O método de imunofluorescência (RIF, reação de imunofluorescência, reação de Coons) é um método para detecção de Ags específicos usando Abs conjugado a um fluorocromo. Possui alta sensibilidade e especificidade.

É utilizado para o diagnóstico expresso de doenças infecciosas (identificação do patógeno no material de teste), bem como para a determinação de Ab e receptores de superfície e marcadores de leucócitos (imunofenotipagem) e outras células.

A detecção de antígenos bacterianos e virais em materiais infecciosos, tecidos animais e culturas de células utilizando anticorpos fluorescentes (soros) é amplamente utilizada na prática diagnóstica. A preparação de soros fluorescentes baseia-se na capacidade de certos fluorocromos (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína) de entrarem em ligação química com proteínas séricas sem violar sua especificidade imunológica.

Existem três tipos de método: direto, indireto e com complemento. O método RIF direto baseia-se no fato de que antígenos teciduais ou micróbios tratados com soros imunes com anticorpos marcados com fluorocromos são capazes de brilhar nos raios UV de um microscópio fluorescente. As bactérias em um esfregaço tratado com esse soro luminescente brilham ao longo da periferia da célula na forma de uma borda verde.

O método RIF indireto envolve a detecção do complexo antígeno-anticorpo usando soro antiglobulina (antianticorpo) marcado com fluorocromo. Para fazer isso, esfregaços de uma suspensão de micróbios são tratados com anticorpos de soro antimicrobiano para diagnóstico de coelho. Em seguida, os anticorpos que não estão ligados aos antígenos microbianos são lavados e os anticorpos remanescentes nos micróbios são detectados tratando o esfregaço com soro antiglobulina (anti-coelho) marcado com fluorocromos. Como resultado, forma-se um complexo de micróbio + anticorpos antimicrobianos de coelho + anticorpos anti-coelho marcados com fluorocromo. Este complexo é observado em microscópio fluorescente, como no método direto.

Mecanismo. Um esfregaço do material de teste é preparado em uma lâmina de vidro, fixado em uma chama e tratado com soro imune de coelho contendo anticorpos contra antígenos de patógenos. Para formar um complexo antígeno-anticorpo, a preparação é colocada em câmara úmida e incubada a 37 °C por 15 minutos, após o que é cuidadosamente lavada com solução isotônica de cloreto de sódio para remover os anticorpos que não se ligaram ao antígeno. Em seguida, aplica-se à preparação soro antiglobulina fluorescente contra globulinas de coelho, incuba-se durante 15 minutos a 37 °C e, em seguida, a preparação é cuidadosamente lavada com uma solução isotónica de cloreto de sódio. Como resultado da ligação do soro antiglobulina fluorescente com anticorpos específicos fixados no antígeno, formam-se complexos luminosos antígeno-anticorpo, que são detectados por microscopia de fluorescência.

4. Foram encontradas 75 mt/m3 de estreptococos, 12 mt/m3 de estafilococos e 1 mt/m3 de bactérias da tuberculose no ar do quarto das crianças do berçário. Faça uma avaliação sanitária e bacteriológica do ar e trace um plano para seu saneamento.

BILHETE DE EXAME Nº _54

Retrovírus. Infecção pelo HIV (AIDS) e seus patógenos.

O vírus da imunodeficiência humana causa a infecção pelo HIV, resultando no desenvolvimento da síndrome da imunodeficiência adquirida.

O agente causador da infecção pelo HIV é um vírus linfotrópico pertencente à família Retroviridae, gênero Lentivirus.

Propriedades morfológicas: vírus contendo RNA. A partícula viral tem formato esférico e o envelope consiste em uma dupla camada de lipídios penetrada por glicoproteínas. O envelope lipídico origina-se da membrana plasmática da célula hospedeira na qual o vírus se reproduz. A molécula de glicoproteína consiste em 2 subunidades localizadas na superfície do vírion e penetrando em seu envelope lipídico.

O núcleo do vírus tem formato de cone e consiste em proteínas do capsídeo, uma série de proteínas de matriz e proteínas proteases. O genoma forma duas fitas de RNA; para realizar o processo de reprodução, o HIV possui transcriptase reversa, ou reversetase.

O genoma do vírus consiste em 3 genes estruturais principais e 7 genes reguladores e funcionais. Os genes funcionais desempenham funções reguladoras e garantem a implementação dos processos de reprodução e a participação do vírus no processo infeccioso.

