Determinação de aminoácidos. Determinação quantitativa de aminoácidos por cromatografia em papel Métodos para determinação qualitativa e quantitativa de aminoácidos

Equipamento e reagente: papel para cromatografia; câmara de cromatografia; colorímetro fotoelétrico; tesoura; placas de vidro (3´32 cm) - 3 unid.; porta cromatograma; armário de secagem; micropipetas; tubos de ensaio com rolhas esmerilhadas; bureta 25 ml; mistura padrão de aminoácidos; mistura teste de aminoácidos; butanol, ácido acético, água numa proporção de 15:3:7; Solução de ninidrina a 1% em acetona a 95%; álcool etílico (75%), saturado com sulfato de cobre.

Conclusão do trabalho

Pegue uma folha de papel cromatográfico medindo 18 x 28 cm e desenhe uma linha horizontal com um simples lápis a uma distância de 3 cm de sua borda curta. Em seguida, é dividido em seções desiguais de acordo com o diagrama anexo e os limites de aplicação das misturas padrão e teste são marcados com setas e as inscrições correspondentes são feitas com um simples lápis.

O papel é reforçado acima da superfície da mesa e a mistura padrão é aplicada primeiro na linha de partida, limitada pelas setas, usando uma micropipeta especial em uma linha fina até que toda a solução da micropipeta seja transferida para a linha de partida (a micropipeta é preenchido até 2-3 cm). A massa da solução aplicada é medida pesando a pipeta cheia com a mistura padrão (antes da aplicação da solução) e vazia (após a aplicação da solução). 0,02-0,03 g é geralmente aplicado ao papel solução padrão. Em seguida, preencha uma pipeta limpa com a mistura teste de aminoácidos (emitida pelo professor para o estudo), pese e aplique a mistura na linha de partida com a marca apropriada.

O cromatograma preparado é colocado em uma câmara de cromatografia com um sistema solvente previamente derramado para separar uma mistura de aminoácidos, por exemplo, uma mistura de butanol, ácido acético e água na proporção de 15:3:7. A separação é realizada por cromatografia ascendente até que a linha frontal atinja 2-3 cm da borda superior do papel cromatográfico (linha de chegada). Em seguida, o cromatograma é retirado da câmara e a extremidade superior do papel é imediatamente inserida em um suporte feito de três bastões de vidro presos com um anel de borracha e colocado em uma capela por 20 minutos para remoção de solventes do papel.

Arroz. 8. Esquema de disposição dos aminoácidos no cromatograma:

A - ponto de aplicação de mistura de aminoácidos; I - cistina e cisteína;

2 - lisina; 3 - histidina; 4 - arginina; 5 - ácido aspártico,

série e glicina; 6 - ácido glutâmico e treonina; 7 - alanina;

8 - prolina; 9 - tirosina; 10 - valina e metionina; II - triptofano;

12 - fenilalanina; 13 – leucina e isoleucina

O cromatograma seco é mergulhado em uma solução de ninidrina a 1% em acetona para detectar a posição de manchas de aminoácidos nele. O cromatograma é então colocado em capela por 10 minutos para remoção da acetona e transferido para uma cabine de secagem, onde é deixado por 15 minutos a 70°C. Os aminoácidos das misturas padrão e de teste são detectados na forma de manchas azul-violeta localizadas em uma cadeia na direção do movimento do sistema solvente da linha inicial até a borda superior do cromatograma.

A identificação dos aminoácidos contidos na mistura teste é realizada pela coincidência no cromatograma das posições ocupadas pelos aminoácidos das misturas padrão e teste (Fig. 8).

Para determinar o conteúdo quantitativo de aminoácidos nas misturas de teste, o cromatograma é desenhado com um simples lápis de modo que as zonas coloridas situadas no mesmo nível, correspondentes ao mesmo aminoácido, estejam contidas em retângulos aproximadamente idênticos (Fig. 9) .

