A análise ELISA é uma técnica moderna de diagnóstico laboratorial para um número significativo de doenças diferentes. A abreviatura significa imunoensaio enzimático. A essência da técnica é determinar o título (atividade) dos anticorpos.

A técnica ELISA está atualmente ganhando popularidade significativa. É utilizado na medicina clínica para o diagnóstico de diversas patologias, bem como em estudos experimentais que requerem determinação precisa da concentração de diversos compostos nos meios estudados.

O princípio do método ELISA

O imunoensaio enzimático é uma reação imunológica. Baseia-se na adição de anticorpos específicos
ou antígenos no meio de teste (na maioria das vezes o sangue sendo testado), seguido pela determinação enzimática da concentração dos complexos antígeno-anticorpo resultantes. Com base na concentração do complexo, pode-se avaliar o nível ou atividade do composto que está sendo determinado no meio de teste.

A determinação da concentração de complexos antígeno-anticorpo geralmente é realizada em equipamentos especiais pelo método cromatográfico.

Indicações de uso

A análise ELISA é realizada para diversas indicações, sendo as principais na medicina clínica:

• Diagnóstico de patologia infecciosa com transmissão predominantemente sexual (IST), que inclui clamídia, micoplasmose, ureaplasmose, tricomoníase, identificando anticorpos específicos para o agente infeccioso.
• Diagnóstico de doenças infecciosas de diversas localizações para determinar o estágio do processo patológico, principalmente no processo de diagnóstico de hepatite viral parenteral e HIV.
• Determinação das concentrações hormonais para o diagnóstico de diversas patologias dos órgãos do sistema endócrino (glândulas endócrinas).
• Determinação de diversos compostos para diagnosticar a causa da intoxicação do organismo em caso de envenenamento, picada de inseto ou cobra.

Para estas indicações médicas, é realizado um exame de sangue ELISA. Esta técnica também é utilizada ativamente na medicina experimental durante vários estudos clínicos durante o desenvolvimento de novos medicamentos e vacinas para imunoprofilaxia.

Como a pesquisa é realizada

O exame de sangue por ELISA é realizado em laboratório especializado. Para realizá-la, primeiro é retirado sangue venoso, geralmente da veia cubital em um volume de 5 a 10 ml, que depois é enviado ao laboratório. Em média, o resultado do exame pode ser obtido já no dia seguinte, o que é um ponto importante para a prescrição oportuna do tratamento após o diagnóstico da doença.

Como se preparar para o ELISA

Para obter resultados de pesquisa confiáveis ​​​​usando imunoensaio enzimático, várias recomendações preparatórias simples devem ser seguidas, que incluem:

• Na véspera do teste, você deve parar de comer alimentos gordurosos (carnes, defumados) e álcool.
• O material para estudo deve ser entregue pela manhã com o estômago vazio.
• No dia do estudo, é aconselhável evitar estresse físico e psicoemocional.
• Antes do estudo, você deve tentar não fumar.

A maioria dos resultados falso-positivos de um teste imunoenzimático são devidos à implementação inadequada das recomendações preparatórias. Na maioria dos casos, isso está associado à ingestão de alimentos gordurosos, que levam ao aumento da concentração de triglicerídeos (gorduras) no plasma sanguíneo, o que reduz a especificidade do ELISA.

Decodificando os resultados

Um exame de sangue para anticorpos usando ELISA tem 2 modificações - determinação qualitativa e quantitativa. No
Na determinação qualitativa de anticorpos, o resultado pode ser positivo (são detectados anticorpos, indicando a possível presença de processo patológico causado por agente infeccioso) ou negativo (não há anticorpos, indicando ausência de processo infeccioso).

A ausência de anticorpos nem sempre é um indicador de 100% da ausência de processo infeccioso. Isto se deve ao fato de que após a infecção, os anticorpos não são formados imediatamente, mas durante um determinado período de tempo (pelo menos cerca de 2 semanas). Portanto, para confirmar a ausência de infecção, o ELISA pode ser repetido após algum tempo.

O ELISA quantitativo é utilizado para determinar o título (atividade) dos anticorpos, bem como suas classes. Na maioria dos casos, para diagnosticar doenças infecciosas, são determinados anticorpos das classes IgG (imunoglobulina G) e IgM (imunoglobulina M), que se formam no corpo em vários intervalos após a infecção, portanto, decifrar o resultado do teste pode ter vários significados:

• Um aumento na atividade de IgM e a ausência de IgG são evidências de infecção recente e curso agudo do processo infeccioso.
• Um aumento na atividade de IgM e IgG é uma exacerbação do processo infeccioso durante seu curso crônico e infecção de longa duração.
• A alta atividade de IgG e a ausência de IgM são um curso crônico do processo infeccioso no contexto de uma infecção de longa data, após a qual se passaram mais de seis meses (o tempo necessário para a formação de anticorpos da classe IgG).

Em geral, a decifração dos resultados do ELISA para cada processo infeccioso possui certas características. Uma determinação mais precisa da presença de uma doença infecciosa, bem como do estágio de seu curso, é realizada por um médico.