O vírus afeta principalmente linfócitos T e B, algumas células de monócitos (macrófagos, leucócitos) e células do sistema nervoso.

Propriedades culturais: na cultura de linfócitos T e monócitos humanos (na presença de IL-2).

Estrutura antigênica: 2 tipos de vírus - HIV-1 e HIV-2 O HIV-1 possui mais de 10 genótipos (subtipos): A, B, C, D, E, F..., diferindo na composição de aminoácidos das proteínas .

O HIV-1 é dividido em 3 grupos: M, N, O. A maioria dos isolados pertence ao grupo M, no qual se distinguem 10 subtipos: A, B, C, D, F-l, F-2, G, H, I, K Resistência: Sensível a fatores físicos e químicos, morre quando aquecido. O vírus pode sobreviver por muito tempo em estado seco, em sangue seco.

Fatores de patogenicidade, patogênese: O vírus se liga a um linfócito, penetra na célula e se reproduz no linfócito. Como resultado da multiplicação do HIV nos linfócitos, estes são destruídos ou perdem suas propriedades funcionais. Como resultado da multiplicação do vírus em várias células, ele se acumula em órgãos e tecidos e é encontrado no sangue, na linfa, na saliva, na urina, no suor e nas fezes.

Com a infecção pelo HIV, o número de linfócitos T-4 diminui, a função dos linfócitos B é prejudicada, a função das células natural killer é suprimida e a resposta aos antígenos é reduzida e a produção de complemento, linfocinas e outros fatores que regulam as funções imunológicas (IL) é interrompido, resultando em disfunção do sistema imunológico.

Clínica: o sistema respiratório está afetado (pneumonia, bronquite); Sistema nervoso central (abscessos, meningite); Ocorrem trato gastrointestinal (diarréia), neoplasias malignas (tumores de órgãos internos).

A infecção pelo HIV ocorre em vários estágios: 1) período de incubação, que dura em média 2 a 4 semanas; 2) estágio de manifestações primárias, inicialmente caracterizadas por febre aguda e diarreia; a fase termina com fase assintomática e persistência do vírus, restauração do bem-estar, mas são detectados anticorpos HIV no sangue, 3) fase das doenças secundárias, manifestadas por danos ao sistema respiratório e nervoso. A infecção pelo HIV termina com o último e 4º estágio terminal - AIDS.

Diagnóstico microbiológico.

Os estudos virológicos e sorológicos incluem métodos para determinar antígenos e anticorpos do HIV. Para tanto, são utilizados ELISA, IB e PCR. Os soros de pacientes com HIV-1 e HIV-2 contêm anticorpos para todas as proteínas virais. No entanto, para confirmar o diagnóstico, são determinados anticorpos para as proteínas gp41, gpl20, gpl60, p24 no HIV-1 e anticorpos para as proteínas gp36, gpl05, gpl40 no HIV-2. Os anticorpos do HIV aparecem 2 a 4 semanas após a infecção e são detectados em todos os estágios do HIV.

Método para detecção do vírus no sangue e linfócitos. No entanto, com qualquer teste positivo, é realizada uma reação IB para confirmar os resultados. Também é utilizada a PCR, que pode detectar a infecção pelo HIV na incubação e nos primeiros períodos clínicos, mas sua sensibilidade é um pouco inferior à do ELISA.

Os diagnósticos clínicos e sorológicos são confirmados por estudos imunológicos se indicarem a presença de imunodeficiência no paciente examinado.

Sistema de teste imunoenzimático de diagnóstico para determinação de anticorpos contra o HIV - inclui um antígeno viral adsorvido em um transportador, um anticorpo Ig anti-humano. Usado para sorodiagnóstico de AIDS.

Tratamento: uso de inibidores da transcriptase reversa atuando em células ativadas. Os medicamentos são derivados da timidina - azidotimidina e fosfazida.

Prevenção. Específico - não.

A influência de fatores físicos e químicos sobre os micróbios. Mutação e seu significado para a medicina prática. Exemplos. A importância da ecologia.

Ação de fatores químicos e biológicos.

Ação de produtos químicos

Os produtos químicos podem inibir ou suprimir completamente o crescimento de microrganismos. Se um produto químico inibe o crescimento de bactérias, mas após a remoção, seu crescimento é retomado.

As substâncias antimicrobianas, tendo em conta a sua estrutura química e o mecanismo de ação bactericida sobre as bactérias, podem ser divididas nos seguintes grupos: agentes oxidantes, halogéneos, compostos metálicos, ácidos e álcalis, surfactantes, álcoois, corantes, fenol e derivados de formaldeído.