II III IV

Arroz. 9. Disposição dos aminoácidos no cromatograma:

I - mistura nº I; II - mistura nº 2; 1U - mistura nº 3; Sh - padrão

mistura de aminoácidos

As áreas contornadas do papel são recortadas e colocadas em tubos de ensaio, cujos números devem corresponder aos números das manchas nos cromatogramas. 10 ml de uma solução a 75% são despejados em cada tubo de ensaio de uma bureta. Álcool etílico saturado com sulfato de mel (adicionar 0,2 ml de solução saturada de sulfato de cobre a 500 ml de álcool etílico). O tubo de ensaio é tampado e, mexendo ocasionalmente, a cor vermelho-tijolo (sal de cobre azul-violeta de Ruheman) é completamente transferida do papel para a solução. Isso leva de 15 a 20 minutos. A absorção (densidade óptica) das soluções padrão e de teste é medida em um calorímetro fotoelétrico com filtro de luz verde (540 nm). Uma cubeta com solução de álcool etílico a 75% com sulfato de cobre é instalada no fluxo de referência.

O conteúdo quantitativo de aminoácidos na solução de teste é calculado a partir da razão entre as extinções das amostras de teste e padrão.

Exemplo de cálculo. Suponhamos que a mistura padrão contenha 1,8 mg de glicina em 1 ml e 0,02 g desta solução padrão sejam aplicados na tira inicial. Portanto, o cromatograma recebeu (1,8 × 0,02) = 0,036 mg de glicina. Concordemos ainda que a absorção das soluções coloridas foi de 0,288 para o padrão e 0,336 para a mistura desconhecida. Então o teor de glicina na mistura em estudo, plotado no cromatograma, será (36´0,336): 0,288=42 μg. Se assumirmos ainda que a mistura de teste é aplicada ao cromatograma numa quantidade de, por exemplo, 0,0250 g, então o teor de glicina em 1 ml da solução de teste será (42:0,0250) = 1680 μg, ou 1,68 mg/ ml.

Apresente os resultados de seu próprio experimento e tire conclusões deles.

Trabalho de laboratório nº 15

Separação de íonsFé 3+ , Co 2+ , Não 2+

Este artigo discutirá métodos de determinação de aminoácidos, utilizados não apenas na análise de produtos, mas em análises bioquímicas e farmacêuticas.

A quantidade total de aminoácidos pode ser determinada por um método fotométrico baseado na determinação de amônia obtida de aminoácidos pelo método Kjeldahl.

Reação com 1-naftol. Para determinar arginina, histidina e tirosina, foi proposta uma reação com 1-naftol. Na presença de hipoclorito de sódio (NaOCl), a solução fica vermelha. Uma solução de amostra em etanol a 50% contendo um aminoácido é resfriada com gelo e uma solução de NaOCl a 10% e uma solução de naftol são adicionadas. O produto da reação é de cor vermelha (l max = 550 nm). O conteúdo de aminoácidos é determinado pela intensidade da cor da solução resultante.

Reação de biureto. Uma das reações mais importantes usadas para determinar aminoácidos é a reação do biureto. A reação é realizada adicionando biureto diluído a uma solução alcalina solução aquosa sais de cobre (II). Neste caso, a solução torna-se intensamente roxo devido à formação de um composto complexo.

A reação do biureto envolve compostos contendo pelo menos 2 grupos amida ou um grupo amino-hidroxietileno, bem como amidas e imidas de aminoácidos. Esta reação é realizada por proteínas e soluções concentradas de aminoácidos e amidas. Soluções diluídas de aminoácidos não produzem reação de biureto e, portanto, a reação pode ser usada para determinar o fim da hidrólise de proteínas. A reação também é utilizada para a determinação qualitativa e quantitativa de proteínas. A reação do biureto é a base dos métodos utilizados em laboratórios de diagnóstico clínico para determinação de proteínas no sangue e outros fluidos biológicos.

Reação da ninidrina. A segunda reação mais importante usada para determinar aminoácidos é a reação da ninidrina - uma reação colorida a a-aminoácidos, que é realizada aquecendo estes últimos em solução alcalina excesso de ninidrina.

A ninidrina realiza a descarboxilação oxidativa de a-aminoácidos com formação de amônia, dióxido de carbono e um aldeído contendo um átomo de carbono a menos que o aminoácido original. A ninidrina reduzida reage ainda com a amônia liberada e uma segunda molécula de ninidrina, formando um produto de condensação colorido com amônia.

O composto resultante (pigmento) tem uma cor azul violeta (l max = 570 nm). A formação desse composto colorido é utilizada no teste quantitativo de a-aminoácidos, que pode detectar aminoácidos mesmo em quantidades tão pequenas quanto 1 µg.

A prolina e a hidroxiprolina, que não possuem um grupo a-amino, reagem com a ninidrina para formar derivados cor amarela(l máx = 440 nm). A reação não é específica, porque amônia e compostos contendo um grupo amino (aminas, proteínas, peptídeos) também produzem um produto colorido com ninidrina. Contudo, nenhum CO2 é libertado com estes compostos. A liberação de dióxido de carbono é típica apenas para a-aminoácidos. A reação é usada para colorimetria quantificação a-aminoácidos, inclusive em analisadores automáticos de aminoácidos (medição do volume de CO 2).

A reação da ninidrina é usada para determinar glicina, isoleucina, leucina; serina, fenilalanina, cisteína, tirosina, triptofano, etc. dão coloração menos intensa.

Os produtos resultantes são caracterizados por uma cor bastante intensa (e = 1,8–3,3·10 4), mas os produtos coloridos são instáveis. A intensidade da cor diminui rapidamente. CdCl2 é adicionado para estabilização. Forma complexos estáveis com os compostos resultantes. O cloreto de cádmio também acelera a reação.

Aminoácidos e alguns outros compostos contendo um grupo amino condensam-se em ambiente alcalino com 1,2-naftoquinona - 4-sulfoxilote para formar derivados vermelhos, amarelos e laranja de 1,2-naftoquinona monoimina.

A reação é usada para determinar a-aminoxilatos (valina, isoleucina, leucina, etc.).

Para determinar o triptofano, pode-se usar a reação com 4-dimetilaminobenzaldeído. O produto da reação é de cor roxa e o teor de triptofano na solução analisada é determinado pela intensidade da cor.

Deve-se notar, entretanto, que esta reação raramente é utilizada na análise de alimentos.

Para a determinação quantitativa de aminoácidos contendo enxofre, utiliza-se um método bromatométrico, baseado na seguinte reação:

Uma solução de cisteína em solução de NaOH a 1% é colocada em um frasco com rolha esmerilada e 0,1 N é adicionado. solução de bromato de potássio, brometo de potássio seco e acidificado com HCl a 10%.

BrO 3 – + 5Br – + 6H + → 3Br 2 + 3H 2 O

O bromo formado na reação, cuja quantidade é equivalente à quantidade de bromato de potássio, reage com o aminoácido. Após 10 minutos, é adicionado iodeto de potássio, que reage com o bromo que não reagiu, e o iodo liberado é titulado com 0,1 N. solução de tiossulfato de sódio com amido como indicador.

2I – + Br 2 → Br - + I 2

A quantidade de tiossulfato utilizada para titulação é equivalente à quantidade de bromo que não reagiu com o aminoácido. Com base na diferença entre a quantidade de bromato de potássio e tiossulfato adicionados, é encontrada a quantidade de bromo que reagiu com o aminoácido e, portanto, a quantidade de aminoácido.

A metionina é determinada de forma semelhante. A metionina é oxidada a uma sulfona:

Esta reação, sob certas condições, permite determinar com muita precisão o teor de metionina.

