenharia genética Como vetores que transferem seções de DNA, a transferência natural de genes entre bactérias através de certos fagos (transdução) também é possível. Os vetores fagos são geralmente criados com base no bacteriófago temperado λ, contendo uma molécula de DNA linear de fita dupla. Os braços esquerdo e direito do fago possuem todos os genes necessários para o ciclo lítico (replicação, reprodução). A parte intermediária do genoma do bacteriófago λ (contém genes que controlam a lisogenia, ou seja, sua integração no DNA de uma célula bacteriana) não é essencial para sua reprodução e tem aproximadamente 25 mil pares de bases. Esta parte pode ser substituída por um fragmento de DNA estranho. Esses fagos modificados passam por um ciclo lítico, mas a lisogenia não ocorre. Os vetores bacteriófagos λ são usados ​​para clonar fragmentos de DNA eucariótico (isto é, genes maiores) de até 23 mil pares de nucleotídeos (kb). Além disso, os fagos sem inserções têm menos de 38 kb. ou vice-versa, com inserções muito grandes - mais de 52 KB. não desenvolva ou infecte bactérias. Como a reprodução dos bacteriófagos só é possível em células vivas, os bacteriófagos podem ser usados ​​para determinar a viabilidade das bactérias. Essa direção tem grandes perspectivas, pois uma das principais questões em diversos processos biotecnológicos é a determinação da viabilidade das culturas utilizadas. Utilizando o método de análise eletro-óptica de suspensões celulares, foi mostrada a possibilidade de estudar as etapas da interação fago-célula microbiana

E também na medicina veterinária para: prevenção e tratamento doenças bacterianas pássaros e animais; tratamento de doenças inflamatórias purulentas das membranas mucosas dos olhos e da cavidade oral; prevenção de complicações inflamatórias purulentas em queimaduras, feridas, intervenções cirúrgicas; em engenharia genética: para transdução - transferência natural de genes entre bactérias; como vetores que transferem seções de DNA; usando fagos, é possível criar alterações direcionadas no genoma do DNA hospedeiro; na indústria alimentar: produtos de carne e aves prontos para consumo já estão sendo processados ​​em massa com agentes contendo fagos; os bacteriófagos são utilizados na produção de produtos alimentícios a partir de carnes, aves, queijos, produtos vegetais, etc.;

na agricultura: pulverização de preparações de fagos para proteger plantas e culturas contra apodrecimento e doenças bacterianas; proteger o gado e as aves contra infecções e doenças bacterianas; para segurança ambiental: tratamento antibacteriano de sementes e plantas; limpeza de instalações de empresas de processamento de alimentos; higienização espaço de trabalho e equipamentos; prevenção de instalações hospitalares; executando atividades ambientais

Assim, hoje os bacteriófagos são muito populares na vida de humanos e animais. Nas empresas está planejado linha inteiraáreas prioritárias para o desenvolvimento e produção de bacteriófagos terapêuticos e profiláticos, que se correlacionam com as novas tendências globais emergentes. Novos medicamentos estão sendo criados e introduzidos para tratar muitas doenças. O estudo e utilização dos bacteriófagos são realizados por bacteriologistas, virologistas, bioquímicos, geneticistas, biofísicos, biólogos moleculares, oncologistas experimentais, especialistas em engenharia genética e biotecnologia