Agentes oxidantes. Este grupo inclui peróxido de hidrogênio e permanganato de potássio.

Halogênios. Cloro, iodo e suas preparações: alvejante, cloramina B, pantocídio, solução alcoólica de iodo a 5%, iodinol, iodofórmio.

Compostos de metais pesados (sais de chumbo, cobre, zinco, prata, mercúrio; compostos organometálicos de prata: protargol, colargol). Esses compostos são capazes de exercer efeitos antimicrobianos e diversos efeitos locais nos tecidos do macroorganismo.

Ácidos e álcalis. A ação bactericida de ácidos e álcalis baseia-se na desidratação de microrganismos, alterações no pH do meio nutriente, hidrólise de sistemas coloidais e formação de albuminatos ácidos ou alcalinos.

Os corantes têm propriedades que inibem o crescimento de bactérias. Eles agem lentamente, mas de forma mais seletiva.

O formaldeído é um gás incolor. Na prática, é utilizada uma solução aquosa de formaldeído (formalina) a 40%. O formaldeído gasoso e dissolvido na água tem um efeito prejudicial nas formas vegetativas e de esporos das bactérias.

Ação de fatores biológicos

A ação dos fatores biológicos se manifesta principalmente no antagonismo dos micróbios, quando os resíduos de alguns micróbios causam a morte de outros.

Antibióticos (do grego anti - contra, bios - vida) são substâncias biologicamente ativas formadas durante a atividade vital de fungos, bactérias, animais, plantas e criadas sinteticamente, capazes de suprimir e matar seletivamente microrganismos, fungos, riquétsias, grandes vírus, protozoários e helmintos individuais.

3. A reação da atividade biológica das enzimas bacterianas no reumatismo, significado diagnóstico e prático, o papel protetor dos anticorpos contra enzimas na imunidade adquirida (determinação de anti-hialuronidase e anti-O-estreptolisina).

O reumatismo é uma doença geral, de natureza infeccioso-alérgica, que afeta o tecido conjuntivo, principalmente o sistema cardiovascular, bem como as articulações, os órgãos internos e o sistema nervoso central. Acredita-se que a causa do desenvolvimento do reumatismo seja a ativação de microrganismos patogênicos, principalmente estreptococos beta-hemolíticos do grupo A. Desempenha um papel importante na etiologia e patogênese das doenças reumáticas. Em primeiro lugar, a doença desenvolve-se no contexto de uma infecção estreptocócica. Em segundo lugar, no sangue dos pacientes é encontrado um grande número de anticorpos contra microrganismos deste grupo. Em terceiro lugar, a prevenção de doenças é realizada com sucesso com medicamentos antibacterianos.

Na artrite reumatóide, as membranas sinoviais, por razões desconhecidas, secretam grandes quantidades da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase, que também quebra as ligações dissulfeto na membrana celular. Nesse caso, ocorre um “vazamento” de enzimas proteolíticas dos lisossomos celulares, que causam danos aos ossos e cartilagens próximos. O corpo responde a isso produzindo citocinas, que também incluem o fator de necrose tumoral α TNF-α. Cascatas de reações nas células desencadeadas por citocinas agravam ainda mais os sintomas da doença. A inflamação reumatóide crônica associada ao TNF-α causa muitas vezes danos à cartilagem e às articulações, levando à incapacidade física.

RECIFE

A reação de imunofluorescência baseia-se na interação de anticorpos anti-clamídia com o antígeno da clamídia específico do gênero. Existem dois tipos de reação de imunofluorescência - direta e indireta. No primeiro caso, o anticorpo específico é marcado diretamente com fluorocromo e a reação ocorre em uma única etapa, o que reduz significativamente o tempo de pesquisa. No segundo caso, o anticorpo específico não é marcado e, para detectar o complexo AG-AT formado na primeira fase, são utilizados segundos anticorpos marcados específicos para anticorpos anti-clamídia. O resultado da reação é avaliado visualmente usando um microscópio fluorescente.

Além dos importados, surgiram kits nacionais para diagnóstico de infecção por clamídia por reação de imunofluorescência direta, que são praticamente iguais em especificidade e sensibilidade, mas têm preço significativamente menor.

O material para o estudo são esfregaços de impressões digitais preparados de acordo com as normas. Os esfregaços para RIF são preparados em vidros decalques especiais dentro de uma área limitada com diâmetro de 8 a 10 mm. Em seguida, são secos ao ar e fixados por imersão em álcool etílico 96% frio (de preferência absoluto) por 5 a 10 minutos ou pela aplicação de 0,1 a 0,15 ml de acetona anidra resfriada ao preparado até que evapore completamente. As preparações fixas podem ser examinadas imediatamente ou, se necessário, armazenadas em temperatura ambiente por 24 horas ou a -20°C por 2 semanas (é necessário excluir o acesso à umidade durante o armazenamento e levar a preparação à temperatura ambiente antes do exame usando um plástico saco e sílica gel).

Ao realizar RIF direto, uma solução de anticorpos marcados é aplicada à preparação na quantidade necessária para cobrir completamente o esfregaço (25 - 30 μl). O medicamento é incubado em posição horizontal em câmara úmida por 15 minutos a +37°C. A secagem do reagente é inaceitável para evitar resultados falsos positivos. A seguir, o esfregaço é lavado em água corrente por 30 segundos, enxaguado em água destilada, seco e preparado para microscopia.

Ao realizar o RIF indireto, a quantidade necessária de solução de anticorpo anti-clamídia é aplicada à preparação e a primeira incubação é realizada nas mesmas condições que para o RIF direto. Em seguida, a preparação é lavada, seca ao ar e um segundo reagente é aplicado - anticorpos marcados para anticorpos contra clamídia e uma segunda incubação também é realizada em câmara úmida a +37°C por 15 minutos. Após a lavagem, a amostra é seca e preparada para microscopia. Recomenda-se visualizar imediatamente os preparativos finalizados. Se necessário, é possível armazenar preparações coloridas durante 1 - 2 dias a +2-8°C num local escuro e sem acesso à humidade.

A microscopia é realizada em sistema de imersão. Existem duas opções para microscopia de imersão:

1. Imersão em óleo: Aplicar 20 - 25 µl de líquido de montagem (glicerol, tamponado com tampão fosfato com pH 7,2 - 7,6) à preparação seca acabada, cobrir com uma lamínula isenta de gordura, sobre a qual será colocada uma gota de produto não fluorescente. o óleo de imersão é então aplicado e examinado microscopicamente com uma lente objetiva (marcada com “L” ” - luminescente) com ampliação de 90 e uma ocular com ampliação de 5.

2. Imersão em água: uma gota de 20 μl de tampão fosfato com pH 7,4 é aplicada à preparação acabada e examinada microscopicamente com lente de imersão em água (marcada com uma faixa branca e “L” - luminescente) com uma ampliação de 60 e um ocular com ampliação de 5. A imersão em água proporciona um brilho mais uniforme, brilhante e claro.

O RIF permite identificar estruturas antigênicas de corpos elementares e reticulares. Os ETs estão localizados predominantemente extracelularmente, de formato redondo com bordas lisas, pequenos (tamanho 1:100 - 1:150 em relação às células circundantes), estrutura homogênea, possuem um brilho verde esmeralda específico brilhante, que, quando usado com um microparafuso, pode produzir anéis de difração (anéis) Dilektorsky). Os RTs são muito menos comuns, estão localizados predominantemente intracelularmente, têm uma estrutura menos uniforme, são mais polimórficos, mas também com bordas claras e possuem um brilho verde esmeralda específico e brilhante. Qualquer outro material fluorescente de formato irregular, bordas irregulares e difusas, com uma cor verde fraca ou brilho de cor diferente é considerado um artefato. A intensidade, o brilho e a tonalidade do brilho específico dependem do pH do líquido de montagem ou tampão utilizado para microscopia. A alta intensidade da luminescência FITC em ambiente alcalino aumenta a sensibilidade do método, mas leva ao aumento do número de objetos com luminescência inespecífica e, consequentemente, a resultados falsos positivos. Num ambiente ácido, a intensidade do brilho FITC diminui, o que pode dar um resultado falso negativo. A microflora acompanhante, bem como os núcleos das células circundantes, são corados de forma inespecífica em vários tons de laranja com brometo de índio, e seu citoplasma é corado em vários tons de marrom-tijolo com azul de Evans.

Para obter um resultado confiável, é recomendável visualizar vários campos de visão do medicamento. O resultado é considerado positivo se a preparação contiver células epiteliais e for possível detectar pelo menos 6 corpos elementares com todas as características acima.

A detecção de uma quantidade menor do patógeno torna o resultado questionável e requer pesquisas repetidas, de preferência no contexto de provocação (comida - álcool, medicação - injeção pirogênica, mecânica - massagem uretral em bougie). O controle da cura não deve ser realizado antes de duas semanas, pois é possível que permaneça material antigênico não eliminado de um patógeno inviável, o que dará resultados falso-positivos. Obtendo 3 resultados de testes negativos em homens dentro de um mês e em mulheres durante 3 ciclos menstruais, a ausência de manifestações clínicas de infecção por clamídia indica recuperação.

O RIF, com preparo adequado do paciente, cumprimento das normas de coleta de material e estadiamento da reação, é um método altamente sensível e específico para o diagnóstico de clamídia urogenital e permite identificar o patógeno em 90 - 95% dos pacientes. Este método é relativamente barato, fácil de executar, altamente informativo, não requer equipamentos especiais caros, permite obter resultados rapidamente (0,5 - 1 hora) e controlar visualmente a qualidade do material levado para pesquisa.

Métodos usando princípios de biologia molecular

O grupo inclui métodos de sondas de DNA e reação em cadeia da polimerase (PCR), que permitem identificar o material genético do patógeno no biomaterial em estudo. Os kits para diagnóstico de clamídia com sondas de DNA ainda estão em fase de desenvolvimento e ensaios clínicos.

A PCR está sendo ativamente introduzida na prática do diagnóstico laboratorial. O método baseia-se no isolamento de uma sequência específica de DNA ou RNA do patógeno por meio de primers complementares, sua posterior cópia repetida e acumulação para posterior detecção por métodos convencionais de detecção (eletroforese ou ELISA). Este método possui alta especificidade e sensibilidade, quase próxima da cultural, e permite detectar patógenos únicos no material em estudo. O método PCR requer equipamento especial e caro, um laboratório separado especialmente equipado, treinamento adequado e pessoal médico altamente qualificado. Ao mesmo tempo, a falta de certificação dos primers utilizados na Rússia e experiência suficiente no uso do método PCR, a especificidade do material testado e sua contaminação frequente com a microflora acompanhante (que pode dar resultados falsos positivos) não permitem para avaliarmos claramente o seu valor no diagnóstico da clamídia urogenital.

Assim, atualmente, o método mais acessível, simples e ao mesmo tempo altamente informativo para diagnosticar a clamídia urogenital e estabelecer a cura é a reação de imunofluorescência direta (RIF). O monitoramento da dinâmica da doença e da eficácia do tratamento deve ser realizado através da determinação do título de anticorpos anti-clamídia no soro sanguíneo por meio de um ensaio imunoenzimático (ELISA).

Proposto pela primeira vez por Coombs em 1942, o RIF baseia-se na detecção de antígenos em material clínico, preparações de células sanguíneas, etc., utilizando anticorpos monoclonais ou soros marcados com fluorocromo (RIF direto). Os primeiros anticorpos (diagnósticos) podem ser detectados com soro anti-imunoglobulina marcado com fluorocromos (RIF indireto). Existem modificações no RIF para detectar anticorpos contra agentes infecciosos no soro sanguíneo ou anticorpos no soro sanguíneo.

A popularidade do RIF é explicada pela sua relação custo-benefício, pela disponibilidade de uma ampla gama de kits de diagnóstico e pela rapidez na obtenção de uma resposta. Hoje, essa reação utiliza soros policlonais e anticorpos monoclonais marcados com isotiocianato de fluoresceína (FITC). Para reduzir a fluorescência de fundo inespecífica, as preparações são tratadas com albumina de soro bovino marcada com rodamina ou azul de Evans.

Na maioria das vezes, o RIF é usado para detectar rapidamente o patógeno em material patológico. Nesse caso, é preparado um esfregaço a partir do material examinado em uma lâmina de vidro, como na microscopia convencional. A droga é fixada com álcool metílico, acetona ou outro fixador químico. Soros marcados com FITC ou anticorpos monoclonais são aplicados na superfície do esfregaço fixado (no caso de RIF indireto, o medicamento é primeiro tratado com soro contra o antígeno desejado e depois com anticorpos marcados para as imunoglobulinas utilizadas na primeira etapa) . Como o RIF é um tipo de análise heterogênea, uma etapa é separada da outra por lavagem.

Os resultados da reação são registrados em microscópio fluorescente, em cujo sistema óptico está instalado um conjunto de filtros de luz que iluminam o fármaco com luz ultravioleta ou azul-violeta em determinado comprimento de onda. O pesquisador avalia a natureza do brilho, forma, tamanho dos objetos e sua posição relativa.

Ao realizar RIF, são preparados esfregaços a partir da cepa de referência do patógeno para detectar anticorpos. O soro teste é aplicado no esfregaço. Se os anticorpos desejados estiverem presentes nele, eles se ligam aos antígenos das células microbianas. Lavar a preparação com uma solução tampão remove os anticorpos não ligados. A preparação é então tratada com soro marcado contra imunoglobulinas humanas. No caso de um resultado de reação positivo durante a baciloscopia, um brilho específico da cultura de referência é observado em um microscópio fluorescente.

A principal desvantagem do RIF é a sua subjetividade.

Os critérios clássicos para a especificidade desta reação são:

· morfologia característica, tamanho e localização do patógeno no esfregaço;

· natureza periférica do brilho do objeto;

· cor fluorescente;

· intensidade de fluorescência.

Ao estudar objetos grandes (Trichomonas, células humanas, células afetadas por bactérias ou vírus), esses critérios permitem obter um resultado confiável. Ao mesmo tempo, os corpos elementares da clamídia e do micoplasma têm tamanhos que estão no limite da resolução de um microscópio fluorescente. Ao mesmo tempo, é difícil avaliar a morfologia dos microrganismos e o brilho perde seu caráter periférico. Os restantes critérios são claramente insuficientes para uma identificação confiável do microrganismo observado. Em conexão com o acima exposto, a natureza subjetiva de levar em conta a reação impõe exigências especiais às qualificações do pessoal que conduz a pesquisa.

2.2. Imunoensaio de fluorescência resolvido no tempo (FIA VR, Etkins R. et Wallac O., 1984)

Este tipo de FIA baseia-se nos princípios de sorção de um dos reagentes na fase sólida e na utilização da tecnologia “sanduíche”, ou seja, duplo reconhecimento, semelhante ao ELISA. No entanto, uma diferença importante do método é a utilização de quelatos lantanídeos (elementos de terras raras európio, samário, térbio e disprósio) como rótulo. As vantagens do FIA VR são a alta sensibilidade, uma tecnologia semelhante ao ELISA e o potencial para amplificação significativa do sinal útil devido a uma relação sinal-ruído muito alta. Um rótulo fluorescente específico apresenta fluorescência imensamente mais forte e mais longa do que a fluorescência de fundo. Além disso, a etiqueta tem a capacidade de restaurar a capacidade de brilhar (para contabilização, utiliza-se radiação excitatória pulsada com período de 1 s - mais de 1000 pulsos), o que leva ao acúmulo (amplificação) do sinal útil. O sistema descrito é implementado pela PerkinElmer, EUA, sob o nome Delfia e possui sensibilidade superior a 10 -17 M na determinação de antígenos.

2.3. Citometria de fluxo

Existem duas opções para estadiamento da RIF (reação de Coons) - reações de imunofluorescência direta e indireta.

O RIF direto é uma reação simples de uma etapa, mas como requer uma grande quantidade de

soros antimicrobianos marcados, então é colocado com menos frequência indiretamente, cuja colocação é garantida por um anti-soro marcado.

O RIF indireto é uma reação de duas etapas na qual o antígeno é primeiro ligado ao soro da espécie não marcada e, em seguida, o complexo imune antígeno-anticorpo formado é tratado com anti-soro marcado com FITC contendo anticorpos contra a imunoglobulina desse complexo. Normalmente, no estágio I de sua produção, o soro imune de coelho obtido pela imunização de animais com o microrganismo correspondente é utilizado como soro de espécie, e no estágio II, soro anti-coelho marcado com FITC de burros ou outros animais imunizados com gamaglobulinas de coelho ( Figura 9).

Configurando um RIF direto. Em uma lâmina de vidro isenta de gordura, são feitos esfregaços finos do material que está sendo examinado e esfregaços de impressões digitais são feitos de órgãos e tecidos. As preparações são secas, fixadas, soro luminescente tomado em uma diluição de trabalho é aplicado sobre elas e colocado em câmara úmida a uma temperatura de 37 ° C por 20-30 minutos (por 25-40 minutos em temperatura ambiente). Em seguida, para remover o excesso de anticorpos fluorescentes, a preparação é lavada em solução isotônica tamponada de cloreto de sódio por 10-15 minutos, seguida de enxágue em água destilada ou corrente por 10 minutos. Seque à temperatura ambiente e examine sob um microscópio de fluorescência usando um sistema de imersão em óleo.

Para avaliar a intensidade da fluorescência específica das células bacterianas, é utilizada uma escala de quatro mais: “++++”, “+++” - muito brilhante e brilhante; “++”, “+” - fluorescência verde colônica pronunciada e fraca das células. São necessários três controles: 1) tratamento com anticorpos fluorescentes de bactérias homólogas (controle positivo); 2) cultura heteróloga (controle negativo); 3) material não contaminado (controle negativo).

RIF anticomplementar. A reação é uma modificação do RSC, cujo sistema indicador são anticorpos anticomplementares marcados com FITC (Fig. 10).

O RIF anticomplementar indireto é realizado da seguinte forma: o preparo do antígeno é preparado em lâmina de vidro, como no RIF, mas no estágio I é tratado não apenas com soro imune, mas com sua mistura com complemento de cobaia, e no estágio II com um anti-soro contendo anticorpos marcados com FITC para complementar. O uso generalizado de RIF anticomplementar é limitado pela dificuldade de obtenção de anticorpos anticomplementares e pelo método de “rotulagem” deles.

Descoberta em 1942 por Koons, a reação de imunofluorescência não é um método de pesquisa novo. No entanto, o advento das tecnologias de hibridoma, que permitiram a obtenção de anticorpos monoclonais, deu uma “segunda vida” a esta reacção, uma vez que a sua utilização permitiu aumentar várias vezes a sensibilidade desta reacção e a sua especificidade.

E hoje contaremos em detalhes sobre a reação de imunofluorescência direta e indireta (RIF) como método diagnóstico de Koons para homens e mulheres adultos durante a gravidez.

O que é uma reação de imunofluorescência?

Representando uma excelente oportunidade para obter rapidamente um diagnóstico preciso, a reação de imunofluorescência permite determinar a presença do agente causador da doença no material patológico. Para tanto, utiliza-se um esfregaço de material especialmente processado com FITC (isotiocianato de fluoresceína) marcado e estudado como análise heterogênea.

Para obter o resultado, utiliza-se um microscópio fluorescente, cujo sistema óptico contém um conjunto de filtros de luz para fornecer ao medicamento luz azul-violeta ou ultravioleta de determinado comprimento de onda. Esta condição permite que o fluorocromo reflita dentro de uma determinada faixa. O pesquisador avalia as propriedades do brilho, seu caráter, o tamanho dos objetos e suas posições relativas.

Para quem é prescrito?

Uma reação de imunofluorescência pode ser prescrita para o diagnóstico de muitas doenças virais. Em particular, é prescrito durante um exame abrangente para identificar os seguintes fatores:

a presença de um vírus no corpo;
infecção por salmonela;
a existência de certos antígenos no corpo;
é identificada a probabilidade de infecção do corpo por clamídia, micoplasma e outros microrganismos que têm a capacidade de causar doenças virais em humanos;
diagnóstico de doenças virais em animais.

As indicações listadas permitem utilizar a reação de imunofluorescência para detectar doenças virais de diversas naturezas no corpo humano e animal.

Objetivos

Por apresentar inúmeras vantagens neste método diagnóstico, que incluem alta eficiência, rapidez na implementação e obtenção de resultados, além da ausência de um grande número de contra-indicações, é utilizado para determinar a presença de infecções virais no organismo. Portanto, esta análise pode ser prescrita tanto para estabelecer como para esclarecer o diagnóstico, com base no qual é prescrito um regime de tratamento.

O procedimento não causa desconforto, requer a obtenção de material para análise, que é retirado de qualquer fluido corporal: saliva, escarro, raspagens da superfície das mucosas. Sangue também pode ser coletado para testes. A frequência da reação de imunofluorescência é prescrita pelo médico assistente, que precisa obter dados sobre a dinâmica dos processos que ocorrem no organismo.

Como este teste não causa danos ao corpo nem ao bem-estar geral de uma pessoa, ele pode ser prescrito conforme necessário.

Tipos de tal procedimento

Hoje, são utilizadas diversas variedades dessa análise, cada uma das quais possui uma série de características específicas e permite obter uma imagem mais detalhada dos processos que ocorrem no corpo.

Os tipos de reação de imunofluorescência incluem:

- um dos tipos de diagnóstico de mais rápido desenvolvimento, esta análise permite obter dados quantitativos sem o uso de diluições seriadas. Utilizando as medições obtidas da densidade óptica do líquido, é possível determinar com precisão o nível de concentração do componente desejado. As amplas possibilidades desse tipo de análise são utilizadas quando se utiliza anticorpos monoclonais para sua implementação, o que permite determinar a fase do processo infeccioso e sua gravidade;
Diagnóstico de DNA- este método baseia-se na ligação complementar de nucleotídeos, para os quais podem ser utilizados fluidos como saliva, sangue, líquido cefalorraquidiano, urina, escarro, amostras de biópsia e sangue. Este método detecta com mais eficácia a presença de vírus do papiloma no corpo; no entanto, muitos sistemas de teste modernos podem ocasionalmente fornecer resultados falsos positivos e falsos negativos. Podem ser causadas pela contaminação de amostras líquidas para análise de DNA específico, cuja presença pode ser de natureza aninhada ou total;
imunocromatografia— a especificidade deste método para determinar a presença de um ambiente patológico e de vírus no organismo é a utilização de anticorpos marcados durante a reação. Este método diagnóstico é usado para identificar e o grau de atividade do processo de infecção por estreptococos do grupo A, bem como clamídia dos seguintes tipos: Clamikit R Innotech International, Clearview TM Chlamydia da Oxoid. Possuindo a maior sensibilidade possível, testam sistemas baseados neste método de pesquisa. geralmente são usados como um teste indicativo.

As variedades listadas apresentam características de implementação e características específicas dos resultados, mas todas visam a obtenção de dados sobre a presença de microrganismos patológicos e vírus no organismo, bem como sobre o grau de sua reprodução e atividade.

Indicações de uso

A reação de imunofluorescência pode ser prescrita para identificar qualquer tipo de ambiente patológico no corpo.

Clamídia, Trichomonas, gonococos e, assim como Giardia de todos os tipos, são determinados durante esse tipo de diagnóstico. e outras doenças também requerem RIF. É necessária consulta médica para sua implementação.

Contra-indicações para

Como essa reação requer qualquer tipo de fluido corporal como material de teste, sua obtenção geralmente não é difícil e não há contra-indicações para a realização da reação de imunofluorescência. Porém, durante a gravidez e em crianças menores de 6 meses, a coleta de material para pesquisa é realizada com o máximo cuidado.

A ausência de contra-indicações permite que este tipo de diagnóstico seja realizado quando prescrito pelo médico a todos os pacientes. A sua segurança é garantida pela utilização de instrumentos desinfetados e seringas descartáveis.

Preparação para o procedimento

Não há particularidades quanto à coleta de material para esta análise. O sangue para isso é coletado com o estômago vazio, para que não haja aumento no conteúdo de substâncias que possam alterar as leituras verdadeiras e dar uma imagem falsa.

Como é feito o teste?

Como não é necessário nenhum preparo especial para a análise, excluindo-se apenas a alimentação 12 horas antes do exame e a ausência do uso de medicamentos, o material do teste é tomado como um processo normal de retirada de fluidos corporais para análise.

As sensações subjetivas durante o procedimento podem variar dependendo da sensibilidade.

Decodificando os resultados

O uso de sistemas de teste modernos permite obter resultados de análise mais precisos. Para decifrar o resultado, são utilizados os seguintes dados:

grau de intensidade de fluorescência;
sombra de fluorescência;
a natureza periférica do processo de luminescência do objeto;
características de morfologia, localização do patógeno em um esfregaço do material de teste e seu tamanho.

Ao estudar objetos grandes (por exemplo, Gardenerella, Trichomonas, células já infectadas com vírus), os critérios acima permitem obter resultados mais confiáveis. No entanto, os corpos elementares do micoplasma e da clamídia têm tamanhos que estão no limite das capacidades de resolução de um microscópio fluorescente, o que torna difícil

Isso dificulta a obtenção de um resultado preciso, pois o brilho periférico perde um pouco de sua intensidade. Os demais critérios não são mais suficientes para a identificação precisa dos microrganismos em estudo. Por esta razão, são impostos requisitos especiais aos especialistas que realizam este tipo de investigação: o seu nível de qualificação deve ser suficiente para operar com os dados disponíveis.

Por este motivo, apenas um médico com o nível de qualificação adequado pode interpretar a análise obtida. Leia abaixo sobre o preço da pesquisa pelo método RIF.

custo médio

O preço de uma reação de imunofluorescência depende da localização e do nível da instituição médica, bem como da qualificação do especialista que realiza a análise. Hoje o custo varia de 1.280 a 2.160 rublos.

O vídeo abaixo contará mais sobre reações imunológicas: