2. Testes sorológicos utilizados para diagnosticar infecções virais.

Métodos sorológicos, ou seja, métodos para estudar anticorpos e antígenos usando reações antígeno-anticorpo determinadas no soro sanguíneo e outros fluidos, bem como em tecidos corporais. A detecção de anticorpos contra antígenos de patógenos no soro sanguíneo do paciente permite fazer o diagnóstico da doença. Os estudos sorológicos também são usados ​​​​para identificar antígenos microbianos, várias substâncias biologicamente ativas, grupos sanguíneos, antígenos teciduais e tumorais, complexos imunes, receptores celulares, etc. Quando um micróbio é isolado de um paciente, o patógeno é identificado estudando suas propriedades antigênicas usando soros de diagnóstico imunológico, isto é, soro sanguíneo de animais hiperimunizados contendo anticorpos específicos. Esta é a chamada identificação sorológica de microrganismos. As características da interação de anticorpos com antígenos são a base das reações diagnósticas em laboratórios. A reação in vitro entre antígeno e anticorpo consiste em uma fase específica e inespecífica. Na fase específica, ocorre rápida ligação específica do centro ativo do anticorpo ao determinante do antígeno. Depois vem uma fase inespecífica - mais lenta, que se manifesta por fenômenos físicos visíveis, por exemplo, a formação de flocos (fenômeno de aglutinação) ou precipitado em forma de turbidez. Esta fase requer a presença de certas condições (eletrólitos, pH ideal do ambiente). A ligação do determinante do antígeno (epítopo) ao centro ativo do fragmento Fab dos anticorpos é devida às forças de van der Waals, ligações de hidrogênio e interação hidrofóbica. A força e a quantidade de antígeno ligado aos anticorpos dependem da afinidade, da avidez dos anticorpos e da sua valência.

3. Patógenos da malária. Malária – doença infecciosa antroponótica causada por diversas espécies de protozoários do gênero Plasmodium, transmitida por mosquitos (Anopheles), acompanhada de febre, anemia, aumento do fígado e baço. Os agentes causadores da malária pertencem aos Protozoa, filo Apicomplexa, classe Sporozoa e espécie Pl. vivax, Pl.malariae, Pl.falciparum, Pl.ovale.

Epidemiologia. A fonte da infecção é uma pessoa infectada; O portador é uma fêmea do mosquito do gênero Anopheles. O principal mecanismo de transmissão é transmissível, através da picada de uma fêmea do mosquito infestada.

Tratamento e prevenção. Os medicamentos antimaláricos têm efeitos diferentes nas fases assexuada e sexual do plasmódio. Os principais medicamentos antimaláricos incluem quinina, cloroquina, quinina, primaquina, quinocida, bigumal, cloridina, etc. Ações preventivas visam a origem do patógeno (tratamento de pacientes e portadores de malária) e a destruição dos portadores do patógeno - os mosquitos. Métodos de vacinação estão sendo desenvolvidos com base em antígenos obtidos por engenharia genética.

1. Classificação dos antibióticos de acordo com a estrutura química, mecanismo, espectro e tipo de ação.De acordo com a química rua. 1ª aula - B-lactâmicos - penicilina, cefalosporina. Classe 2 - macrolídeos - eritromicina, azitromicina. Classe 3 - aminoglicosídeos - estreptomicina, canamicina. Classe 4 - tetraciclinas - oxitetraciclina, doxiciclina. 5 células - polipeptídeos - polimixina. 6 células - poliennistatina 7cl - ansamicina - rifampicina .

2. Dependendo do mecanismo de ação, existem cinco grupos de antibióticos: 1.gr antibióticos que perturbam a síntese da parede celular - β-lactâmicos. 2.gr antibióticos que perturbam a organização molecular e a síntese das membranas celulares - polimixinas, polienos; 3.gr antibióticos que perturbam a síntese de proteínas - aminoglicosídeos, tetraciclinas, macrólidos, cloranfenicol. 4.gr antibióticos - inibidores da síntese de ácidos nucleicos - quinolonas perturbam o DNA síntese , rifampicina - síntese de RNA;5.gr antibióticos que suprimem a síntese de purinas e aminoácidos - sulfonamidas.De acordo com o espectro de ação, os antibióticos são divididos em cinco grupos dependendo dos microrganismos que afetam. Cada um desses grupos inclui dois subgrupos: antibióticos de amplo espectro e antibióticos de espectro estreito. Os antibióticos antibacterianos constituem o maior grupo de medicamentos.

a) antibióticos de amplo espectro afetam representantes de todos os três departamentos de bactérias - aminoglicosídeos, tetraciclinas, etc.

b) Os antibióticos de espectro estreito são eficazes contra uma pequena gama de bactérias - os peixes-bruxa agem sobre os Gracilicutae, a vancomicina afeta as bactérias Gram-positivas.

2g - medicamentos antituberculose, antihanseníase, antissifilíticos.

3. Antibióticos antifúngicos.

a) A anfotericina B possui amplo espectro de ação, eficaz contra candidíase, blastomicose e aspergilose; ao mesmo tempo

b) um antibiótico de espectro estreito. - a nistatina, agindo sobre fungos do gênero Candida, é

4. Os antibióticos antiprotozoários e antivirais incluem um pequeno número de medicamentos.

5. Os antibióticos antitumorais são medicamentos com efeito citotóxico. A maioria deles é usada para muitos tipos de tumores - mitomicina C. O efeito dos antibióticos nos microrganismos está associado à sua capacidade de suprimir certas reações bioquímicas que ocorrem na célula microbiana.

2. Teorias da imunidade.1.Teoria da imunidade Mechnikov – a fagocitose desempenha um papel decisivo na imunidade antibacteriana. I. I. Mechnikov foi o primeiro a considerar a inflamação como um fenômeno protetor e não destrutivo. O cientista chamou as células protetoras que agem dessa forma de “células devoradoras”. Seus jovens colegas franceses sugeriram o uso de raízes gregas com o mesmo significado. I. I. Mechnikov aceitou esta opção e o termo “fagócito” apareceu. 2.Teoria da imunidade Ehrlich é uma das primeiras teorias de formação de anticorpos, segundo a qual as células possuem receptores específicos para antígenos que são liberados como anticorpos sob a influência de um antígeno. Ehrlich chamou as substâncias antimicrobianas no sangue de “anticorpos”. P. Ehrlich percebeu que antes mesmo do contato com um micróbio específico, o corpo já possui anticorpos na forma que ele chamou de “cadeias laterais” - são receptores de linfócitos para antígenos. Então Ehrlich “aplicou” isso à farmacologia: em sua teoria da quimioterapia, ele assumiu a pré-existência de receptores para substâncias medicinais no corpo. Em 1908, P. Ehrlich recebeu o Prêmio Nobel pela teoria humoral da imunidade. 3. Teoria da imunidade de Bezredki- uma teoria que explica a defesa do organismo contra uma série de doenças infecciosas através do surgimento de imunidade celular local específica a agentes patogénicos. 4. Teorias instrucionais imunidade é o nome geral das teorias de formação de anticorpos, segundo as quais o protagonismo da resposta imune é dado a um antígeno que participa diretamente como matriz na formação de uma configuração específica de um antideterminante ou atua como fator que muda direcionalmente a biossíntese de imunoglobulinas pelas células plasmáticas.

3. O agente causador do botulismo. gênero Clostridium espécie Clostridium botulinum causa botulismo - intoxicação alimentar caracterizada por danos ao sistema nervoso central. A doença ocorre como resultado da ingestão de alimentos contendo toxinas C. Botulínicas - bastonetes gram-positivos com extremidades arredondadas. Tem o formato de uma raquete de tênis. Não forma cápsula. Móvel. Anaeróbios obrigatórios. Com base nas suas propriedades antigênicas, são divididos em 7 sorovares. A exotoxina botulínica é o mais poderoso de todos os venenos biológicos, tendo efeito neurotóxico (a dose letal para humanos é de cerca de 0,3 mcg). Diagnóstico microbiológico. Detecção e identificação de toxina botulínica no material de teste utilizando a reação de hemaglutinação indireta reversa (RONGA), reação de neutralização da toxina com antitoxina (soro antitóxico) em animais de laboratório. Método bacteriológico para detecção de patógenos no material em estudo. Prevenção específica. Os toxóides botulínicos A, B, E estão incluídos na sextanatoxina, utilizada conforme as indicações. Para profilaxia passiva de emergência, é possível usar soros antitóxicos antibotulínicos Tratamento. São utilizados soros heterólogos antibotulínicos antitóxicos e imunoglobulinas homólogas.

Cultivo. No ágar sangue forma pequenas colônias transparentes circundadas por uma zona de hemólise. Resistência. Os esporos de C. botulinum apresentam resistência muito elevada a altas temperaturas.

Epidemiologia. Do solo, o bacilo botulínico entra nos produtos alimentícios, onde se multiplica e libera exotoxina. A via de transmissão da infecção é a alimentação. O fator mais comum na transmissão da infecção são os alimentos enlatados (cogumelos, vegetais, carne, peixe). A doença não é transmitida de pessoa para pessoa. Patogênese. A toxina botulínica entra no trato digestivo com os alimentos. Resistente à ação das enzimas digestivas, a toxina é absorvida através da parede intestinal para o sangue e causa toxinemia de longa duração. A toxina se liga às células nervosas e bloqueia a transmissão de impulsos através das sinapses neuromusculares. Como resultado, desenvolve-se paralisia dos músculos da laringe, faringe e músculos respiratórios, o que leva à dificuldade de engolir e respirar, e são observadas alterações nos órgãos da visão. Quadro clínico. O período de incubação dura de 6 a 24 horas a 2 a 6 dias. Quanto menor o período de incubação, mais grave é a doença. Geralmente a doença começa de forma aguda, mas a temperatura corporal permanece normal. São possíveis várias variantes do botulismo - com predominância de sintomas de danos ao trato digestivo, deficiência visual ou função respiratória. No primeiro caso, a doença começa com aparecimento de boca seca, náuseas, vômitos e diarreia. Na segunda, as primeiras manifestações da doença estão associadas à deficiência visual (o paciente queixa-se de “névoa” diante dos olhos e visão dupla). Como resultado da paralisia dos músculos da laringe, surge a rouquidão e depois a voz desaparece. Os pacientes podem morrer de paralisia respiratória. A doença pode ser complicada por pneumonia aguda, miocardite tóxica e sepse. A taxa de mortalidade por botulismo é de 15-30%. Imunidade. não formado. Os anticorpos produzidos durante o curso da doença são direcionados contra um sorovar específico.

1.Métodos para determinar a sensibilidade das bactérias aos antibióticos. 1) Método de difusão em ágar. O micróbio em estudo é inoculado em meio nutriente ágar e, em seguida, são adicionados antibióticos. Os medicamentos são adicionados em poços especiais em ágar ou discos com antibióticos são colocados na superfície da inoculação (“método do disco”). Os resultados são registrados em dias alternados com base na presença ou ausência de crescimento microbiano ao redor dos orifícios (discos). 2) Métodos de determinação. nível mínimo de antibiótico, o que permite in vitro impedir o crescimento visível de micróbios no meio nutriente ou esterilizá-lo completamente. A) Determinação da sensibilidade das bactérias aos antibióticos pelo método do disco. A cultura bacteriana em estudo é semeada em ágar nutriente ou meio AGV em placa de Petri. B) Meio AGV: caldo de peixe nutriente seco, ágar-ágar, fosfato de sódio dissubstituído. C) Discos de papel contendo certas doses de diferentes antibióticos são colocados na superfície inoculada com uma pinça, a distâncias iguais uns dos outros. As culturas são incubadas a 37 °C até ao dia seguinte. O diâmetro das zonas de inibição do crescimento da cultura bacteriana estudada é utilizado para avaliar sua sensibilidade aos antibióticos.

D) Determinação da sensibilidade das bactérias aos antibióticos pelo método de diluições seriadas. determinar a concentração mínima do antibiótico que inibe o crescimento da cultura bacteriana de teste.

E) A avaliação dos resultados da determinação da sensibilidade dos microrganismos aos antibióticos é realizada por meio de uma tabela especial pronta, que contém os valores limites dos diâmetros das zonas de inibição do crescimento para cepas resistentes, moderadamente resistentes e sensíveis, bem como os valores de CIM de antibióticos para cepas resistentes e sensíveis. 3) Determinação de antibióticos no sangue, urina e outros fluidos do corpo humano. Duas fileiras de tubos de ensaio são colocadas em um rack. Em um deles são preparadas diluições do antibiótico padrão, no outro são preparadas diluições do líquido teste. Em seguida, uma suspensão de bactérias de teste preparada em meio Hiss com glicose é adicionada a cada tubo de ensaio. Ao determinar penicilina, tetraciclinas e eritromicina no líquido de teste, a cepa padrão de S. aureus é usada como bactéria de teste e, ao determinar a estreptomicina, é usada E. coli. Após incubação das culturas a 37 °C durante 18-20 horas, os resultados da experiência são notados pela turbidez do meio e pela sua coloração com um indicador devido à degradação da glicose pelas bactérias de teste. A concentração do antibiótico é determinada multiplicando a diluição mais elevada do líquido de teste, que inibe o crescimento das bactérias de teste, pela concentração mínima do antibiótico de referência, que inibe o crescimento das mesmas bactérias de teste. Por exemplo, se a diluição máxima do líquido de teste que inibe o crescimento das bactérias de teste for 1:1024, e a concentração mínima do antibiótico de referência que inibe o crescimento das mesmas bactérias de teste for 0,313 μg/ml, então o produto 1024 - 0,313 = 320 μg/ml é a concentração do antibiótico em 1 ml.

4) Determinação da capacidade de S. aureus em produzir beta-lactamase. Em um frasco com 0,5 ml de caldo de cultura diário de uma cepa padrão de estafilococos sensíveis à penicilina, adicione 20 ml de ágar nutriente derretido e resfriado a 45 ° C, misture e despeje em uma placa de Petri. Após a solidificação do ágar, um disco contendo penicilina é colocado no centro da placa na superfície do meio. As culturas em estudo são semeadas em loop ao longo dos raios do disco. As culturas são incubadas a 37 °C até ao dia seguinte, após o qual são anotados os resultados da experiência. A capacidade das bactérias estudadas de produzir beta-lactamase é avaliada pela presença de crescimento de uma cepa padrão de estafilococos em torno de uma ou outra cultura de teste (ao redor do disco).

2. Distúrbios do sistema imunitário: imunodeficiências primárias e secundárias.Imunodeficiências - são perturbações do estado imunitário normal causadas por um defeito num ou mais mecanismos da resposta imunitária. Imunodeficiências primárias ou congénitas. As perturbações do sistema imunitário podem afectar tanto as principais ligações específicas no funcionamento do sistema imunitário como factores que determinam resistência inespecífica. São possíveis variantes combinadas e seletivas de distúrbios imunológicos. Dependendo do nível e da natureza dos distúrbios, distinguem-se as imunodeficiências humorais, celulares e combinadas.

Causas: duplicação cromossômica, mutações pontuais, defeitos nas enzimas do metabolismo dos ácidos nucléicos, distúrbios da membrana geneticamente determinados, danos ao genoma no período embrionário, etc. As imunodeficiências primárias aparecem nos estágios iniciais do período pós-natal e são herdadas de forma autossômica recessiva. Manifestações– insuficiência de fagocitose, sistema complemento, imunidade humoral (sistema B), imunidade celular (sistema T). Imunodeficiências secundárias ou adquiridas As imunodeficiências secundárias, ao contrário das primárias, desenvolvem-se em indivíduos com um sistema imunológico funcionando normalmente desde o nascimento. Eles são formados sob a influência do meio ambiente no nível fenotípico e são causados ​​​​por disfunções do sistema imunológico como resultado de várias doenças ou efeitos adversos no corpo. Os sistemas imunológicos T e B e fatores de resistência inespecíficos são afetados; suas combinações também são possíveis. As imunodeficiências secundárias são muito mais comuns que as primárias. As imunodeficiências secundárias são passíveis de imunocorreção,

As imunodeficiências secundárias podem ser:

após infecções (especialmente virais) e invasões (protozoários e helmintíases);

para queimaduras;

com uremia; para tumores;

com distúrbios metabólicos e exaustão;

com disbiose;

para lesões graves, operações cirúrgicas extensas, especialmente aquelas realizadas sob anestesia geral; sob irradiação, exposição a produtos químicos;

ao envelhecer,

medicamentos relacionados ao uso de medicamentos.

De acordo com a clínica atuais são diferenciados: 1) compensados, - aumento da suscetibilidade do corpo a agentes infecciosos. 2) subcompensado - cronicidade dos processos infecciosos.

3) descompensada - infecções generalizadas causadas por micróbios oportunistas (OPM) e neoplasias malignas.

3. O agente causador da amebíase. Taxonomia. Característica. Diagnóstico microbiológico. Tratamento específico. A amebíase é uma doença infecciosa causada por Entamoeba histolytica, acompanhada de lesões ulcerativas do cólon; possível formação de abscessos em diversos órgãos; ocorre cronicamente. Protozoários, filo Sarcomastidophora, subfilo Sarcodina.

Morfologia e cultivo. O patógeno existe em dois estágios de desenvolvimento: vegetativo e cístico. O estágio vegetativo apresenta diversas formas (tecido, vegetativo grande, luminal e pré-cístico). O cisto (estágio de repouso) tem formato oval e é formado a partir de formas vegetativas no intestino. A infecção ocorre quando os cistos do patógeno entram no intestino, onde as formas vegetativas intestinais são formadas a partir deles.

Resistência. Fora do corpo, os tecidos e as formas luminais do patógeno morrem rapidamente (em 30 minutos). Os cistos são estáveis ​​no ambiente, permanecendo nas fezes e na água a uma temperatura de 20ºC durante um mês. Nos alimentos, vegetais e frutas, os cistos persistem por vários dias.

Mecanismo de transmissão – fecal-não-oral. A infecção ocorre quando os cistos são introduzidos com alimentos, principalmente vegetais e frutas, e menos frequentemente com água, por meio de utensílios domésticos. A propagação dos cistos é facilitada por moscas e baratas.

Patogênese e quadro clínico. Os cistos que entram no intestino e as formas de amebas formadas pelo lúmen podem viver nele sem causar doenças. Quando a resistência do corpo diminui, as amebas penetram na parede intestinal e se multiplicam. A amebíase intestinal se desenvolve. Este processo é facilitado por alguns representantes da microflora intestinal. A parte superior do cólon e às vezes o reto são afetados com a formação de úlceras. São observadas fezes moles frequentes. Elementos purulentos e muco são encontrados nas fezes. A perfuração da parede intestinal pode ocorrer com o desenvolvimento de peritonite purulenta. As amebas com a corrente sanguínea podem entrar no fígado, nos pulmões e no cérebro - desenvolve-se amebíase extraintestinal. Pode ocorrer amebíase cutânea, desenvolvendo-se como resultado de um processo secundário. Erosão e úlceras levemente dolorosas se formam na pele da região perianal, períneo e nádegas. Imunidade. Na amebíase, a imunidade é instável. Tratamento e prevenção. Os seguintes medicamentos são utilizados no tratamento: atuando em amebas localizadas na luz intestinal (derivados de hidroxiquinolina - quiniofone, enteroseptol, mexaform, intestopan, além de compostos de arsênico - aminarsona, osarsol, etc.); agindo em formas teciduais de amebas (preparações de emetina); atuando nas formas luminais de amebas e amebas localizadas na parede intestinal (tetraciclinas); agindo sobre amebas em qualquer localização (derivados de imidazol - metronidazol). Prevenção a amebíase está associada à identificação e tratamento de excretores de cistos e portadores de amebas.

Diagnóstico microbiológico. O principal método é um exame microscópico das fezes do paciente, bem como do conteúdo dos abscessos dos órgãos internos. Os esfregaços são corados com solução de Lugolv ou hematoxilina para identificar cistos e trofozoítos. Método sorológico: RIGA, ELISA, RSK, etc. O maior título de anticorpos é detectado na amebíase extraintestinal.

Os métodos de diagnóstico laboratorial de infecções virais são divididos em vários grandes grupos.

- Métodos diretos, que consistem na identificação do próprio vírus ou de anticorpos contra ele diretamente em material biológico.

- Os métodos indiretos envolvem a produção artificial do vírus em quantidades significativas e sua posterior análise.

Os métodos diagnósticos mais relevantes na prática diária incluem:

Métodos de diagnóstico sorológico - detecção de certos anticorpos ou antígenos no soro sanguíneo do paciente como resultado da reação antígeno-anticorpo (AG-AT). Ou seja, na busca por um antígeno específico em um paciente, utiliza-se o anticorpo correspondente sintetizado artificialmente e, consequentemente, vice-versa, na identificação de anticorpos, utilizam-se antígenos sintetizados.

Reação de imunofluorescência (RIF)

Baseado no uso de anticorpos marcados com corante. Se um antígeno viral estiver presente, ele se liga aos anticorpos marcados e uma cor específica é observada ao microscópio, o que indica um resultado positivo. Com este método, infelizmente, é impossível uma interpretação quantitativa do resultado, mas apenas qualitativa.

A possibilidade de determinação quantitativa é fornecida por ensaio imunoenzimático (ELISA). É semelhante ao RIF, porém, não são utilizados corantes como marcadores, mas sim enzimas que convertem substratos incolores em produtos coloridos, o que permite quantificar o conteúdo de antígenos e anticorpos.

- Anticorpos e antígenos não ligados são eliminados.

- É adicionado um substrato incolor, e nos poços com o antígeno que estamos detectando ocorrerá coloração, pois haverá uma enzima associada ao antígeno, após a qual a intensidade da luminescência do produto colorido será avaliada por meio de um aparelho especial.

Os anticorpos são detectados de maneira semelhante.

Reação de hemaglutinação indireta (passiva) (IPHA).

O método é baseado na capacidade dos vírus de se ligarem aos glóbulos vermelhos. Normalmente, os glóbulos vermelhos caem para o fundo da placa, formando o chamado botão. Porém, se houver um vírus no material biológico em estudo, ele ligará os glóbulos vermelhos em um chamado guarda-chuva que não cairá no fundo do poço.

Se a tarefa é identificar anticorpos, isso pode ser feito usando reação de inibição da hemaglutinação (HAI). Várias amostras são instiladas no poço com o vírus e os glóbulos vermelhos. Se houver anticorpos, eles se ligarão ao vírus e os glóbulos vermelhos cairão para o fundo, formando um “botão”.

Agora vamos nos concentrar nos métodos para diagnosticar diretamente os ácidos nucléicos dos vírus em estudo, eEm primeiro lugar, sobre PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) .

A essência deste método é detectar um fragmento específico de DNA ou RNA de um vírus, copiando-o várias vezes sob condições artificiais. A PCR só pode ser realizada com DNA, ou seja, para vírus RNA é necessário primeiro realizar uma reação de transcrição reversa.

A PCR é realizada diretamente em um dispositivo especial denominado termociclador, ou termociclador, que mantém a temperatura necessária. A mistura de PCR consiste em DNA adicionado, que contém o fragmento de nosso interesse, primers (um pequeno fragmento de ácido nucléico, complementar ao DNA alvo, serve como primer para a síntese da cadeia complementar), DNA polimerase e nucleotídeos.

Estágios do ciclo de PCR:

- A desnaturação é o primeiro estágio. A temperatura sobe para 95 graus, as cadeias de DNA divergem umas das outras.

- Recozimento de primers. A temperatura é reduzida para 50-60 graus. Os primers encontram uma região complementar da cadeia e se ligam a ela.

- Síntese. A temperatura é novamente elevada para 72, esta é a temperatura de trabalho da DNA polimerase, que, a partir dos primers, constrói cadeias filhas.

O ciclo se repete muitas vezes. Após 40 ciclos, uma molécula de DNA produz 10*12 graus de cópias do fragmento desejado.

Ao realizar PCR em tempo real, as cópias sintetizadas de um fragmento de DNA são marcadas com um corante. O aparelho registra a intensidade do brilho e constrói gráficos do acúmulo do fragmento desejado à medida que a reação avança.

Métodos modernos de diagnóstico laboratorial com alta confiabilidade permitem detectar a presença de um vírus patogênico no organismo, muitas vezes muito antes do aparecimento dos primeiros sintomas da doença.

Diagnóstico laboratorial

UDC-078

Diagnóstico laboratorial de infecções virais

N.N. Nosik, V.M. Stakhanov

Instituto de Virologia com o nome. DI. Ivanovsky RAMS, Moscou

Diagnóstico laboratorial de infecções virais

N.N. Nosik, V.M. Stachanova

Introdução

A ampliação das oportunidades de tratamento e prevenção de doenças virais por meio de medicamentos antivirais, imunomoduladores e vacinas com diferentes mecanismos de ação requer diagnósticos laboratoriais rápidos e precisos. A estreita especificidade de alguns medicamentos antivirais também requer um diagnóstico rápido e altamente específico do agente infeccioso. Há necessidade de métodos quantitativos para detecção de vírus para monitorar a terapia antiviral. Além de estabelecer a etiologia da doença, o diagnóstico laboratorial é importante na organização das medidas antiepidêmicas.

O diagnóstico precoce dos primeiros casos de infecções epidêmicas permite a implementação oportuna de medidas antiepidêmicas - quarentena, hospitalização, vacinação, etc. A implementação de programas de eliminação de doenças infecciosas, como a varíola, tem mostrado que à medida que são implementados, o papel de diagnósticos laboratoriais aumenta. O diagnóstico laboratorial desempenha um papel significativo nos serviços de sangue e na prática obstétrica, por exemplo, identificando dadores infectados vírus da imunodeficiência humana(HIV), vírus da hepatite B (HBV), diagnóstico de rubéola e infecção por citomegalovírus em gestantes.

Métodos de diagnóstico

No diagnóstico laboratorial de infecções virais existem três abordagens principais (Tabela 1, Tabela 2):

1) exame direto do material quanto à presença de antígeno viral ou ácidos nucléicos;

2) isolamento e identificação do vírus em material clínico;

3) diagnóstico sorológico, baseado no estabelecimento de aumento significativo de anticorpos virais durante o curso da doença.

Com qualquer abordagem escolhida para o diagnóstico viral, um dos fatores mais importantes é a qualidade do material que está sendo estudado. Assim, por exemplo, para análise direta de uma amostra ou para isolamento de vírus, o material de teste deve ser obtido logo no início da doença, quando o patógeno ainda é excretado em quantidades relativamente grandes e ainda não está ligado a anticorpos, e o o volume da amostra deve ser suficiente para testes diretos. Também é importante selecionar o material de acordo com a doença esperada, ou seja, aquele em que, pela patogênese da infecção, a probabilidade da presença do vírus é maior.

Um papel importante no sucesso do diagnóstico é desempenhado pelo ambiente em que o material é levado, como é transportado e como é armazenado. Assim, os esfregaços nasofaríngeos ou retais e o conteúdo das vesículas são colocados em um meio contendo uma proteína que evita a rápida perda de infecciosidade do vírus (se for planejado isolá-lo), ou em um tampão apropriado (se for planejado para trabalhar com ácidos nucléicos).

Métodos diretos para diagnóstico de material clínico

Métodos diretos são métodos que detectam um vírus, antígeno viral ou vírus ácido nucleico(NC) diretamente no material clínico, ou seja, são os mais rápidos (2–24 horas). Porém, devido a uma série de características dos patógenos, os métodos diretos apresentam suas limitações (possibilidade de obtenção de resultados falso-positivos e falso-negativos). Portanto, muitas vezes exigem confirmação por métodos indiretos.

Microscopia eletrônica (EM). Usando este método, você pode detectar o próprio vírus. Para determinar com sucesso o vírus, a sua concentração na amostra deve ser de aproximadamente 1,10 6 partículas por 1 ml. Mas como a concentração do patógeno no material dos pacientes é, via de regra, insignificante, a busca pelo vírus é difícil e requer sua sedimentação preliminar por centrifugação em alta velocidade seguida de contraste negativo. Além disso, o EM não permite a tipagem de vírus, pois muitos deles não apresentam diferenças morfológicas dentro da família. Por exemplo, os vírus herpes simplex, citomegalia ou herpes zoster são morfologicamente praticamente indistinguíveis.

Uma das opções EM utilizadas para fins de diagnóstico é microscopia eletrônica imunológica(IEM), em que são utilizados anticorpos específicos para vírus. Como resultado da interação dos anticorpos com os vírus, formam-se complexos que são mais fáceis de detectar após contraste negativo.

O IEM é ligeiramente mais sensível que o EM e é usado nos casos em que o vírus não pode ser cultivado em vitro, por exemplo, na busca por patógenos de hepatites virais.

Reação de imunofluorescência (RIF). O método baseia-se na utilização de anticorpos acoplados a um corante, como o isotiocianato de fluoresceína. O RIF é amplamente utilizado para detectar antígenos virais em material de pacientes e para diagnóstico rápido.

Na prática, são utilizadas duas variantes de RIF: direto E indireto. No primeiro caso, são utilizados anticorpos contra vírus marcados com corante, que são aplicados nas células infectadas (esfregaço, cultura celular). Assim, a reação prossegue em uma etapa. A inconveniência do método é a necessidade de se ter um grande conjunto de soros específicos conjugados para muitos vírus.

Na versão indireta do RIF, um soro específico é aplicado ao material de teste, cujos anticorpos se ligam ao antígeno viral localizado no material, e em seguida o soro antiespécie é aplicado em camadas nas gamaglobulinas do animal no qual o foram preparados soros imunes específicos, por exemplo, anti-coelho, anti-cavalo, etc. Vantagem A versão indireta do RIF consiste na necessidade de apenas um tipo de anticorpo marcado.

O método RIF é amplamente utilizado para decifrar rapidamente a etiologia das infecções virais respiratórias agudas na análise de esfregaços de impressões digitais da membrana mucosa do trato respiratório superior. O uso bem-sucedido do RIF para detecção direta do vírus em material clínico só é possível se contiver um número suficientemente grande de células infectadas e uma pequena contaminação com microrganismos que possam dar um brilho inespecífico.

Ensaio imunoenzimático (ELISA). Os métodos de imunoensaio enzimático para determinação de antígenos virais são, em princípio, semelhantes ao RIF, mas são baseados na marcação de anticorpos com enzimas em vez de corantes. As mais utilizadas são a peroxidase de rábano e a fosfatase alcalina; também são utilizadas β-galactosidase e β-lactamases. Os anticorpos marcados ligam-se ao antígeno e este complexo é detectado quando é adicionado um substrato para a enzima à qual os anticorpos são conjugados. O produto final da reação pode estar na forma de um precipitado insolúvel, e então o registro é feito em um microscópio de luz convencional, ou na forma de um produto solúvel, que geralmente é colorido (ou pode apresentar fluorescência ou luminescência) e é gravado instrumentalmente.

Como o ELISA pode medir antígenos solúveis, não há necessidade de células intactas na amostra e, portanto, uma variedade de material clínico pode ser utilizada.

Outra vantagem importante do método ELISA é a capacidade de quantificar antígenos, o que permite sua utilização para avaliar o curso clínico da doença e a eficácia da quimioterapia. O ELISA, assim como o RIF, pode ser usado direta e indiretamente.

O ELISA de fase sólida, que produz um produto de reação solúvel e colorido, é o mais difundido. O ELISA pode ser usado tanto para determinar o antígeno (em seguida, os anticorpos são aplicados na fase sólida - o fundo do poço de uma placa de poliestireno) quanto para determinar os anticorpos (em seguida, os antígenos são aplicados na fase sólida).

Radioimunoensaio (RIA) . O método baseia-se na marcação de anticorpos com radioisótopos, o que garante alta sensibilidade na determinação do antígeno viral. O método se difundiu na década de 80, principalmente para determinação de marcadores de HBV e outros vírus não cultiváveis. As desvantagens do método incluem a necessidade de trabalhar com substâncias radioativas e o uso de equipamentos caros (contadores gama).

Métodos moleculares. Inicialmente, o método clássico de identificação do genoma viral era considerado o método altamente específico de hibridização de NA, mas hoje em dia o isolamento de genomas virais utilizando reação em cadeia da polimerase(PCR).

Hibridização molecular de ácidos nucleicos. O método baseia-se na hibridização de fitas complementares de DNA ou RNA para formar estruturas de fita dupla e sua identificação por meio de um marcador. Para tanto, são utilizadas sondas especiais de DNA ou RNA, marcadas com um isótopo (32 P) ou biotina, que detectam fitas complementares de DNA ou RNA. Existem diversas variantes do método: – hibridização pontual – NA isolado e desnaturado é aplicado aos filtros e depois é adicionada uma sonda marcada; indicação dos resultados - autorradiografia com 32 P ou coloração - com avidina-biotina; – a hibridização por blot é um método para isolar fragmentos de NA cortados com endonucleases de restrição do DNA total e transferidos para filtros de nitrocelulose e testados com sondas marcadas; usado como teste confirmatório para infecção por HIV; – hibridização no local– permite determinar NK em células infectadas.

PCR baseado no princípio da replicação natural do DNA. A essência do método é repetir vários ciclos de síntese (amplificação) de uma sequência de DNA específica do vírus usando Taq DNA polimerase termoestável e dois primers específicos - os chamados primers.

Cada ciclo consiste em três etapas com diferentes condições de temperatura. Em cada ciclo, o número de cópias da região sintetizada duplica. Fragmentos de DNA recém-sintetizados servem como modelo para a síntese de novas fitas no próximo ciclo de amplificação, o que permite, em 25-35 ciclos, produzir um número suficiente de cópias da seção de DNA selecionada para sua determinação, geralmente usando eletroforese em um gel de agarose.

O método é altamente específico e muito sensível. Permite detectar várias cópias do DNA viral no material em estudo. Nos últimos anos, a PCR tem sido cada vez mais utilizada para o diagnóstico e monitoramento de infecções virais (vírus da hepatite, herpes, citomegalia, papilomas, etc.).

Foi desenvolvida uma variante quantitativa de PCR que permite determinar o número de cópias de um sítio de DNA amplificado. A técnica é complexa, cara e ainda não suficientemente unificada para uso rotineiro.

Métodos citológicos atualmente têm valor diagnóstico limitado, mas ainda devem ser usados ​​para diversas infecções. São examinados materiais de autópsia, biópsias e esfregaços que, após processamento adequado, são corados e analisados ​​​​ao microscópio. No caso da infecção por citomegalovírus, por exemplo, células gigantes características – “olhos de coruja” – são encontradas em secções de tecido ou na urina; no caso da raiva, são encontradas inclusões no citoplasma das células (corpos de Babes-Negri). Em alguns casos, por exemplo, no diagnóstico diferencial de hepatite crônica, é importante avaliar o estado do tecido hepático.

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As reações sorológicas são designadas de acordo com os fenômenos que acompanham a formação do complexo antígeno-anticorpo durante a interação de componentes com propriedades diferentes. Existem reações de aglutinação, precipitação e lise.

Reação de aglutinação (AR)

A reação de aglutinação (AR) baseia-se na utilização de um antígeno corpuscular (suspensão de bactérias, eritrócitos sensibilizados, partículas de látex, etc.) interagindo com anticorpos específicos, resultando na precipitação do complexo antígeno-anticorpo resultante. Esta reação é amplamente utilizada na prática laboratorial para o diagnóstico sorológico de infecções bacterianas e para a identificação de microrganismos isolados.

A AR é usada para diagnosticar muitas doenças infecciosas: brucelose (reação de Wright, Heddleson), tularemia, leptospirose (RAL - reação de aglutinação e lise de Leptospira), listeriose, tifo (RAR - reação de aglutinação de Rickettsia), shigelose, yersiniose, pseudotuberculose, etc.

Reação de aglutinação indireta ou passiva (RIGA ou RPGA).

Para encenar esta reacção utilizam-se glóbulos vermelhos de animais (ovinos, macacos, porquinhos-da-índia, algumas aves) sensibilizados com anticorpos ou antigénio, o que se consegue incubando uma suspensão de glóbulos vermelhos e uma solução de antigénio ou soro imune.

Os diagnósticos obtidos com base em eritrócitos sensibilizados com antígenos são chamados diagnóstico de antígeno eritrocitário. Destinam-se à determinação de anticorpos em diluições seriadas de soros sanguíneos, por exemplo, eritrócitos shigella diagnosticums, eritrócitos salmonella O-diagnosticums.

Assim, os diagnósticos baseados em eritrócitos sensibilizados com imunoglobulinas específicas são chamados anticorpos(imunoglobulina) diagnóstico e servem para detectar antígenos em vários materiais, por exemplo, imunoglobulina eritrocitária difteria diagnosticum para RIGA, usada para detectar exotoxina diftérica de corinebactérias em meio nutriente líquido quando material do nariz e da orofaringe é inoculado nele.

A reação de hemaglutinação é usada para diagnosticar infecções bacterianas (febre tifóide, febre paratifóide, disenteria, brucelose, peste, cólera, etc.) e virais (gripe, infecções adenovirais, sarampo, etc.). Em termos de sensibilidade e especificidade, o RIGA é superior ao AR.

Reação de inibição da hemaglutinação (HAI)

A reação de inibição da hemaglutinação (HAI) é utilizada para titular anticorpos antivirais no soro sanguíneo, bem como para estabelecer o tipo de culturas virais isoladas. O RTGA pode ser usado para diagnosticar infecções virais cujos patógenos possuem propriedades hemaglutinantes.

O princípio do método é que o soro contendo anticorpos contra um tipo específico de vírus suprime sua atividade hemaglutinante e os glóbulos vermelhos permanecem não aglutinados.

Reação passiva de inibição (atraso) da hemaglutinação (RPHA).

Três componentes estão envolvidos no RTPGA: soro imune, antígeno (material de teste) e eritrócitos sensibilizados.

Se o material de teste contiver um antígeno que reage especificamente com os anticorpos do soro padrão imunológico, ele os liga e, com a subsequente adição de eritrócitos sensibilizados com um antígeno homólogo ao soro, não ocorre hemaglutinação.

O RTPHA é utilizado para detectar antígenos microbianos, para sua determinação quantitativa e também para controlar a especificidade do RTPGA.

Reação de aglutinação de látex (RLA)

Partículas de látex são usadas como transportadores de anticorpos (imunoglobulinas). O RLA é um método expresso para diagnóstico de doenças infecciosas, levando em consideração o tempo necessário (até 10 minutos) e a capacidade de detectar antígeno em um pequeno volume de material de teste.

O RLA é usado para indicar antígenos de Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae tipo b, Neisseria meningitidis no líquido cefalorraquidiano, para detectar estreptococos do grupo A em esfregaços de garganta, para diagnosticar salmonelose, yersiniose e outras doenças. A sensibilidade do método é de 1-10 ng/ml, ou 10³ -10⁶ células bacterianas em 1 µl.

Reação de coaglutinação (CoA)

A reação de coaglutinação (CoA) baseia-se na capacidade da proteína A dos estafilococos de anexar imunoglobulinas específicas. RCA - método de diagnóstico expresso - serve para identificar antígenos termoestáveis ​​​​solúveis nas secreções humanas e na composição de complexos imunes circulantes (CIC). A detecção de antígenos específicos na composição do CEC requer sua precipitação preliminar do soro sanguíneo.

Reação de precipitação

Na reação de precipitação (RP), como resultado da interação de anticorpos com antígenos solúveis altamente dispersos (proteínas, polissacarídeos), formam-se complexos com a participação de complemento - precipitados. É um teste sensível usado para detectar e caracterizar uma variedade de antígenos e anticorpos. O exemplo mais simples de PR de alta qualidade é a formação de uma faixa de precipitação opaca em um tubo de ensaio no limite da camada de antígeno no soro imunológico - a reação de precipitação em anel. Vários tipos de RP em ágar semilíquido ou géis de agarose são amplamente utilizados (método de imunodifusão dupla, método de imunodifusão radial, imunoeletroforese).

Reação de fixação de complemento (CFR)

A reação de fixação do complemento (CFR) é baseada no fenômeno da hemólise com a participação do complemento, ou seja, capaz de detectar apenas anticorpos fixadores de complemento.

O RSC é amplamente utilizado para o diagnóstico de muitas infecções bacterianas e virais, infecções por riquétsias, clamídia, mononucleose infecciosa, infecções por protozoários e helmintíases. O CRE é uma reação sorológica complexa na qual estão envolvidos dois sistemas: o teste (soro sanguíneo), representado pelo sistema antígeno-anticorpo e complemento, e o hemolítico (hemácias ovinas + soro hemolítico). O soro hemolítico é soro sanguíneo de coelho inativado pelo calor, imunizado com eritrócitos de ovelha. Contém anticorpos contra glóbulos vermelhos de ovelha.

Um resultado RSC positivo - ausência de hemólise - é observado se o soro teste contiver anticorpos homólogos ao antígeno. Nesse caso, o complexo antígeno-anticorpo resultante liga-se ao complemento e, na ausência de complemento livre, a adição do sistema hemolítico não é acompanhada de hemólise. Se não houver anticorpos correspondentes ao antígeno no soro, não ocorre a formação de um complexo antígeno-anticorpo, o complemento permanece livre e o soro causa hemólise dos glóbulos vermelhos, ou seja, a presença de hemólise é um resultado negativo da reação.

Yushchuk N.D., Vengerov Yu.Ya.