O ELISA é atualmente o método de escolha para o diagnóstico da maioria das doenças infecciosas. Com base nos resultados desse estudo, o médico tem a oportunidade de estabelecer um diagnóstico preciso e determinar o estágio do processo patológico para prescrever posteriormente um tratamento adequado e eficaz.

ARTIGO FARMACOPÉICO GERAL

Apresentado pela primeira vez

Esta monografia farmacopéica geral aplica-se ao método de ensaio imunoenzimático (ELISA). O método ELISA é um método de imunodiagnóstico altamente sensível e altamente específico, que é utilizado para realizar a determinação qualitativa e quantitativa de diversas substâncias que possuem propriedades de um antígeno, hapteno (antígeno incompleto) ou anticorpo. O método ELISA é amplamente utilizado para o diagnóstico de doenças infecciosas e não infecciosas de humanos e animais e também pode ser utilizado para confirmar a qualidade de medicamentos imunobiológicos (IBPs).

O princípio do método é a interação específica de um antígeno com um anticorpo com a formação de um complexo imune e posterior detecção do complexo resultante por espectrofotometria, quimioluminescência e outras técnicas adequadas. A detecção pode ser direta (quando a própria substância teste tem atividade enzimática, ou é marcada com um rótulo enzimático), ou indireta ou indireta (quando a substância teste, ligada a anticorpos imobilizados na fase sólida, é incubada com enzima marcada anticorpos). A análise qualitativa permite obter informações sobre o conteúdo de antígeno ou anticorpo no material em estudo de acordo com o princípio “sim/”não”. Ao realizar uma análise quantitativa, a concentração de antígeno ou anticorpo no material de teste é determinada por meio de um gráfico de calibração.

DISPOSIÇÕES GERAIS

O método ELISA inclui 3 etapas principais: 1) formação de um complexo imune “antígeno (substância teste) – anticorpo específico para ele” ou vice-versa; 2) a formação de uma ligação entre o conjugado e o complexo imune formado na etapa anterior ou com sítios de ligação livres (determinantes); 3) transformação do substrato sob a ação de um marcador enzimático em um sinal gravado como resultado de uma reação bioquímica.

Todos os métodos de realização de imunoensaios enzimáticos são classificados como homogêneos ou heterogêneos.

Os métodos em que todas as 3 etapas do ELISA ocorrem em solução, e entre as etapas principais não há etapas adicionais para separar os complexos imunes formados dos componentes que não reagiram, pertencem ao grupo dos métodos ELISA homogêneos. A base do ELISA homogêneo, utilizado, via de regra, para a determinação de substâncias de baixo peso molecular, é o processo de inibição da atividade de uma enzima quando ela se combina com um antígeno ou anticorpo. Como resultado da reação antígeno-anticorpo, a atividade enzimática é restaurada. Quando um complexo imune antígeno-anticorpo contendo um marcador enzimático é formado, a atividade da enzima é inibida em 95% em relação ao substrato de alto peso molecular, o que se deve à exclusão estérica do substrato do centro ativo da enzima. À medida que a concentração do antígeno aumenta, mais e mais anticorpos se ligam e permanecem cada vez mais conjugados antígeno-enzima livres, capazes de hidrolisar o substrato de alto peso molecular. O método ELISA homogêneo é muito rápido. Demora 1 minuto para analisar uma definição. A sensibilidade do método é bastante elevada. Pode ser usado para determinar uma substância no nível de picomol.

Os métodos heterogêneos são caracterizados pela análise em um sistema bifásico com a participação de uma fase transportadora sólida e uma etapa obrigatória de separação dos imunocomplexos dos componentes que não reagiram (lavagem), que estão em fases diferentes (os imunocomplexos formados estão no sólido fase e os complexos que não reagiram estão em solução). Os métodos heterogêneos nos quais a formação de complexos imunes no primeiro estágio ocorre na fase sólida são chamados de métodos de fase sólida.

Os métodos são classificados como homogêneos-heterogêneos se a etapa 1 - formação de complexos específicos - ocorrer em solução e, em seguida, uma fase sólida com reagente imobilizado for utilizada para separar os componentes.

O método ELISA heterogêneo consiste em 3 etapas principais:

• imobilização de um antígeno ou anticorpo em uma fase sólida, o complexo resultante é denominado imunoabsorvente;
• remoção do reagente não ligado e bloqueio dos locais de ligação num suporte sólido utilizando proteínas bloqueadoras, tais como albumina, caseína; incubação do medicamento analisado com imunossorvente para que ocorra sua ligação;

3) detecção pela atividade enzimática da própria substância teste ou por rótulo enzimático associado ao medicamento analisado (versão direta). Em alguns casos, é realizada incubação adicional do complexo “imunoabsorvente-substância teste” com anticorpos secundários conjugados a um marcador enzimático (opção indireta).

A determinação quantitativa da substância em estudo é realizada adicionando um substrato adequado ao detector utilizado e comparando o sinal da substância em estudo com uma amostra padrão.

O método ELISA heterogêneo é dividido em ELISA não competitivo e ELISA competitivo. Os esquemas de ensaio podem ser modificados durante o processo de desenvolvimento do medicamento de acordo com os requisitos necessários. As alterações devem ser indicadas na monografia farmacopéica ou na documentação regulatória. A escolha do método ELISA depende da natureza da substância teste e da sua quantidade, uma vez que diferentes tipos de ELISA têm sensibilidades diferentes. Para avaliar a qualidade das substâncias que contêm anticorpos, é possível utilizar anticorpos anti-idiotípicos específicos.

Método ELISA não competitivo

O método ELISA não competitivo é dividido em vários tipos de acordo com o tipo de detecção (competitivo direto, competitivo indireto (indireto)) e de acordo com o tipo de substância imobilizada na fase sólida (antígeno ou anticorpo).

Opção ELISA direto

Pode ser feito de 2 maneiras. No primeiro caso, a substância teste (antígeno) é imobilizada diretamente na fase sólida; então o anticorpo marcado ligado ao antígeno é o detector. Ao realizar o teste de forma diferente, são utilizados anticorpos imobilizados na fase sólida. Neste caso, o detector é a substância teste marcada com uma enzima.

Versão indireta (indireta) do ELISA

Ao realizar a versão indireta do ELISA, o antígeno é imobilizado na fase sólida. Após o bloqueio, uma solução de anticorpos específicos é adicionada ao antígeno. Após a incubação, o complexo antígeno-anticorpo resultante é lavado dos anticorpos não ligados e é adicionada anti-imunoglobulina (anti-Ig) marcada com enzima, que atua como um detector. Os detectores anti-Ig estão disponíveis comercialmente para classes e subclasses específicas de Ig, tornando este formato de ensaio conveniente para isotipagem de anticorpos. Além disso, a utilização de anti-Ig marcado aumenta o sinal em comparação com o método de ensaio imunoenzimático direto, aumentando assim a sensibilidade do ensaio.

O método “sanduíche” como opção para realização de ELISA

O método não competitivo mais comum é o método sanduíche. Quando realizada, os anticorpos primários são imobilizados na fase sólida e posteriormente bloqueados. Em seguida, a substância teste contendo o antígeno é adicionada a eles e incubada. Após a incubação, o complexo antígeno-anticorpo é removido do antígeno não ligado e os anticorpos secundários marcados com uma enzima são adicionados e a detecção é realizada.

Método ELISA competitivo

O método ELISA competitivo é dividido em vários tipos: pelo tipo de detecção (competitivo direto, competitivo indireto (indireto)) e pelo tipo de substância imobilizada na fase sólida (antígeno ou anticorpo).

ELISA competitivo direto

Para detectar ou quantificar antígenos solúveis, utiliza-se uma versão competitiva direta do ELISA com um antígeno imobilizado na fase sólida. Para fazer isso, use anticorpos específicos do antígeno conjugados a um detector apropriado (por exemplo, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, rutênio ou fluoresceína). Um antígeno padrão é imobilizado na fase sólida, seguido de bloqueio. O anticorpo conjugado a um marcador enzimático é incubado com a substância teste (antígeno solúvel). Esta mistura é então adicionada ao antígeno imobilizado, incubada e depois lavada para remover o complexo antígeno-anticorpo não ligado. O próximo passo é adicionar um substrato adequado para a enzima que será usada como marcador. A inibição da reação devido à presença de 2 antígenos no sistema, em comparação com uma amostra controle sem antígeno solúvel competitivo, é inversamente proporcional à quantidade da substância teste.

O ELISA competitivo direto de anticorpos em fase sólida é semelhante ao ELISA competitivo direto de antígeno sólido, mas é usado para detectar ou quantificar anticorpos.

Variante ELISA competitiva indireta (indireta)

Este método ELISA é semelhante à versão competitiva direta, mas em vez de um anticorpo ou antígeno marcado, um reagente anti-Ig marcado ou anticorpos secundários marcados são usados ​​para detecção, respectivamente.

Condições gerais para a realização do métodoELISA

Diversos materiais são utilizados como fase sólida para imunoensaios enzimáticos: silicone, nitrocelulose, poliamidas, poliestireno, policloreto de vinila, polipropileno, acrílico e outros. A fase sólida pode ser as paredes de um tubo de ensaio, placas de 96 poços e outras placas, bolas, esferas, bem como nitrocelulose e outras membranas que absorvem proteínas ativamente. O princípio da imobilização (interação hidrofóbica, hidrofílica, covalente) depende da escolha da fase sólida. Na maioria das vezes, placas de microtitulação plásticas de 96 poços são usadas como fase sólida. O número de poços na placa pode variar. O comprimido pode ser transparente (detecção colorimétrica) ou fosco (detecção quimioluminescente, fluorimetria).

A imobilização deve ser realizada sem bolhas de ar no poço, pois a presença delas altera a leitura da densidade óptica. É possível utilizar reagentes imobilizados biotinilados. Neste caso, a reação utiliza estreptavidina e um marcador enzimático biotinilado. Este método é usado para amplificar o sinal. O tempo e a temperatura de imobilização, dependendo da natureza cinética, estabilidade e concentração do reagente, devem ser indicados na monografia farmacopeica e na documentação regulamentar.

Todas as etapas do imunoensaio enzimático, soluções de lavagem e bloqueio, intervalos de tempo e condições de temperatura para cada etapa, número de rotações por minuto para incubação em shaker, condições de detecção também devem ser especificados na monografia farmacopéica e na documentação regulatória.

Exemplos de métodos para alguns tipos de ELISA

Método ELISA indireto não competitivo

1. Sorção de antígeno. Adicione 0,1-0,5 μg de antígeno e 100 μl de solução tampão de carbonato-bicarbonato 0,05 M (pH 9,6) a cada poço de uma placa de 96 poços, a menos que indicado de outra forma na monografia farmacopéica ou na documentação regulatória, e então realize a sorção em um temperatura de 4°C por 16 horas. É possível utilizar outras soluções tampão com valores de pH elevados. A incubação é realizada agitando num agitador de placas horizontal.

A lavagem (duas vezes) das moléculas de antígeno não ligadas é realizada com solução salina tamponada com fosfato (pH 9,0) contendo 0,1% de Tween-20 (300 μl por poço), salvo indicação em contrário na monografia farmacopéica ou na documentação regulamentar.

1. Bloqueio. Para bloquear locais de ligação inespecífica de antígenos ou anticorpos, os poços do comprimido são preenchidos com solução salina tamponada com fosfato (pH 9,0) ou outra solução tampão especificada na monografia farmacopeica ou na documentação regulatória contendo uma solução de soro bovino a 1% albumina ou outras proteínas (caseína, gelatina, leite em pó, etc.) e incubar durante 10-15 minutos à temperatura ambiente (salvo indicação em contrário na monografia farmacopéica ou na documentação regulamentar).

III. Titulação de anticorpos específicos. Se for necessária uma avaliação quantitativa, a substância teste (antígeno ou anticorpo) é titulada em diluições seriadas em paralelo com a amostra padrão (RM).

A titulação pode ser realizada em fileiras horizontais e verticais da placa. Deve-se notar que a titulação de anticorpos é realizada se for necessário selecionar a concentração ideal de anticorpos ou determinar seu título. Se for determinada a concentração e/ou título ideal de anticorpos, então é utilizada a diluição recomendada para estes anticorpos (soro).

Ao titular, uma diluição pronta de anticorpos é adicionada ao primeiro poço da série - uma média de 1-10 μg por poço, depois a diluição sequencial dos anticorpos é realizada nos poços. A incubação com anticorpos específicos é realizada por 30 minutos à temperatura ambiente com agitação em agitador de placas horizontal.

A lavagem é realizada pelo menos 3-4 vezes usando solução salina tamponada com fosfato pH 9,0 contendo 0,1% de Tween-20.

1. Adição de anticorpos antiespécies (antiglobulina) conjugados a um marcador enzimático. Anticorpos policlonais antiespécies conjugados a um marcador enzimático são usados ​​como anticorpos detectores (secundários). Na maioria das vezes, são utilizados anticorpos de cabra ou coelho, específicos para a molécula inteira ou para os fragmentos Fc de anticorpos específicos. A concentração de anticorpos detectores é geralmente especificada pelo fabricante como uma diluição da solução estoque (por exemplo, 1:1000).

A incubação com anticorpos secundários marcados é realizada durante 30 minutos à temperatura ambiente com agitação num agitador de placas horizontal.

A lavagem é realizada pelo menos 3-4 vezes com solução salina tamponada com fosfato (pH 9,0) contendo 0,1% de Tween-20.

A incubação é realizada durante 10 minutos à temperatura ambiente e agitação num agitador de placas horizontal.

1. 100 μl de solução de substrato são adicionados aos poços e incubados por 10 minutos em temperatura ambiente e agitação constante. Para interromper a reação enzimática, é utilizado um “reagente de parada”, que é adicionado a todas as amostras de teste e controle em quantidades iguais. O ácido sulfúrico é mais frequentemente usado como “reagente de parada”.

Direto não competitivo Método ELISA

O método ELISA direto apresenta apenas pequenas diferenças em relação ao método ELISA indireto não competitivo. Assim, as etapas I e II são iguais nos dois tipos de análise. A diferença é que na versão direta do ELISA, no estágio III, são utilizados anticorpos específicos do antígeno teste, conjugados a um marcador enzimático, e interagem diretamente com a substância teste. Se necessário, a titulação dos conjugados também pode ser realizada de forma semelhante ao princípio descrito anteriormente para anticorpos não conjugados. A etapa IV do ELISA direto não competitivo não é realizada.

Método "sanduíche" ELISA

Esta versão do ELISA utiliza um par de anticorpos (primários e secundários) específicos para epítopos espacialmente distantes do antígeno em estudo.

1. Sorção de anticorpos na fase sólida. A técnica de sorção de antígeno é semelhante à técnica de sorção de anticorpos na seção “Método ELISA indireto não competitivo”.
2. Bloqueio. A técnica de bloqueio de sítios de ligação inespecíficos no substrato (fase sólida) é semelhante à técnica de bloqueio descrita na seção “Método ELISA indireto não competitivo”.

III. Incubação com antígeno. 50 μl da substância de teste e diluições padrão do antígeno são adicionados aos poços da placa com anticorpos pré-adsorvidos, salvo indicação em contrário na monografia farmacopéica ou na documentação regulamentar. As diluições do antígeno devem ser preparadas em solução salina tamponada com fosfato (pH 9,0) contendo Tween-20 a 0,1%, uma vez que o Tween-20 reduz a ligação inespecífica das moléculas de proteína entre si e com a superfície da placa. Tanto a substância de teste como as diluições padrão do antigénio são adicionadas aos pares em poços adjacentes numa fila horizontal (ou em 3 réplicas), utilizando 2 (3) poços para cada diluição de proteína.

A incubação é realizada à temperatura ambiente durante 30 minutos com agitação constante. A lavagem é realizada pelo menos 3-4 vezes com solução salina tamponada com fosfato (pH 9,0) contendo Tween-20 a 0,1%, ou outra solução tampão especificada na monografia farmacopéica ou documentação regulamentar.

1. Incubação com anticorpos conjugados a um marcador enzimático. 100 μl de uma solução de anticorpos específicos conjugados com um marcador enzimático são adicionados aos poços da placa. A concentração ideal de anticorpos conjugados é geralmente indicada na monografia farmacopéica ou na documentação regulatória (geralmente é usada uma concentração de 2–4 μg/ml).

A incubação com anticorpos contendo um marcador enzimático é realizada por 30 minutos à temperatura ambiente com agitação em um agitador de placas horizontal.

A lavagem é realizada pelo menos 3-4 vezes com solução salina tamponada com fosfato (pH 9,0) contendo Tween-20 a 0,1%, ou outra solução tampão especificada na monografia farmacopeica ou documentação regulatória.

1. Realização de uma reação enzimática acompanhada do aparecimento de um produto colorido. A técnica para realizar a reação enzimática é semelhante à técnica descrita na seção: “Método ELISA indireto não competitivo”.

Detecção

Como afirmado acima, os anticorpos marcados com um marcador enzimático ou outro reagente são utilizados para detecção. A etiqueta enzimática pode ser, por exemplo, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina ou galactosidase. Anticorpos ou antígenos com outros rótulos podem ser usados ​​como detector. A escolha do reagente detector depende do tipo de marcador conjugado ao anticorpo ou antígeno e do método de detecção.

Espectrofotometria, quimioluminescência, fluorimetria e outros métodos podem ser utilizados como métodos de detecção, com base na escolha do rótulo.

Resultados do método ELISA quantitativo

Os resultados quantitativos do ELISA são calculados a partir de uma curva de calibração linear com regressão inversa ou por um método complexo usando uma curva de calibração não linear com regressão inversa. O método de interpretação dos resultados depende do método ELISA utilizado. Por exemplo, os resultados do teste podem ser usados ​​para estimar a concentração de uma amostra desconhecida, a metade da concentração máxima de inibição ou a concentração eficaz usando uma curva de calibração. Isto permite determinar a quantidade da substância em estudo ou a sua atividade em comparação com um padrão de referência/calibração (RM). Normalmente, o tipo de curva de calibração ao realizar um método ELISA quantitativo, caracterizando a concentração do medicamento analisado, depende de forma não linear do valor médio calculado. Nesse sentido, recomenda-se a utilização de diversos modelos matemáticos para analisar a curva resultante. Noutros casos, o método ELISA é utilizado como método qualitativo que permite avaliar a presença de uma determinada substância de teste numa amostra dentro dos limites de sensibilidade da técnica.

Observação.

Preparação de solução tampão carbonato-bicarbonato (pH 9,6). Adicionar 1,59 g de carbonato de sódio (anidro) ou 4,29 g de carbonato de sódio 10-aquoso e 2,93 g de bicarbonato de sódio em uma proveta com capacidade para 1000 ml, dissolver em 800 ml de água purificada, ajustar o pH para 9,6, misturar , em seguida, leve o volume da solução até a marca com água purificada e misture novamente.

Contente

Para avaliar a capacidade do corpo de resistir a doenças infecciosas ou para determinar a fase da patologia, é utilizado um exame de sangue. O método ELISA ocupa um lugar importante entre os exames laboratoriais, pois ajuda a estudar de forma abrangente a atividade da função protetora do sangue, determinar a imunodeficiência em doenças infecciosas, doenças do sangue, processos hormonais e autoimunes.

O que é um exame de sangue por imunoensaio enzimático?

Este método refere-se a pesquisas laboratoriais que determinam a presença de fatores sanguíneos protetores de natureza proteica (anticorpos) contra certos agentes patogênicos (antígenos). Um teste imunoenzimático detecta imunoglobulinas, que podem ser encontradas na forma de imunocomplexos. Eles aparecem quando ocorrem reações neuro-humorais complexas da defesa imunológica humana, que se tornam uma resposta à introdução de antígenos estranhos.

O corpo produz anticorpos específicos contra cada tipo de patógeno. Em seguida, o microrganismo patológico ou antígeno se liga e um composto complexo “antígeno-anticorpo” é formado. Em seguida, é neutralizado, ocorre a lise enzimática, ocorre uma reação de fagocitose e o processo termina com a remoção do corpo. A presença de complexos específicos, determinados por ELISA, indica o tipo de patógeno ou substância nociva do paciente.

Aulas de imunoglobulina

Os cientistas descobriram e estudaram 5 tipos de imunoglobulinas: IgE, IgD, IgG, IgM, IgA. Existem outras classes, mas ainda estão em fase de pesquisa e seu papel não é totalmente compreendido. Na medicina prática são importantes A, M, G. O conteúdo da informação e a precisão da determinação baseiam-se nos intervalos de tempo em que aparecem, atingem o máximo e desaparecem.

Indicações para exames de sangue usando ELISA

Usando esta análise, você pode avaliar a eficácia do tratamento, realizar um estudo abrangente antes das operações de transplante, determinar o estado de imunodeficiência e anticorpos para mais de 600 tipos de alérgenos. O exame de sangue usando ELISA é usado como uma forma adicional de detectar células cancerígenas. Uma análise é prescrita se for necessário detectar anticorpos contra micróbios que provocam patologias sexualmente transmissíveis:

• tricomoníase;
• sífilis;
• toxoplasmose;
• micoplasmose;
• ureaplasmose.

No caso de infestações helmínticas, a análise ELISA indicará aumento na quantidade de imunoglobulinas. Estudos são realizados para confirmar se o paciente tem:

• Vírus de Epstein Barr;
• infecções herpéticas;
• citomegalovírus;
• grupo de hepatites virais.

Exame de sangue usando o método ELISA

O exame de sangue por imunoensaio enzimático não é a única opção para determinar imunoglobulinas. Às vezes, para este estudo, são coletados líquido cefalorraquidiano, tecido vítreo e líquido amniótico. Ao usar o sangue, ele é coletado da veia antecubital por meio de uma agulha de injeção. O teste deve ser feito com o estômago vazio, antes do ELISA não é recomendado tomar medicamentos que possam afetar o resultado. Você deve abandonar o álcool, o fumo e o uso de drogas antes de doar o biomaterial. Opções de resultados de teste:

1. Se as imunoglobulinas IgG, IgM, IgA forem negativas, os médicos dizem que não há patologia ou estágio inicial. O mesmo resultado (negativo) ocorrerá após recuperação completa após um longo período.
2. Se IgG for positivo, mas IgM e IgA não forem detectados, isso indica a formação de imunidade após a vacinação ou uma doença infecciosa.
3. Com altos títulos de IgM e IgA, IgG negativos, é feito o diagnóstico de doença infecciosa aguda.
4. Se IgG, IgM, IgA forem positivos, os médicos falam sobre a fase aguda de uma recaída de uma doença crônica existente.
5. Para uma infecção crônica que está em fase de remissão (remissão), o teste ELISA mostra títulos de IgM negativos, enquanto IgA e IgG serão positivos.

Vantagens e desvantagens da análise ELISA

O principal aspecto negativo deste estudo é a possibilidade de obtenção de resultados falsos positivos ou falsos negativos. O motivo da falta de confiabilidade é o uso de medicamentos e defeitos técnicos de laboratório. O processo de distúrbios metabólicos no corpo pode falsificar a análise. As principais vantagens da análise ELISA são:

• precisão, especificidade diagnóstica;
• baixo custo de análise;
• rapidez na obtenção de resultados;
• a possibilidade de monitoramento dinâmico do estágio da patologia e da eficácia do tratamento;
• facilidade de pesquisa;
• a capacidade de realizar exames em massa de focos de infecção;
• indolor, segurança para o paciente;
• aplicação no processamento de tecnologia da informação.

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No diagnóstico de doenças virais de humanos e animais, são amplamente utilizados métodos baseados no uso de enzimas como marcadores de antígenos e anticorpos. Este grupo de métodos é denominado imunoensaio enzimático.

O ELISA é utilizado em duas versões: histoquímica e fase sólida.

A versão histoquímica do ELISA, ou reação de imunoperoxidase, raramente é utilizada. É semelhante ao método de imunofluorescência, mas difere porque a reação é realizada com anticorpos marcados não com fluorocromo, mas com uma enzima.

As enzimas são geralmente usadas para marcar anticorpos: peroxidase de rábano (mais frequentemente), fosfatase alcalina, galactosidase, etc.

Assim, os anticorpos marcados com uma enzima são incluídos no complexo antígeno + anticorpo, e para detectar esse complexo é adicionado um substrato (substância sensível à enzima), que se decompõe sob a ação da enzima, formando um produto colorido da reação enzimática , claramente visível em um microscópio óptico.

Ortofenilenodiamina, ácido 5-aminossalicílico ou benzidina são usados ​​como substratos. Peróxido de hidrogênio (H 2 O 2) é adicionado a eles.

O material para identificação de antígenos virais nesta opção pode ser: esfregaços; impressões de vários órgãos; seções de parafina; culturas de células. Nesse caso, você pode usar métodos diretos e indiretos.

Método direto. Um conjugado (anticorpos para o suposto vírus, marcado com uma enzima) é aplicado à preparação fixada, mantido a 37°C por 1-2 horas em câmara úmida, depois a preparação é lavada com solução salina para remover o conjugado não ligado, seca ao ar, são aplicadas algumas gotas da solução de substrato, incubadas por 5 a 10 minutos e lavadas com solução salina. Em seguida, enxágue com água destilada e o resultado é observado em microscópio óptico. Em casos positivos, ou seja, na presença de antígeno no material de teste, são visíveis uma cor difusa marrom-amarelada ou grânulos marrom-pretos. Nenhuma coloração foi detectada nas preparações de controle.

Método indireto. Na preparação fixada é aplicado um soro específico para o suposto vírus, mantido a 37 °C por 1-2 horas em câmara úmida, lavado com soro fisiológico, seco ao ar e aplicado um soro antiespécie marcado com enzima, mantido a 37°C durante 1-6 horas. Em seguida segue-se o procedimento como no método direto.

Ensaio imunoabsorvente enzimático(TFIFA, REMA - reação de anticorpo marcado com enzima, ELISA - ensaio imunoenzimático) têm sido amplamente utilizados em biologia nos últimos anos, inclusive em virologia. Uma característica do método é que um dos componentes da reação (antígeno ou anticorpo) é fixado em um suporte sólido. Micropainéis de poliestireno, bolas, bastões, etc. são usados ​​​​como transportadores.

Este método pode detectar e identificar antígenos, bem como detectar anticorpos e determinar seu título no soro sanguíneo.

Existem muitas variações do método. Na maioria das vezes, o método direto (método “sanduíche”) é usado para detectar antígenos. Para fazer isso, anticorpos específicos para o suposto antígeno são fixados nos poços dos micropainéis nos quais o antígeno de teste é adicionado e mantidos a 37 °C por 1-2 horas. Em seguida, os micropainéis são lavados com uma solução tampão e os anticorpos marcados com um enzima ao suposto antígeno são adicionados aos poços e mantidos a 37 °C por 1 a 2 horas, lavam os micropainéis, adicionam uma solução de substrato e deixam por 5 a 30 minutos. A reação é interrompida pela adição de uma solução de ácido sulfúrico e levada em consideração visualmente pela diferença de cor das amostras experimentais e de controle ou por espectrofotometria. As amostras positivas são de cor amarela a marrom-alaranjada.

A detecção e determinação do título de anticorpos são realizadas por um método indireto de fase sólida.

Grandes laboratórios de diagnóstico utilizam unidades totalmente automatizadas para a realização de ELISA em fase sólida, que permitem analisar de 1.000 a 4.000 amostras diariamente.

Vantagens do ELISA: alta sensibilidade; especificidade; simplicidade da técnica de estadiamento; um número mínimo de componentes necessários; nenhum equipamento especial é necessário; a avaliação pode ser realizada visualmente; a possibilidade de automação, que permite sua utilização para pesquisas em massa; Os soros de teste não requerem pré-tratamento. Este é um método de diagnóstico expresso, pois você pode obter uma resposta em poucas horas.

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Representando um tipo moderno de pesquisa laboratorial, o ELISA, ou ensaio imunoenzimático, permite encontrar anticorpos ou antígenos específicos para certas doenças no sangue. Isso permite detectar a etiologia da doença e determinar seu estágio. Além disso, os resultados deste tipo de pesquisa podem ser apresentados tanto quantitativa quanto qualitativamente. Então, vejamos detalhadamente o princípio do método de imunoensaio enzimático, sua metodologia e essência.

O que é imunoensaio enzimático

Prescrito para a avaliação mais completa e abrangente da saúde, o imunoensaio enzimático permite avaliar o estado geral de saúde e avaliar suas funções protetoras. Este teste laboratorial permite diagnosticar patologias infecciosas, autoimunes e hematológicas por meio de um exame de sangue.

A essência do imunoensaio enzimático é discutida no vídeo abaixo:

Para quem é prescrito?

Este estudo pode ser prescrito para pacientes diagnosticados com as seguintes doenças:

• doenças de origem viral, que incluem hepatite;
• doenças sexualmente transmissíveis - clamídia, tricomonas, sífilis, ureaplasma, micoplasma;
• imunodeficiência;
• realização de um exame abrangente pré-operatório.

Um exame de sangue ELISA também é prescrito para determinar os níveis hormonais e avaliar a qualidade do tipo de terapia realizada.

Um médico pode prescrever esta análise para determinar o estágio da doença existente, o que permite ajustes oportunos no tratamento utilizado. E a alta precisão dos dados obtidos permite ter o quadro mais abrangente da saúde. Ao mesmo tempo, os dados são obtidos após o estudo em um período de tempo muito curto, o que permite acompanhar a dinâmica do desenvolvimento do processo patológico.

Por que fazer esses testes?

Dado que graças à análise sanguínea ELISA é possível obter uma quantidade significativa de informações sobre o estado de saúde e os processos patológicos que ocorrem no corpo, permite ter em conta da forma mais completa os dados iniciais (estado geral de saúde, fase do doença, dinâmica de desenvolvimento do processo patológico, indicador da eficácia da terapia utilizada) na elaboração dos regimes de tratamento.

Por este motivo, para obter o resultado mais pronunciado do tratamento e a cessação mais rápida do processo patológico no organismo, é prescrito um exame de sangue ELISA. Com base nos dados obtidos, doenças graves do sistema imunológico, a presença de antígenos no sangue e as causas de alergias podem ser curadas mais rapidamente, utilizando os métodos mais eficazes.

A marcação da análise ELISA é realizada para diversas patologias e deve ser feita somente conforme prescrição médica. A frequência das análises também é determinada pelo médico e, quando é doado sangue para análise ELISA, o quadro da doença é mais completo. Como é possível obter a dinâmica do curso da doença fazendo esse teste mais de uma vez, na maioria das vezes as doações de sangue podem ser prescritas de três a cinco vezes. Isto torna possível comparar a quantidade de anticorpos no sangue em diferentes períodos de tempo.

Tipos de tal procedimento

Existem vários tipos de imunoensaios enzimáticos. Eles diferem no tipo de fluido retirado do corpo humano, com base no qual se estuda sua composição e a presença de certos antígenos.

Neste caso, não apenas o sangue de uma pessoa, mas também seus outros fluidos podem ser levados para análise:

• flúido amniótico,
• líquido cefalorraquidiano,
• conteúdo vítreo,
• golpes,
• muco da uretra e do canal cervical.

A operação propriamente dita para retirada de determinado tipo de líquido é padrão e é realizada em hospital-dia.

Indicações para testes

Normalmente, um teste ELISA é prescrito por um médico se for necessário obter um quadro detalhado da doença atual, que ocorre de qualquer forma: crônica, lenta ou aguda. E as seguintes condições e finalidades de tratamento podem ser consideradas indicações para esse tipo de análise:

• busca de antígenos de determinadas doenças;
• determinação do estado hormonal;
• detecção do vírus da hepatite no corpo;
• pesquisa sobre;
• busca de anticorpos para qualquer tipo de doença infecciosa;
• exame para presença de lesões autoimunes no corpo.

Para informações sobre imunoensaio enzimático, assista ao vídeo abaixo:

Contra-indicações para

Até o momento, nenhuma contra-indicação para o imunoensaio enzimático foi identificada.

Durante a gravidez, quando há uma alteração constante nos níveis de hormônios no sangue, é necessário realizar esta análise repetidamente para confirmar o resultado obtido. Recém-nascidos e bebês também podem apresentar dados de testes incorretos: durante o desenvolvimento fetal, certos tipos de anticorpos podem entrar no sangue fetal através da placenta da mãe. Portanto, sua presença na análise não deve ser considerada um sinal de infecção existente.

Teste de segurança

Realizar o procedimento de retirada de qualquer tipo de líquido do corpo humano não traz efeitos negativos ao organismo. A esterilidade completa durante as manipulações evita o risco de infecção por qualquer tipo de doença.

Preparação para o evento

Para obter os resultados mais confiáveis ​​​​do estudo, você deve evitar o consumo de bebidas alcoólicas e drogas antes de coletar sangue (ou outro líquido) para análise.

Como funciona o procedimento e como você se sente durante ele

Para realizar um teste ELISA, o sangue do paciente é coletado estritamente com o estômago vazio: você não deve comer nenhum tipo de alimento pelo menos horas antes do procedimento. A análise é retirada da veia ulnar.

A presença de quaisquer doenças e medicamentos em uso são comunicados ao médico com antecedência, na maioria das vezes os medicamentos serão descontinuados no momento da doação de sangue. As sensações durante o procedimento são semelhantes às de uma coleta de sangue para análises bioquímicas.

Decodificando os resultados

O diagnóstico ELISA permite determinar a presença de infecção no corpo, a atividade do processo patológico e a etiologia da infecção existente. O rápido recebimento dos resultados da análise (em até 24 horas) é uma das vantagens desse tipo de pesquisa.

O processo de decodificação das informações recebidas é realizado pelo médico. Deve-se levar em consideração que a exatidão dos resultados obtidos na dinâmica de quaisquer processos é garantida quando os testes são realizados no mesmo laboratório.

Custo médio do procedimento

O preço médio de um teste ELISA depende do foco da análise e da determinação de valores específicos. Assim, a determinação de marcadores sorológicos de doenças infecciosas de vários tipos (anti-HAV IgG, anti-HAV IgM, HBsAg) custará de 200 a 320 rublos e é realizada em 2 dias úteis. O custo desse procedimento também é considerado uma vantagem: a acessibilidade dos preços para qualquer tipo de pesquisa permite realizar pesquisas com qualquer orçamento.

O custo de um teste ELISA depende da política da instituição médica, mas deve ser considerado um procedimento geralmente disponível que permite obter um quadro detalhado da doença existente e fornecer o tratamento mais completo.

Sobre as normas e características da pesquisa ELISA, veja o vídeo abaixo: