5. “REAÇÃO SENSORMOTORA. REAÇÃO MOTORA DE UM BOXEADOR AO APARECIMENTO DE UM IRRITANTE EXTERNO" Na execução de um golpe em alta velocidade, um papel importante é dado à forma como o boxeador reage ao aparecimento de um estímulo externo (som, sinal, luz no dinamômetro antes

A reação de hemaglutinação é baseada no fenômeno da colagem de glóbulos vermelhos, que ocorre sob a influência de diversos fatores. Existem hemaglutinação direta e indireta.

O método para realizar uma reação de hemaglutinação indireta consiste em várias etapas. Primeiramente, as hemácias são lavadas com solução isotônica de cloreto de sódio e, se necessário (quando se utiliza antígenos protéicos), são tratadas com solução de tanino 1: 20.000 e sensibilizadas com antígenos solúveis. Após lavagem com solução isotônica tamponada de cloreto de sódio, o antígeno eritrocitário está pronto para uso. Os soros de teste são diluídos com uma solução isotônica de cloreto de sódio em tubos de ensaio ou placas plásticas especiais com poços e, em seguida, um diagnóstico de eritrócitos é adicionado a cada diluição do soro. Os resultados da reação de hemaglutinação indireta são levados em consideração pela natureza do sedimento de glóbulos vermelhos formado no fundo do tubo. Um resultado de reação em que os glóbulos vermelhos cobrem uniformemente todo o fundo do tubo é considerado positivo. Em caso de reação negativa, os glóbulos vermelhos na forma de um pequeno disco ou “botão” ficam localizados no centro do fundo do tubo de ensaio

Principais componentes do PR:

A) antígeno solúvel,

B) Anticorpos específicos (soro)

(RTGA) é um método de identificação de vírus ou detecção de anticorpos antivirais no soro sanguíneo de um paciente, baseado no fenômeno da ausência de aglutinação de hemácias por um medicamento contendo vírus na presença de soro sanguíneo imune a ele.
Reação de inibição da hemaglutinação (HAI) baseia-se no bloqueio, supressão de antígenos virais por anticorpos séricos imunológicos, como resultado dos quais os vírus perdem a capacidade de aglutinar glóbulos vermelhos.
O RTGA é usado para diagnosticar muitas doenças virais, cujos agentes causadores (vírus influenza, sarampo, rubéola, encefalite transmitida por carrapatos, etc.) podem aglutinar glóbulos vermelhos de vários animais.
Mecanismo. A tipagem do vírus é realizada usando uma reação de inibição da hemaglutinação (HAI) com um conjunto de soros específicos do tipo. Os resultados da reação são levados em consideração pela ausência de hemaglutinação. Subtipos de vírus A com antígenos H 0 N 1, H 1 N 1, H 2 N 2, H 3 N 2, etc. podem ser diferenciados em RTGA com um conjunto de soros homólogos específicos do tipo.

No centro reações de hemaglutinação reside o fenômeno da adesão dos glóbulos vermelhos, que ocorre sob a influência de vários fatores. Existem hemaglutinação direta e indireta.
Na reação de hemaglutinação direta, os glóbulos vermelhos unem-se quando certos antígenos, como vírus, são adsorvidos neles.
Em estudos sorológicos, utiliza-se uma reação direta de inibição da hemaglutinação, quando o vírus isolado de um paciente é neutralizado com soro imune específico e depois combinado com hemácias. A ausência de hemaglutinação indica a consistência do vírus e do soro imunológico utilizado.

A reação de hemaglutinação indireta (hemaglutinação passiva) é observada nos casos em que soro imune ou soro de paciente contendo anticorpos apropriados é adicionado a hemácias previamente tratadas (sensibilizadas) com diversos antígenos. Ocorre uma colagem específica de glóbulos vermelhos, sua hemaglutinação passiva.

A reação de hemaglutinação indireta ou passiva é superior em sensibilidade e especificidade a outros métodos sorológicos e é utilizada no diagnóstico de infecções causadas por bactérias, riquétsias e protozoários.

O método para realizar uma reação de hemaglutinação indireta consiste em várias etapas. Primeiramente, as hemácias são lavadas com solução isotônica de cloreto de sódio e, se necessário (quando se utiliza antígenos protéicos), são tratadas com solução de tanino 1: 20.000 e sensibilizadas com antígenos solúveis. Após lavagem com solução isotônica tamponada de cloreto de sódio, o antígeno eritrocitário está pronto para uso. Os soros de teste são diluídos com uma solução isotônica de cloreto de sódio em tubos de ensaio ou placas plásticas especiais com poços e, em seguida, um diagnóstico de eritrócitos é adicionado a cada diluição do soro. Os resultados da reação de hemaglutinação indireta são levados em consideração pela natureza do sedimento de glóbulos vermelhos formado no fundo do tubo. Um resultado de reação em que os glóbulos vermelhos cobrem uniformemente todo o fundo do tubo é considerado positivo. Numa reação negativa, os glóbulos vermelhos na forma de um pequeno disco ou “botão” ficam localizados no centro do fundo do tubo de ensaio.

Reação de inibição da hemaglutinação- uma reação sorológica baseada na capacidade dos anticorpos de prevenir a aglutinação de eritrócitos por tipos hemaglutinantes de vírus (adenovírus, arbovírus, alguns enterovírus, vírus influenza e parainfluenza, sarampo, reovírus). Anticorpos antivirais específicos interagem com as moléculas de hemaglutinina de superfície dos vírions desses vírus e bloqueiam sua ligação a moléculas complementares da membrana eritrocitária.

Recentemente, a reação tem sido amplamente utilizada em laboratórios de virologia clínica para determinar títulos de anticorpos específicos para determinados vírus, bem como para identificação sorológica e tipagem de vírus isolados de material clínico de pacientes. Seu uso é um tanto limitado devido à presença no soro sanguíneo humano de inibidores virais inespecíficos, bem como de anticorpos naturais - aglutininas.

A reação de neutralização é a reação de inibição da hemaglutinação (HRI).

RTGA é usado:
-para sorotipagem de vírus;
-para sorodiagnóstico de infecções.
Existem dois métodos de configuração:
- método de gota em vidro (reação aproximada), utilizado para sorocópia de vírus;
- expandido em tubos de ensaio.

Mecanismo. Alguns vírus (como o da gripe) possuem hemaglutinina, que causa aglutinação de glóbulos vermelhos de vários animais, dependendo do tipo de vírus. Na presença de anticorpos - anti-hemaglutininas - no soro, observa-se inibição da atividade viral.
RTGA.
Objetivo: sorotipagem do vírus influenza A

Componentes:
1. O material em estudo é o fluido alantóico de um embrião de galinha,
2. Soros específicos do tipo anti-influenza para diagnóstico,
3. Suspensão a 5% de eritrócitos de galinha.
4. Solução salina.

A reação é realizada em vidro pelo método de gota. Aplique 1 gota de soro de diagnóstico e material de teste no vidro, misture e adicione 1 gota de suspensão de glóbulos vermelhos. Na reação positiva observa-se vermelhidão homogênea e na reação negativa caem flocos vermelhos (hemaglutinação).

Existem muitos métodos para a determinação qualitativa e quantitativa de anticorpos específicos de vírus. Usando esses métodos, você pode detectar IgM e IgG simultaneamente e separadamente imunoglobulinas de cada classe. Via de regra, apenas a IgG específica do vírus é detectada na reação de fixação do complemento. No entanto, ao testar antígenos microbiológicos com este método, é possível determinar simultaneamente IgM e IgG específicos.

Os métodos imunológicos são utilizados principalmente para dois propósitos: primeiro, para diagnosticar uma infecção viral atual, completa ou congênita e, segundo, para detectar anticorpos específicos, cuja presença indica infecção passada e, portanto, imunidade a uma possível reinfecção. As pessoas variam muito na força de sua resposta imunológica a uma infecção viral. Na Fig. A Figura 3 mostra uma curva típica de aumento de título

anticorpos em resposta à infecção primária por rubéola. É fácil perceber que o diagnóstico da rubéola é possível aumentando o título de IgG específica e identificando IgM específica. A presença de IgM específica no sangue de um recém-nascido indica infecção intrauterina, uma vez que a IgM materna, ao contrário da IgG, é retida pela placenta. A IgG específica produzida como resultado de infecção primária geralmente persiste ao longo da vida. Portanto, a presença de anticorpos desta classe no soro sanguíneo indica imunidade à infecção repetida correspondente.

Abaixo estão os métodos imunológicos para detectar anticorpos específicos contra o vírus da rubéola, que são especialmente eficazes para diagnosticar doenças fetais e determinar o título de anticorpos específicos no soro sanguíneo. Descrições detalhadas dos métodos usados ​​para diagnosticar a rubéola podem ser encontradas nas revisões de Pattison e Morgan-Kapner.

Reação de inibição da hemaglutinação

O vírus da rubéola causa hemaglutinação dos glóbulos vermelhos em muitas espécies animais. Na maioria das vezes, eritrócitos de pintinhos de um dia são usados ​​em RTGA. O antígeno hemaglutinante do vírus da rubéola nesta reação é o vírus cultivado em cultura e tratado com Tween 80 e éter. O pré-tratamento aumenta o título de GA do vírus.

5.1.1 Padronização do antígeno HA do vírus da rubéola

1. 1 ml de uma suspensão a 50% de eritrócitos de galinha é lavado três vezes em tampão veronal com dextrano e gelatina por centrifugação e ressuspensão do sedimento num tubo de centrífuga graduado de 15 ml. As células lavadas são ressuspensas em tampão DGV para obter uma suspensão a 30%.

Tabela 3. Preparação de tampão veronal com dextrana e gelatina

2. Diluir a preparação liofilizada do antígeno GA do vírus da rubéola no volume de água destilada necessário de acordo com as instruções.

3. Adicione 1 volume de DGV a cada um dos oito poços de duas fileiras adjacentes de uma placa de microtitulação de poliestireno de 96 poços com poços em forma de U.

4. Um volume de antígeno GA do vírus da rubéola é adicionado aos primeiros poços de duas fileiras.

5. Prepare diluições duplas em série do antígeno GA do vírus da rubéola, variando de 1:2 a 1:256, usando um microtítulo de 0,025 ml. Antes do uso, a cabeça do microtitulador deve ser aquecida em chama até ficar vermelha, depois resfriada por alguns segundos, colocada em água destilada e enxugada com papel de filtro.

6. Adicione um volume adicional de tampão DGV a cada um dos poços preenchidos. Como controlo, dois volumes de tampão DGV são adicionados aos poços 12 das duas primeiras filas.

7. Uma suspensão de eritrócitos de galinha lavados é diluída 100 vezes com tampão DGV, obtendo-se assim uma suspensão a 0,03%.

8. Adicione dois volumes de suspensão de glóbulos vermelhos a 0,03% a todos os 18 poços, cubra a placa acabada com outra placa não utilizada e incube durante 1 hora a 4 °C.

9. Uma “placa” densa de eritrócitos não aglutinados forma-se no fundo dos poços de controlo. Os glóbulos vermelhos aglutinados assentam uniformemente. O título de GA é considerado o recíproco da maior diluição do antígeno GA do vírus da rubéola, na qual ainda ocorre aglutinação completa. Esta diluição contém 1 unidade hemaglutinante.

Para testar os soros, são utilizadas 4 unidades GA do antígeno do vírus da rubéola. Assim, se o título GA do antígeno for 32, então, para detectar anticorpos contra o vírus da rubéola, ele é diluído com DGV oito vezes. O antígeno diluído é estável por 25-48 horas a 4 °C.

5.1.2 Pré-tratamento de soro de leite

Todos os soros contêm inibidores de hemaglutinação inespecíficos que devem ser removidos. Os inibidores inespecíficos de GA são principalmente lipoproteínas, que são liberadas pelo tratamento do soro com caulim. Além disso, aglutininas inespecíficas de eritrócitos de galinha podem estar presentes em soros humanos. Contudo, a adsorção preliminar dos soros de teste pelos eritrócitos não é necessária, uma vez que todas as hemaglutininas inespecíficas presentes nos soros são detectadas nos controlos.

1. Adicione 0,2 ml de soro em tubos de vidro numerados. Além dos soros de teste, são necessários controles positivos e negativos em cada experimento.

2. Adicione 0,8 ml de caulim a 25% em solução salina tamponada com borato a cada tubo de ensaio.

3. O conteúdo dos tubos de ensaio é agitado e deixado em temperatura ambiente por 20 minutos.

4. O caulino gasto é precipitado por centrifugação numa centrífuga de mesa a 2000 rpm durante 20 minutos.

5. O sobrenadante é transferido para tubos limpos e numerados. Como resultado da purificação, são obtidos soros diluídos quatro vezes. Eles são usados ​​para realizar a reação de inibição da hemaglutinação. Os soros podem ser armazenados a 4°C durante a noite.

5.1.3 Reação de inibição da hemaglutinação

1. Para testar uma amostra de soro, adicione um volume de DGV a uma fila de poços.

2. Adicione um volume de soro diluído quatro vezes ao primeiro e ao último poço.

3. Diluições duplas em série de soro são preparadas usando um microtitulador.

4. Um volume de antígeno HA de rubéola contendo 4 HAE é adicionado aos poços 1-10. O antígeno HA da rubéola não é adicionado ao poço 12.

5. Um volume da diluição de trabalho do antígeno GA da rubéola é adicionado aos poços 1-8 de outra placa e, em seguida, diluições duplas sucessivas do antígeno GA são preparadas em oito poços. Um volume de DGV é adicionado a estes 16 poços. Esta titulação é um teste para o antígeno HA da rubéola. Para controle, dois volumes de DGV são adicionados aos poços 12 da primeira e segunda fileiras.

6. As placas fechadas são deixadas durante 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C.

7. Dois volumes de uma suspensão de eritrócitos de galinha a 0,03% são adicionados a todos os poços cheios e as placas são deixadas durante 1 - 1,5 horas a 4°C.

8. Examinando as placas, determine o título do antígeno GA da rubéola. Não deverá ocorrer aglutinação nos poços de controlo.

9. Se o soro aglutinou glóbulos vermelhos na ausência do antígeno HA da rubéola, é necessário testar novamente a diluição original do soro. Antes disso, o soro é adsorvido com uma gota de suspensão de eritrócitos de frango a 30% por 1 hora em temperatura ambiente e, em seguida, os eritrócitos são precipitados por centrifugação.

10. O título de anticorpos específicos no soro teste é considerado o valor recíproco da diluição na qual a hemaglutinação é completamente suprimida.

5.1.4 Interpretação dos resultados

Em títulos baixos, é difícil interpretar os resultados, pois com uma pequena diluição é possível a presença residual de inibidores inespecíficos. A presença de anticorpos específicos do vírus é considerada comprovada quando o título é 16 ou superior.