E proteínas

Sabe-se que todas as 20 variedades de α-aminoácidos canônicos possuem a mesma estrutura, com três variantes de grupos funcionais (Fig. 3.3). Infelizmente, as reações aos grupos amino e carboxi não são muito específicas, porque conseqüentemente, eles são característicos de todas as aminas, várias amidas e ácidos carboxílicos. O mesmo se aplica à maioria dos seus radicais = R, dos quais 10 são apolares, ou seja, representados por grupos alifáticos = hidrocarbonetos, a maioria dos quais são quimicamente inertes. A especificidade da maioria dos aminoácidos polares R, que contêm álcool (Ser, Tre, Tyr), amida (Asn, Gln) e grupos carboxilo (Asp, Glu), também é relativamente baixa. O grupo amino (Lys), imidazol His e o grupo guanidino Arg são mais ativos, e a atividade do grupo tio Cys é máxima. Portanto o maior significado prático na análise qualitativa e quantitativa de α-aminoácidos, inclusive em analisadores de aminoácidos, foi obtida uma reação universal de ninidrina, específica para a presença simultânea de grupos amino e carboxi no átomo α-C.

Arroz. 3.3. Fórmulas gerais estruturas de α-aminoácidos e seus produtos de polimerização. Explicações no texto.

A polimerização de α-aminoácidos na estrutura de peptídeos e proteínas (Fig. 3.3) mantém todos os seus tipos R, mas:

1. A reação da ninidrina torna-se negativa, porque com exceção dos terminais N e C, os grupos α-amino e α-carboxi são gastos na formação de ligações peptídicas. Uma reação positiva da ninidrina com a proteína provavelmente indica a presença de impurezas de aminoácidos na preparação ou recipiente.

2. Para todos os peptídeos e proteínas, uma reação de biureto é específica para um grupo peptídico que está ausente nos aminoácidos monoméricos.

3. De mais reações específicas para aminoácidos R, são úteis: reação de xantoproteína com ácido nítrico concentrado, para R aromáticos Fen, Tyr, Tri; reação com isatina no anel Pro de cinco membros, bem como reações no imidazol R His, no grupo tio Cys e no grupo guanidino Arg. É importante levar em conta que alguns desses R estão escondidos dentro de glóbulos de proteínas e, portanto, as reações qualitativas a eles são enfraquecidas. Portanto, antes de serem realizadas, as proteínas geralmente são desnaturadas de uma forma ou de outra.

4. Ao contrário das verdadeiras soluções de aminoácidos, soluções coloidais proteínas são características reações sedimentares , associada à destruição de suas conchas de hidratação e, consequentemente, à diminuição de sua solubilidade sob a influência de agentes removedores de água: sais neutros = salga, metanol = MeOH, etanol = EtOH, acetona, uréia e outros agentes.

Ao realizar reações qualitativas, você deve:

1. Siga as regras com atenção segurança contra incêndios e trabalhar com ácidos e álcalis concentrados = EZh.

2. Marque 2 fileiras de tubos de ensaio com um gráfico de vidro ou caneta hidrográfica e coloque não mais que 0,5 ml (2-5 gotas) de uma solução de aminoácidos a 1% em um deles, e aproximadamente o mesmo volume de 1 % de solução proteica no outro.

3. Em um par de tubos de ensaio com soluções de aminoácidos e proteínas, adicionar paralelamente 3-5 gotas dos reagentes correspondentes e realizar os demais procedimentos indicados para a reação correspondente.

4. Caso seja necessário aquecer os tubos de ensaio, retire a tampa do cadinho e acenda o combustível seco com um fósforo. Em seguida, prenda o tubo de ensaio em um suporte, cujo design primitivo não é confiável. Portanto, é melhor embrulhar alguns tubos de ensaio com um pedaço de papel dobrado em tiras e, segurando-os dedão, passe uniformemente metades inferiores tubos de ensaio através da chama, evitando apontar o pescoço para os vizinhos e fazer a solução ferver violentamente. Após concluir a operação, apague imediatamente a chama com a tampa do cadinho.

5. Os resultados dos experimentos, de acordo com o modelo, são elaborados na divulgação do caderno de laboratório em forma de tabela:

6. Considerados os resultados obtidos e preenchido o protocolo, juntamente com um suporte de tubos de ensaio, apresente-os ao professor para proteção.

1. Reação da ninidrina. Com base na desaminação e descarboxilação de α-aminoácidos com uma solução alcoólica de ninidrina:

A amônia resultante, reagindo com duas moléculas de ninidrina, forma um derivado colorido com absorção máxima em 540 nm (para Pro - 440 nm).

Progresso: Adicione 3-5 gotas de 0,5% às amostras de teste solução de álcool ninidrina. Aqueça suavemente os tubos de ensaio com as misturas em fogo e após 2-3 minutos, registre a aparência da cor.

2. Reação xantoproteína. Como mencionado acima, baseia-se na formação de derivados nitro de aminoácidos com R aromático: Fen, Tyr, Tri.

Progresso: Ligando a tiragem da capela, adicione cuidadosamente algumas gotas de ácido nítrico concentrado (HNO 3) a um par de tubos de ensaio com as soluções de teste. Aqueça suavemente os tubos de ensaio sobre uma chama, evitando apontar os pescoços para os vizinhos, e registre o desenvolvimento da cor.

3. Reação ao nitroprussiato. Baseia-se na hidrólise alcalina do aminoácido cisteína contendo enxofre, com liberação de sulfeto de sódio (Na 2 S), que dá um complexo vermelho com uma solução recém-preparada de nitroprussiato de sódio.

Progresso: Adicione 5 a 10 gotas de soluções de teste em ambos os tubos de ensaio volume igual 20% de soda cáustica e ferva por pelo menos 3-5 minutos. Adicione 3-5 gotas de solução de nitroprussiato de sódio aos tubos de ensaio e registre o desenvolvimento da cor.

4. Reação ao biureto. Baseia-se na formação de um complexo colorido de uma ligação peptídica com um íon Cu 2+ em ambiente alcalino. Serve como teste universal para identificação de peptídeos e proteínas em soluções. Como com o aumento do número de ligações peptídicas, a intensidade da cor da solução aumenta linearmente, ela é amplamente utilizada para determinação fotométrica de concentrações de proteínas.

Progresso. Adicione a mesma quantidade de solução de hidróxido de sódio a 10% aos tubos de ensaio com 5 a 10 gotas das soluções de teste. Misture bem e adicione 2 gotas de solução de sulfato de cobre a 1% (CuSO 4). Misture as amostras e registre o desenvolvimento da cor após alguns minutos.

5. Teste de ebulição. Baseado na desnaturação térmica de proteínas.

Progresso. Acidifique ambos os tubos de ensaio com as soluções de teste com não mais do que uma gota de solução de ácido acético a 1% (AcOH) e aqueça até à ebulição. Após ferver as soluções por 2-3 minutos, registre os resultados e explique o mecanismo do fenômeno.

6. Precipitação por sais de metais pesados(Meh) . Suas propriedades desnaturantes são baseadas na capacidade dos cátions Me pesados de reagirem com os grupos funcionais R da molécula de proteína: tio-, amino-, carboxi-, aromático. Além disso, seus ânions fortes causam recarga de grupos iônicos em moléculas de proteínas, destruindo assim as ligações iônicas nelas.

Progresso. Adicione algumas gotas de solução de sulfato de cobre a 5% (CuSO 4) em ambos os tubos de ensaio com as soluções de teste. Registre e explique os resultados obtidos.

7. Precipitação com ácidos orgânicos. Baseado na desnaturação ácida de proteínas e na formação de derivados covalentes de grupos tio, amino e aromáticos de aminoácidos R com organoclorados.

Progresso. Adicione algumas gotas de uma solução de ácido tricloroacético (TCA) a 10% aos tubos de ensaio com as soluções de teste e, após alguns minutos, registre os resultados

Métodos para determinar aminoácidos

Os aminoácidos são biologicamente substâncias ativas, eles desempenham um grande papel na vida do corpo humano, são amplamente utilizados como medicação. Alguns deles são essenciais e entram no corpo com os alimentos. Atualmente, existem vários métodos para a determinação quantitativa de aminoácidos em materiais vegetais medicinais, incluindo medicação e fluidos biológicos, em produtos alimentícios.

Da variedade de métodos para determinação quantitativa de aminoácidos em vários objetos, quatro grupos principais podem ser distinguidos: cromatográfico, espectrofotométrico, titulométrico e métodos eletroquímicos análise.

Métodos cromatográficos

Atrás últimas décadas Avanços significativos foram feitos no campo da cromatografia gás-líquido de aminoácidos. Foi proposto um método usando colunas microempacotadas, que permite relativamente pouco tempo separar quase completamente 17 α-aminoácidos biologicamente importantes.

Foi desenvolvido um método para determinação de aminoácidos por cromatografia gás-líquido em amostras de soro, plasma, urina e líquido cefalorraquidiano, baseado na preparação de éteres 2,3,4,5,6-pentafluorobenzoil-isobutil seguido de separação em coluna de polidimetilsiloxano em modo de programação de temperatura de 140°C a 250°C com detector de ionização de chama. O tempo de separação cromatográfica é de 28 minutos. Como resultado da pesquisa, foram separados 27 aminoácidos.

Apesar da variedade de métodos de cromatografia líquida de alta eficiência para análise de aminoácidos, o mais rápido e acessível é a versão de fase reversa com detecção espectrofotométrica. Para separação e detecção bem-sucedidas, os aminoácidos são convertidos em derivados hidrofóbicos e absorventes de luz, ou seja, é realizada a derivatização pré-coluna. Aldeído ortoftálico, naftaleno-2,3-dicarboxialdeído e 9-fluorenilmetilcloroformato são usados como reagentes de derivatização.

Foi desenvolvido um método para a determinação quantitativa de L-cistina, ácido L-glutâmico e glicina no medicamento "Eltacin", que possui atividade antioxidante em combinação com efeito antianginal. Ácido glutâmico e a glicina foram determinadas por cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa após derivatização pré-coluna com o reagente ortoftaldeído/N-acetil-L-cisteína. A derivatização da cisteína, segundo os autores, é difícil devido à instabilidade do próprio aminoácido e dos derivados resultantes. Portanto, a análise da cisteína foi realizada por titulação bromatométrica. Verificou-se que a presença de quantidades significativas de cisteína na amostra não interfere na determinação dos produtos de derivatização da glicina e do ácido glutâmico com o reagente aldeído ortoftálico/N-acetil-L-cisteína. O método é caracterizado por alta reprodutibilidade e precisão de determinação.

A possibilidade de utilização de 4,7-fenantrolina-5,6-diona (fanquinona) como reagente de marcação fluorogênica para a formação pré-coluna de seus derivados para fins de separação e análise quantitativa aminoácidos usando cromatografia líquida de alta eficiência. Não tendo fluorescência intrínseca, a fanquinona reage com os grupos amino dos aminoácidos (a 68 °C durante 160 min), formando iminoquinóis, cuja fluorescência é medida num comprimento de onda de 460 nm. Os derivados isolados foram identificados pelos espectros de Tm, IR, massa e PMR. A cromatografia líquida de alta eficiência foi realizada em cromatógrafo com detector fluorescente e coluna com eluição gradiente com misturas: solução de trietilamina - tampão fosfato (pH 3) - metanol. A quinidina foi utilizada como padrão interno. Este métodoé bastante promissor em grandes laboratórios e pode ser proposto para análise de aminoácidos em formas farmacêuticas acabadas.

Foi desenvolvida uma técnica de cromatografia líquida de alta eficiência com biossensor potenciométrico para a determinação quantitativa de lisina. O biossensor é construído anexando uma membrana contendo lisina oxidase a um eletrodo NH4+ seletivo para íons. Os íons de amônio gerados durante a degradação enzimática da lisina são detectados potenciometricamente. Foi desenvolvido um método expresso cromatodensitométrico para a análise de triptofano em líquidos de cultura. A cromatografia em camada fina foi realizada em placas Sorbfil. A cromatografia foi realizada no sistema propanol-2 - solução de hidróxido de amônio 25% (7:3) por 25 minutos. Os cromatogramas foram secos à temperatura ambiente e mantidos a 120°C por 15 min. Para detectar manchas nos cromatogramas, foi utilizado um reagente específico - 4-dimetilaminobenzaldeído, seletivo para o anel indol do triptofano, na forma de solução de etanol a 0,5% com adição de ácido sulfúrico concentrado a 5%. Após revelação dos cromatogramas por imersão em cubeta de Teflon com solução de 4-dimetilaminobenzaldeído recém-preparada, eles foram mantidos por 5-7 minutos a uma temperatura de 110°C. A varredura dos pontos de triptofano foi realizada em um comprimento de onda de 625 nm em um densitômetro de vídeo de computador. O método desenvolvido, apesar alta precisão definições e desempenho, específicos para triptofano.

Para a análise de β-aminoácidos em fluidos biológicos, medicamentos e produtos alimentícios, são amplamente utilizados métodos de eletroforese capilar, baseados na separação dos componentes de uma mistura complexa em um capilar de quartzo sob a ação de um aplicador. campo elétrico. Como os aminoácidos são de natureza zwitteriônica, eles podem ser separados usando soluções tampão eletrolíticas com um valor de pH apropriado; na maioria das vezes, são usados tampões de separação neutros e básicos.

Para aumentar a especificidade e sensibilidade do método de eletroforese capilar para análise de β-aminoácidos individuais, utiliza-se sua derivatização preliminar, seguida de separação em capilar de quartzo e determinação espectrofotométrica dos produtos da reação. Assim, formato de 9-fluorenilmetila, cloroformato de 9-(2-carbazol)-etil e corante de cianina são usados como agentes de derivatização. As perspectivas do método se devem a vantagens como rapidez na análise, facilidade no preparo da amostra, baixo consumo de reagentes e simplicidade de instrumentação.

Os aminoácidos podem ser detectados por meio de reações de cores: ninidrina, xantoproteína, Foly, Milone, teste de biureto, etc. baseiam-se na detecção de fragmentos individuais na estrutura dos aminoácidos, que também podem ser encontrados em outros compostos.

Reação da ninidrina, uma reação de cor utilizada para a determinação qualitativa e quantitativa de aminoácidos, iminoácidos e aminas. Quando aquecida em ambiente alcalino, a ninidrina (tricetoidrina desidratada, C 9 H b O 4) com substâncias que possuem grupos amino primários (-NH 2), forma-se um produto de cor azul-violeta intensa estável com absorção máxima de cerca de 570 nm. Como a absorção neste comprimento de onda depende linearmente do número de grupos amino livres, a reação da ninidrina serviu de base para sua determinação quantitativa por colorimetria ou espectrofotometria. Esta reação também é utilizada para determinar grupos amino secundários (>NH) em iminoácidos - prolina e hidroxiprolina; neste caso, forma-se um produto amarelo brilhante. Sensibilidade - até 0,01%. A análise automática moderna de aminoácidos é realizada combinando a separação de aminoácidos por troca iônica e sua determinação quantitativa usando a reação da ninidrina. Ao separar misturas de aminoácidos por cromatografia em papel, é possível determinar cada aminoácido em uma quantidade de pelo menos 2-5 μg.

A intensidade da cor pode ser usada para avaliar a quantidade de aminoácidos.

Esta reação é positiva não apenas com aminoácidos livres, mas também com peptídeos, proteínas, etc.

Reação xantoproteína permite a detecção de aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, histidina, triptofano), com base na reação de substituição eletrofílica no núcleo aromático (nitração).

Quando o ácido nítrico concentrado atua, por exemplo, sobre a tirosina, forma-se um produto de cor amarela.

Reação seguinte. Esta é uma reação à cisteína e à cistina. Durante a hidrólise alcalina, o “enxofre fracamente ligado” na cisteína e na cistina é facilmente separado, resultando na formação de sulfeto de hidrogênio, que, reagindo com o álcali, produz sulfetos de sódio ou potássio. Quando o acetato de chumbo (II) é adicionado, forma-se um precipitado preto acinzentado de sulfeto de chumbo (II).

Descrição da experiência. 1 ml de solução de cistina é colocado em um tubo de ensaio e 0,5 ml de solução de hidróxido de sódio a 20% são adicionados. A mistura é aquecida até à ebulição e depois são adicionados 0,5 ml de solução de acetato de chumbo(II). Um precipitado preto acinzentado de sulfeto de chumbo (II) é observado:

Reação de Zimmermann. Esta é uma reação ao aminoácido glicina.

Descrição da experiência. A 2 ml de uma solução de glicina a 0,1%, ajustada pela adição de uma solução alcalina a 10% para pH = 8, adicione 0,5 ml de uma solução aquosa de dialdeído o-ftálico. A mistura de reação lentamente começa a ficar verde brilhante. Após alguns minutos, aparece um precipitado verde.

Reação ao triptofano. Triptofano reagindo em ambiente ácido com aldeídos, forma produtos de condensação coloridos. Por exemplo, com ácido glioxílico (que é uma mistura de concentrado ácido acético) a reação prossegue de acordo com a equação:

A reação do triptofano com o formaldeído ocorre de acordo com um esquema semelhante.

A reação de Sakaguchi. Esta reação ao aminoácido arginina é baseada na interação da arginina com o α-naftol na presença de um agente oxidante. Seu mecanismo ainda não foi totalmente elucidado. Aparentemente, a reação é realizada de acordo com a seguinte equação:

Como os derivados de quinoneimina (em nesse caso naftoquinona), em que o hidrogênio do grupo imino –NH– é substituído por um radical alquil ou aril, são sempre de cor amarelo-vermelho, então, aparentemente, a cor laranja-vermelho da solução durante a reação de Sakaguchi é explicada pelo aparecimento do derivado imina naftoquinona. No entanto, a possibilidade de formação de um composto ainda mais complexo devido à oxidação adicional dos grupos NH restantes do resíduo de arginina e do anel benzênico do α-naftol não pode ser excluída:

Descrição da experiência. 2 ml de uma solução de arginina a 0,01% são colocados em um tubo de ensaio e, em seguida, são adicionados 2 ml de uma solução de hidróxido de sódio a 10% e algumas gotas de uma solução alcoólica de α-naftol a 0,2%. O conteúdo do tubo de ensaio é bem misturado, 0,5 ml de solução de hipobromito são adicionados e misturados novamente. Adicione imediatamente 1 ml de solução de ureia a 40% para estabilizar a cor vermelho-alaranjada que se desenvolve rapidamente.

Reação de biureto– usado como uma reação de cor às proteínas. Em ambiente alcalino na presença de sais de cobre (II), apresentam cor violeta. A cor se deve à formação de um composto complexo de cobre (II) devido ao grupo peptídico -CO-NH-, que é característico das proteínas. Essa reação recebeu o nome de um derivado da uréia - o biureto, que se forma quando a uréia é aquecida com eliminação da amônia:

Além das proteínas e do biureto, a mesma coloração é dada por outros compostos contendo este grupo: amidas, imidas de ácidos carboxílicos, bem como compostos contendo os grupos -CS-NH- ou =CH-NH- na molécula. Proteínas, alguns aminoácidos, peptídeos, biureto e peptonas médias também reagem.

A cor do complexo obtido pela reação do biureto com vários peptídeos é um pouco diferente e depende do comprimento da cadeia peptídica. Peptídeos com comprimento de cadeia de quatro resíduos de aminoácidos e acima formam um complexo vermelho, tripeptídeos - roxo e dipeptídeos - azul.