Ao transmitir sinais em uma célula, os mensageiros primários são compostos químicos ou fatores físicos (quanta de luz) que podem ativar o mecanismo de transmissão de sinais na célula. Em relação à célula receptora, os mensageiros primários são sinais extracelulares. Vale ressaltar que moléculas abundantemente presentes no interior da célula, mas normalmente encontradas em concentrações muito baixas no espaço intercelular (por exemplo, ATP liglutamato) também podem atuar como estímulos extracelulares. Dependendo das suas funções, os intermediários primários podem ser divididos em vários grupos:

• citocinas

  neurotransmissores

  fatores de crescimento

  quimiocinas

Receptores – proteínas especiais que garantem que a célula receba um sinal dos mensageiros primários. Para essas proteínas, os mensageiros primários são ligantes.

Para garantir a função do receptor, as moléculas de proteína devem atender a uma série de requisitos:

Possuem alta seletividade para o ligante;

A cinética de ligação do ligante deve ser descrita por uma curva de saturação correspondente ao estado de ocupação total de todas as moléculas receptoras, cujo número é limitado na membrana;

Os receptores devem ter especificidade tecidual, refletindo a presença ou ausência dessas funções nas células do órgão alvo;

A ligação do ligando e o seu efeito celular (fisiológico) devem ser reversíveis e os parâmetros de afinidade devem corresponder às concentrações fisiológicas do ligando.

Os receptores celulares são divididos nas seguintes classes:

membrana

• receptor tirosina quinase

  Receptores acoplados à proteína G

  canais iônicos

citoplasmático

Os receptores de membrana reconhecem moléculas sinalizadoras grandes (por exemplo, insulina) ou hidrofílicas (por exemplo, adrenalina) que não conseguem penetrar independentemente na célula. Pequenas moléculas sinalizadoras hidrofóbicas (por exemplo, triiodotironina, hormônios esteróides, CO, NO) são capazes de penetrar na célula devido à difusão. Os receptores para tais hormônios são geralmente proteínas citoplasmáticas ou nucleares solúveis. Depois que o ligante se liga ao receptor, a informação sobre esse evento é transmitida ao longo da cadeia e leva à formação de uma resposta celular primária e secundária.

Mecanismos de ativação do receptor. Se uma molécula sinalizadora externa atua sobre os receptores da membrana celular e os ativa, estes transmitem a informação recebida para um sistema de componentes proteicos da membrana, denominado cascata de transdução de sinal. As proteínas de membrana da cascata de transdução de sinal são divididas em:

proteínas transdutoras associadas ao receptor

enzimas amplificadoras associadas a proteínas transdutoras (ativam segundos mensageiros intracelulares que transportam informações para dentro da célula).

É assim que os receptores acoplados à proteína G atuam. Outros receptores (canais iônicos, receptores com atividade de proteína quinase) servem eles próprios como multiplicadores.

4.3.2. Intermediários secundários

São substâncias de baixo peso molecular que se formam ou são liberadas como resultado da atividade enzimática de um dos componentes da cadeia de transdução de sinal e contribuem para sua posterior transmissão e amplificação. Os mensageiros secundários são caracterizados pelas seguintes propriedades: possuem pequeno peso molecular e se difundem em alta velocidade no citoplasma; rapidamente se dividem e são rapidamente removidos do citoplasma. Os intermediários secundários incluem:

Íons cálcio (Ca2+);

monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) e monofosfato de guanosina cíclico (cGMP)

trifosfato de inositol

moléculas lipofílicas (por exemplo, diacilglicerol);

óxido nítrico (NO) (esta molécula também atua como um mensageiro primário que penetra na célula pelo lado de fora).

Às vezes, mensageiros terciários também são formados na célula. Assim, geralmente os íons Ca2+ atuam como mensageiro secundário, mas ao transmitir um sinal utilizando trifosfato de inositol (mensageiro secundário), os íons Ca2+ liberados do EPR com sua participação atuam como mensageiro terciário.

Mecanismo de transmissão de sinal assume aproximadamente o seguinte esquema:

Interação de um agente externo (estímulo) com um receptor celular,

Ativação de uma molécula efetora localizada na membrana e responsável pela geração de segundos mensageiros,

Educação de intermediários secundários,

Ativação de proteínas alvo por mediadores, causando a geração de outros mediadores,

Desaparecimento do intermediário.

A transdução de sinal celular (sinalização celular) faz parte de um sistema de comunicação complexo que controla processos celulares básicos e coordena as ações da célula. A capacidade das células de responder corretamente às mudanças em seu ambiente (microambiente) é a base para o desenvolvimento, reparo tecidual, imunidade e sistema para manutenção da homeostase como um todo. Erros nos sistemas de processamento de informações celulares podem causar câncer, doenças autoimunes e diabetes. A compreensão dos mecanismos de transmissão de sinais dentro das células pode levar ao desenvolvimento de tratamentos para doenças e até mesmo à criação de tecidos artificiais.

Tradicionalmente, a pesquisa biológica tem se concentrado no estudo de partes individuais do sistema de transdução de sinal. O conhecimento dos componentes dos sistemas de sinalização ajuda a compreender a estrutura geral dos sistemas de sinalização celular e como as mudanças neles podem afetar a transmissão e o vazamento de informações. Os sistemas de transdução de sinal em uma célula são complexos organizados de forma complexa e possuem qualidades como ultrassensibilidade e biestabilidade (a capacidade de estar em um dos dois estados existentes). A análise de sistemas de transdução de sinal celular envolve uma combinação de estudos experimentais e teóricos que envolvem o desenvolvimento e análise de modelos e simuladores.

Resumo. Este capítulo examina os princípios básicos e problemas da biologia molecular usando o exemplo do fenômeno da morte celular programada (apoptose), interação intercelular e intracelular e o uso de marcadores genéticos moleculares (usando a reação em cadeia da polimerase como exemplo) para fundamentos e finalidades aplicadas.

Tarefas de teste

Origem e evolução da apoptose em diferentes grupos de organismos.

Características e principais vias de indução das principais fases da apoptose.

Mecanismos básicos de regulação da apoptose.

Patologias causadas por distúrbios no processo de apoptose.

Principais tipos de marcadores genéticos moleculares.

História da descoberta, metodologia da reação em cadeia da polimerase.

Características de conduta e aplicação dos principais tipos de PCR.

A importância da transdução de sinal nas interações intercelulares e intracelulares.

Mecanismos de ativação de proteínas receptoras.

Mecanismos de transmissão de sinal durante a interação intercelular.

De acordo com esse mecanismo, denominado mecanismo cálcio-fosfolipídio, agir vasopressina(através de receptores V 1), adrenalina(através de receptores α 1 -adrenérgicos), angiotensina II.

O princípio de funcionamento deste mecanismo coincide com o anterior, mas em vez da adenilato ciclase, a enzima alvo para a subunidade α é fosfolipase C(FLS). A fosfolipase C cliva o fosfolipídio da membrana difosfato de fosfatidilinositol(FIF 2) para mensageiros secundários trifosfato de inositol(SE 3) e diacilglicerol(DAG).

Diagrama geral do mecanismo cálcio-fosfolipídeo de ação hormonal

Estágios de transmissão de sinal

As etapas de transmissão do sinal são as seguintes:

1. Interação hormônio Com receptor leva a uma mudança na conformação deste último.
2. Essa mudança é transmitida para Proteína G(GTP, dependente de GTP) que consiste em três subunidades (αP, β e γ), a subunidade α está associada ao PIB.
3. Como resultado da interação com o receptor β- E γ- subunidades separar, simultaneamente em αP - A subunidade do PIB é substituída por GTF.
4. A subunidade α P ativada desta forma estimula fosfolipase C, que inicia a divisão do FIF 2 em dois mensageiros secundários - SE 3 E DAG.
5. Trifosfato de inositol abre canais de cálcio no retículo endoplasmático, o que causa um aumento na concentração Ca 2+ íons. Diacilglicerol junto com os íons Ca 2+, ativa a proteína quinase C. Além disso, o diacilglicerol tem outra função de sinalização: pode se decompor em 1-monoacilglicerol E ácido graxo polieno(geralmente ácido araquidônico), a partir do qual são formados os eicosanóides.
6. Proteína quinase C fosforila uma série de enzimas e geralmente participa dos processos de proliferação celular. Acumulação Ca 2+ íons no citoplasma causa a ativação de certas proteínas de ligação ao cálcio (por exemplo, calmodulina,anexina,Troponina C).
7. A hidrólise do PIF 2 continua por algum tempo até que a subunidade α P, que é GTP-ase, separa o fosfato do GTP.
8. Assim que o GTP é convertido em PIB, a subunidade α P inativado, perde seu efeito na fosfolipase C, liga-se novamente às subunidades β e γ.
   Tudo retorna à sua posição original.
9. Hormônio se separa do receptor ainda mais cedo:

• Se concentração hormonal em sangue ótimo, então sua próxima molécula se ligará ao receptor após um curto período de tempo e o mecanismo será reiniciado rapidamente - os processos correspondentes são ativados na célula.
• Se hormônio em sangue alguns– há alguma pausa para a célula, não há alteração no metabolismo.

Ideias gerais sobre vias de transdução de sinal

Para a maioria das moléculas reguladoras, entre a sua ligação a um receptor de membrana e a resposta final da célula, ou seja, ao alterar sua operação, séries complexas de eventos são interpostas - certas vias de transmissão de sinal, também chamadas através de vias de transdução de sinal.

As substâncias reguladoras são geralmente divididas em endócrinas, neurócrinas e parácrinas. Endócrino reguladores (hormônios) secretado pelas células endócrinas no sangue e transportado por ele para as células-alvo, que podem estar localizadas em qualquer parte do corpo. Neurócrino reguladores são liberados por neurônios nas imediações das células-alvo. Parácrino as substâncias são liberadas um pouco mais longe dos alvos, mas ainda perto o suficiente deles para atingir os receptores. As substâncias parácrinas são secretadas por um tipo de célula e atuam em outra, mas em alguns casos os reguladores são destinados às células que as secretaram ou a células vizinhas do mesmo tipo. É chamado autócrino regulamento.

Em alguns casos, a última etapa da transdução de sinal consiste na fosforilação de certas proteínas efetoras, o que leva ao aumento ou diminuição de sua atividade, o que, por sua vez, determina a resposta celular necessária ao organismo. A fosforilação das proteínas é realizada proteínas quinases e desfosforilação - proteínas fosfatases.

Mudanças na atividade da proteína quinase ocorrem como resultado da ligação de uma molécula reguladora (geralmente chamada ligando) com seu receptor de membrana, que desencadeia cascatas de eventos, alguns dos quais são mostrados na figura (Fig. 2-1). A atividade de várias proteínas quinases é regulada pelo receptor não diretamente, mas através mensageiros secundários(intermediários secundários), cujo papel é desempenhado, por exemplo, por AMP cíclico (cAMP), GMP cíclico (cGMP), Ca 2+, inositol-1,4,5-tri-fosfato (IP 3) E diacilglicerol (DAG). Nesse caso, a ligação do ligante ao receptor de membrana altera o nível intracelular do segundo mensageiro, o que, por sua vez, afeta a atividade da proteína quinase. Muitos reguladores

Estas moléculas influenciam os processos celulares através de vias de transdução de sinal envolvendo proteínas heterotriméricas de ligação a GTP (proteínas G heterotriméricas) ou proteínas monoméricas de ligação a GTP (proteínas G monoméricas).

Quando as moléculas do ligante se ligam aos receptores de membrana que interagem com as proteínas G heterotriméricas, a proteína G transita para um estado ativo ligando-se ao GTP. A proteína G ativada pode então interagir com muitos proteínas efetoras principalmente por enzimas como adenilato ciclase, fosfodiesterase, fosfolipase C, A 2 E D. Essa interação desencadeia cadeias de reações (Fig. 2-1), que terminam com a ativação de diversas proteínas quinases, como proteína quinase A (PKA), proteína quinase G (PKG), proteína quinase C (PKI).

Em termos gerais, a via de transdução de sinal envolvendo proteínas G - proteínas quinases inclui as seguintes etapas.

1. O ligante se liga a um receptor na membrana celular.

2. O receptor ligado ao ligante, interagindo com a proteína G, ativa-o, e a proteína G ativada liga-se ao GTP.

3. A proteína G ativada interage com um ou mais dos seguintes compostos: adenilato ciclase, fosfodiesterase, fosfolipases C, A 2, D, ativando-os ou inibindo-os.

4. O nível intracelular de um ou mais segundos mensageiros, como cAMP, cGMP, Ca 2+, IP 3 ou DAG, aumenta ou diminui.

5. Um aumento ou diminuição na concentração do segundo mensageiro afeta a atividade de uma ou mais proteínas quinases dependentes dele, como a proteína quinase dependente de cAMP (proteína quinase A), a proteína quinase dependente de cGMP (PKG), proteína quinase dependente de calmodulina(CMPC), proteína quinase C. Uma mudança na concentração do segundo mensageiro pode ativar um ou outro canal iônico.

6.O nível de fosforilação de uma enzima ou canal iônico muda, o que afeta a atividade do canal iônico, determinando a resposta final da célula.

Arroz. 2-1. Algumas cascatas de eventos realizadas na célula graças a mensageiros secundários.

Designações: * - enzima ativada

Receptores de membrana acoplados à proteína G

Os receptores de membrana que medeiam a ativação dependente de agonista das proteínas G constituem uma família especial de proteínas, com mais de 500 membros. Inclui α e β-adrenérgico, acetilcolina muscarínica, serotonina, adenosina, receptores olfativos, rodopsina, bem como receptores para a maioria dos hormônios peptídicos. Os membros da família de receptores acoplados à proteína G possuem sete hélices α transmembrana (Figura 2.2 A), cada uma contendo 22 a 28 resíduos de aminoácidos predominantemente hidrofóbicos.

Para alguns ligantes, como acetilcolina, epinefrina, norepinefrina e serotonina, são conhecidos diferentes subtipos de receptores acoplados à proteína G. Freqüentemente, eles diferem em sua afinidade por agonistas e antagonistas competitivos.

A seguir é apresentada (Fig. 2-2 B) a organização molecular da adenilato ciclase, uma enzima que produz AMPc (o primeiro segundo mensageiro aberto). A via reguladora da adenilato ciclase é considerada a via clássica de transdução de sinal mediada pela proteína G.

A adenilato ciclase serve como base para o controle positivo ou negativo das vias de transdução de sinal através das proteínas G. Num controle positivo, a ligação de um ligante estimulador, como a epinefrina, agindo através dos receptores β-adrenérgicos, leva à ativação de proteínas G heterotriméricas com a subunidade α do tipo as (“s” significa estimulação). A ativação de proteínas G do tipo Gs pelo receptor ligado ao ligante faz com que sua subunidade as se ligue ao GTP e depois se dissocie do dímero βγ.

A Figura 2-2 B mostra como a fosfolipase C decompõe o fosfatidilinositol 4,5-bifosfato em inositol 1,4,5-trifosfato e diacilglicerol. Ambas as substâncias, inositol 1,4,5-trifosfato e diacilglicerol, são mensageiros secundários. O IP3, ao se ligar a canais de Ca 2+ dependentes de ligantes específicos do retículo endoplasmático, libera Ca 2+ dele, ou seja, aumenta a concentração de Ca 2+ no citosol. O diacilglicerol, juntamente com o Ca 2+, ativa outra importante classe de proteínas quinases - a proteína quinase C.

Em seguida, é mostrada a estrutura de alguns segundos mensageiros (Fig. 2-2 D-E): cAMP, GMP,

cGMP.

Arroz. 2-2. Exemplos da organização molecular de algumas estruturas envolvidas nas vias de transdução de sinal.

A é um receptor de membrana celular que se liga a um ligante na superfície externa e a uma proteína G heterotrimérica em seu interior. B - organização molecular da adenilato ciclase. B - estrutura do fosfatidilinositol-4,5-difosfato e inositol-1,4,5-trifosfato e diacilglicerol formado pela ação da fosfolipase C. D - estrutura do AMP 3",5"-cíclico (ativador da proteína quinase A). D - estrutura do HMF. E - estrutura do GMP cíclico de 3",5" (ativador da proteína quinase G)

Proteínas G heterotriméricas

A proteína G heterotrimérica consiste em três subunidades: α (40.000–45.000 Da), β (cerca de 37.000 Da) e γ (8.000–10.000 Da). Cerca de 20 genes diferentes que codificam estas subunidades são agora conhecidos, incluindo pelo menos quatro genes da subunidade β e aproximadamente sete genes da subunidade γ de mamíferos. A função e a especificidade de uma proteína G são geralmente, embora nem sempre, determinadas pela sua subunidade α. Na maioria das proteínas G, as subunidades β e γ estão fortemente ligadas entre si. Algumas proteínas G heterotriméricas e as vias de transdução nas quais estão envolvidas estão listadas na Tabela. 2-1.

As proteínas G heterotriméricas servem como intermediários entre os receptores da membrana plasmática para mais de 100 substâncias reguladoras extracelulares e os processos intracelulares que elas controlam. Em termos gerais, a ligação de uma substância reguladora ao seu receptor ativa a proteína G, que ativa ou inibe a enzima e/ou desencadeia uma cadeia de eventos que leva à ativação de canais iônicos específicos.

Na Fig. 2-3 mostra o princípio geral de operação das proteínas G heterotriméricas. Na maioria das proteínas G, a subunidade α é a “trabalhadora” das proteínas G heterotriméricas. A ativação da maioria das proteínas G leva a uma mudança conformacional nesta subunidade. As proteínas G inativas existem principalmente na forma de heterotrímeros αβγ,

com PIB em posições de ligação de nucleotídeos. A interação de proteínas G heterotriméricas com o receptor ligado ao ligante leva à conversão da subunidade α em uma forma ativa com afinidade aumentada para GTP e afinidade reduzida para o complexo βγ. Como resultado, a subunidade α ativada libera GDP, liga-se ao GTP e então se dissocia do dímero βγ. Para a maioria das proteínas G, a subunidade α dissociada interage então com proteínas efetoras na via de transdução de sinal. No entanto, para algumas proteínas G, o dímero βγ liberado pode ser responsável por todos ou alguns dos efeitos do complexo receptor-ligante.

A operação de alguns canais iônicos é modulada diretamente pelas proteínas G, ou seja, sem a participação de mensageiros secundários. Por exemplo, a ligação da acetilcolina aos receptores muscarínicos M2 no coração e em alguns neurônios leva à ativação de uma classe especial de canais de K +. Neste caso, a ligação da acetilcolina ao receptor muscarínico leva à ativação da proteína G. Sua subunidade α ativada então se dissocia do dímero βγ, e o dímero βγ interage diretamente com uma classe especial de canais de K+, trazendo-os para o estado aberto. A ligação da acetilcolina aos receptores muscarínicos, que aumenta a condutividade de K+ das células marca-passo no nó sinoatrial do coração, é um dos principais mecanismos pelos quais os nervos parassimpáticos causam uma diminuição na frequência cardíaca.

Arroz. 2-3. O princípio de funcionamento das proteínas heterotriméricas de ligação ao GTP (proteínas G heterotriméricas).

Tabela 2-1.Algumas proteínas heterotriméricas de ligação ao GTP de mamíferos, classificadas com base em suas subunidades α*

* Dentro de cada classe de subunidades α, várias isoformas são distinguidas. Mais de 20 subunidades α foram identificadas.

Proteínas G monoméricas

As células contêm outra família de proteínas de ligação ao GTP chamadas monomérico Proteínas de ligação ao GTP. Eles também são conhecidos como Proteínas G de baixo peso molecular ou proteínas G pequenas(peso molecular 20.000-35.000 Da). A Tabela 2-2 lista as principais subclasses de proteínas monoméricas de ligação ao GTP e algumas de suas propriedades. As proteínas monoméricas de ligação ao GTP semelhantes a Ras e Rho estão envolvidas na via de transdução de sinal no estágio de transmissão do sinal da tirosina quinase, o receptor do fator de crescimento, para efetores intracelulares. Entre os processos regulados pelas vias de transdução de sinal nas quais estão envolvidas proteínas monoméricas de ligação ao GTP estão o alongamento da cadeia polipeptídica durante a síntese protéica, a proliferação e diferenciação de células, sua degeneração maligna, o controle do citoesqueleto de actina, a comunicação entre o citoesqueleto

e matriz extracelular, transporte de vesículas entre diversas organelas e secreção exocitótica.

As proteínas monoméricas de ligação ao GTP, assim como suas contrapartes heterotriméricas, são interruptores moleculares que existem em duas formas - ativadas “ligadas” e inativadas “desligadas” (Fig. 2-4 B). No entanto, a activação e inactivação de proteínas monoméricas de ligação a GTP requerem proteínas reguladoras adicionais que, tanto quanto se sabe, não são necessárias para a função de proteínas G heterotriméricas. Proteínas G monoméricas são ativadas proteínas liberadoras de nucleotídeos de guanina, e estão inativados Proteínas ativadoras de GTPase. Assim, a ativação e inativação de proteínas monoméricas de ligação ao GTP são controladas por sinais que alteram a atividade proteínas liberadoras de nucleotídeos de guanina ou Proteínas ativadoras de GTPase em vez de direcionar diretamente as proteínas G monoméricas.

Arroz. 2-4. O princípio de operação das proteínas monoméricas de ligação ao GTP (proteínas G monoméricas).

Tabela 2-2.Subfamílias de proteínas monoméricas de ligação ao GTP e alguns processos intracelulares regulados por elas

Mecanismo de operação de proteínas G heterotriméricas

As proteínas G inativas existem principalmente na forma de heterotrímeros αβγ, com GDP em suas posições de ligação aos nucleotídeos (Figura 2.5 A). A interação de proteínas G heterotriméricas com o receptor ligado ao ligante leva à transformação da subunidade α em uma forma ativa, que tem uma afinidade aumentada pelo GTP e uma afinidade diminuída pelo complexo βγ (Fig. 2-5 B ). Na maioria das proteínas G heterotriméricas, é a subunidade α a estrutura que transmite a informação. A ativação da maioria das proteínas G leva a uma mudança conformacional na subunidade α.

Como resultado, a subunidade α ativada libera GDP, liga-se ao GTP (Fig. 2-5 B) e então se dissocia do dímero βγ (Fig. 2-5 D). Na maioria das proteínas G, a subunidade α dissociada interage imediatamente com proteínas efetoras (E 1) na via de transdução de sinal (Fig. 2.5 D). No entanto, para algumas proteínas G, o dímero βγ liberado pode ser responsável por todos ou alguns dos efeitos do complexo receptor-ligante. O dímero βγ interage então com a proteína efetora E 2 (Fig. 2-5 E). Demonstrou-se ainda que membros da família de proteínas G RGS estimulam a hidrólise de GTP (Fig. 2-5 E). Isto inativa a subunidade α e combina todas as subunidades em um heterotrímero αβγ.

Arroz. 2-5. O ciclo de operação de uma proteína G heterotrimérica, que desencadeia uma nova cadeia de eventos com a ajuda de suaα -subunidades.

Designações: R - receptor, L - ligante, E - proteína efetora

Vias de transdução de sinal através de proteínas G heterotriméricas

A Figura 2-6 A mostra os três ligantes, seus receptores acoplados a diferentes proteínas G e seus alvos moleculares. A adenilato ciclase é a base para o controle positivo ou negativo das vias de transdução de sinal mediadas pelas proteínas G. Num controlo positivo, a ligação de um ligando estimulador, como a norepinefrina, que actua através dos receptores β-adrenérgicos, leva à activação de proteínas G heterotriméricas com a subunidade α tipo α S (“s” significa estimulação). Portanto, tal proteína G é chamada de proteína G do tipo GS. A activação de proteínas G do tipo Gs por um receptor ligado ao ligando faz com que a sua subunidade αs se ligue ao GTP e depois se dissocie do dímero βγ.

Outras substâncias reguladoras, como a epinefrina, agindo através dos receptores α 2, ou a adenosina, agindo através dos receptores α 1, ou a dopamina, agindo através dos receptores D 2, estão envolvidas no controle negativo ou inibitório da adenilato ciclase. Essas substâncias reguladoras ativam as proteínas G do tipo G i, que possuem uma subunidade α do tipo α i (“i” significa inibição). Ligação de um ligante inibitório ao seu

o receptor ativa o tipo G i de proteínas G e causa a dissociação de sua subunidade α i do dímero βγ. A subunidade αi ativada liga-se à adenilato ciclase e suprime sua atividade. Além disso, os dímeros βγ podem ligar subunidades α s livres. Desta forma, a ligação dos dímeros βγ à subunidade αs livre suprime ainda mais a estimulação da adenilato ciclase, bloqueando a ação dos ligantes estimuladores.

Outra classe de agonistas extracelulares (Fig. 2.6 A) liga-se a receptores que ativam, por meio de uma proteína G chamada G q, a β-isoforma da fosfolipase C. Ele cliva o fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (um fosfolipídeo presente em pequenas quantidades na membrana plasmática) ao inositol 1,4,5-trifosfato e diacilglicerol, que são mensageiros secundários. IP 3, ligando-se a canais de Ca 2+ dependentes de ligante específicos do retículo endoplasmático, libera Ca 2+ dele, ou seja, aumenta a concentração de Ca 2+ no citosol. Os canais de Ca 2+ do retículo endoplasmático estão envolvidos no acoplamento eletromecânico no músculo esquelético e cardíaco. O diacilglicerol, juntamente com o Ca 2+, ativa a proteína quinase C. Seus substratos incluem, por exemplo, proteínas envolvidas na regulação da divisão celular.

Arroz. 2-6. Exemplos de vias de transdução de sinal através de proteínas G heterotriméricas.

A - nos três exemplos dados, a ligação de um neurotransmissor a um receptor leva à ativação da proteína G e subsequente ativação das vias do segundo mensageiro. Gs, Gq e Gi referem-se a três tipos diferentes de proteínas G heterotriméricas. B - a regulação das proteínas celulares por fosforilação leva ao aumento ou diminuição de sua atividade, e isso, por sua vez, determina a reação celular necessária ao organismo. A fosforilação das proteínas é realizada por proteínas quinases e a desfosforilação é realizada por proteínas fosfatases. A proteína quinase transfere um grupo fosfato (Pi) do ATP para resíduos de serina, treonina ou tirosina de proteínas. Esta fosforilação altera reversivelmente a estrutura e função das proteínas celulares. Ambos os tipos de enzimas, quinases e fosfatases, são regulados por diferentes segundos mensageiros intracelulares

Caminhos para ativação de proteínas quinases intracelulares

A interação das proteínas G heterotriméricas com o receptor ligado ao ligante leva à transformação da subunidade α em uma forma ativa, que tem uma afinidade aumentada pelo GTP e uma afinidade reduzida pelo complexo βγ. A ativação da maioria das proteínas G resulta em uma mudança conformacional na subunidade α, que libera GDP, liga-se ao GTP e então se dissocia do dímero βγ. A subunidade α dissociada interage então com proteínas efetoras na via de transdução de sinal.

A Figura 2-7 A demonstra a ativação de proteínas G heterotriméricas do tipo G s com a subunidade α do tipo α s, que ocorre devido à ligação ao ligante do receptor e leva à ligação da subunidade α s das proteínas G do tipo G s GTP e então se dissocia do dímero βγ e então interage com adenilato-ciclase. Isto leva a um aumento nos níveis de AMPc e à ativação da PKA.

A Figura 2-7 B demonstra a ativação de proteínas G heterotriméricas do tipo G t com a subunidade α do tipo α t, que ocorre devido à ligação ao ligante do receptor e leva ao fato de que a subunidade α t do tipo G t As proteínas G são ativadas e então se dissociam do dímero βγ e então interagem com fosfodiesterase. Isto leva a um aumento nos níveis de cGMP e à ativação de PKG.

O receptor de catecolamina α 1 interage com a subunidade G αq, que ativa a fosfolipase C. A Figura 2-7 B demonstra a ativação de proteínas G heterotriméricas do tipo G αq com a subunidade α do tipo α q, que ocorre devido à ligação do ligante para o receptor e leva ao fato de que a subunidade α q das proteínas G do tipo G αq é ativada e então se dissocia do dímero βγ e então interage com fosfolipase C. Ele cliva o fosfatidilinositol 4,5-difosfato em IP 3 e DAG. Isso resulta em um aumento nos níveis de IP 3 e DAG. IP 3, ligação a canais de Ca 2+ dependentes de ligante específicos do retículo endoplasmático,

libera Ca 2+ dele. O DAG causa a ativação da proteína quinase C. Em uma célula não estimulada, uma quantidade significativa dessa enzima está no citosol em forma inativa. O Ca 2+ faz com que a proteína quinase C se ligue à superfície interna da membrana plasmática. Aqui a enzima pode ser ativada pelo diacilglicerol, que é formado pela hidrólise do fosfatidilinositol 4,5-bifosfato. A fosfatidilserina de membrana também pode ser um ativador da proteína quinase C se a enzima estiver localizada na membrana.

Foram descritas cerca de 10 isoformas da proteína quinase C. Embora algumas delas estejam presentes em muitas células de mamíferos, os subtipos γ e ε são encontrados principalmente em células do sistema nervoso central. Os subtipos de proteína quinase C diferem não apenas na distribuição por todo o corpo, mas, aparentemente, também nos mecanismos de regulação de sua atividade. Alguns deles em células não estimuladas estão associados à membrana plasmática, ou seja, não requerem um aumento na concentração de Ca 2+ para ativação. Algumas isoformas da proteína quinase C são ativadas pelo ácido araquidônico ou outros ácidos graxos insaturados.

A ativação transitória inicial da proteína quinase C ocorre sob a influência do diacilglicerol, que é liberado quando a fosfolipase C β é ativada, e também sob a influência do Ca 2+ liberado das reservas intracelulares pelo IP 3 . A ativação prolongada da proteína quinase C é desencadeada pelas fosfolipases A 2 e D dependentes do receptor. Elas atuam principalmente na fosfatidilcolina, o principal fosfolipídio da membrana. A fosfolipase A 2 separa dela o ácido graxo na segunda posição (geralmente insaturado) e a lisofosfatidilcolina. Ambos os produtos ativam certas isoformas da proteína quinase C. A fosfolipase D dependente do receptor decompõe a fosfatidilcolina para que o ácido fosfatídico e a colina sejam formados. O ácido fosfatídico é posteriormente clivado em diacilglicerol, que está envolvido na estimulação a longo prazo da proteína quinase C.

Arroz. 2-7. Princípios básicos de ativação da proteína quinase A, proteína quinase G e proteína quinase C.

Designações: R - receptor, L - ligante

Proteína quinase dependente de cAMP (proteína quinase A) e vias de sinalização associadas

Na ausência de AMPc, a proteína quinase dependente de AMPc (proteína quinase A) consiste em quatro subunidades: duas reguladoras e duas catalíticas. Na maioria dos tipos de células, a subunidade catalítica é a mesma e as subunidades reguladoras são altamente específicas. A presença de subunidades reguladoras suprime quase completamente a atividade enzimática do complexo. Assim, a activação da actividade enzimática da proteína quinase dependente de cAMP deve envolver a dissociação de subunidades reguladoras do complexo.

A ativação ocorre na presença de concentrações micromolares de AMPc. Cada subunidade reguladora liga duas de suas moléculas. A ligação do AMPc induz alterações conformacionais nas subunidades reguladoras e reduz a afinidade da sua interação com as subunidades catalíticas. Como resultado, as subunidades reguladoras são separadas das subunidades catalíticas e as subunidades catalíticas são ativadas. A subunidade catalítica ativa fosforila proteínas alvo em resíduos específicos de serina e treonina.

Uma comparação das sequências de aminoácidos de proteínas quinases dependentes de cAMP e outras classes mostra que, apesar das fortes diferenças nas suas propriedades reguladoras, todas estas enzimas são altamente homólogas na estrutura primária da parte média. Esta parte contém o domínio de ligação ao ATP e o sítio ativo da enzima, que garante a transferência do fosfato do ATP para a proteína aceitadora. As regiões de quinase além desta seção intermediária catalítica da proteína estão envolvidas na regulação da atividade da quinase.

A estrutura cristalina da subunidade catalítica da proteína quinase dependente de cAMP também foi determinada. A parte intermediária catalítica da molécula, presente em todas as proteínas quinases conhecidas, consiste em duas partes. A porção menor contém um sítio incomum de ligação ao ATP e a porção maior contém um sítio de ligação ao peptídeo. Muitas proteínas quinases também contêm uma região reguladora conhecida como domínio pseudosubstrato. Na sequência de aminoácidos, assemelha-se às regiões fosforiláveis ​​das proteínas substrato. O domínio pseudosubstrato, ao se ligar ao sítio ativo da proteína quinase, inibe a fosforilação dos verdadeiros substratos da proteína quinase. A ativação da quinase pode envolver fosforilação ou modificação alostérica não covalente da proteína quinase para eliminar o efeito inibitório do domínio pseudosubstrato.

Arroz. 2-8. Proteína quinase A dependente de cAMP e alvos.

Quando a epinefrina se liga ao seu receptor correspondente, a ativação da subunidade αs estimula a adenilato ciclase a aumentar os níveis de AMPc. O cAMP ativa a proteína quinase A, que, por meio da fosforilação, tem três efeitos principais. (1) A proteína quinase A ativa a glicogênio fosforilase quinase, que fosforila e ativa a glicogênio fosforilase. (2) A proteína quinase A inativa a glicogênio sintase e, assim, reduz a formação de glicogênio. (3) A proteína quinase A ativa o inibidor-1 da fosfoproteína fosfatase e, assim, inibe a fosfatase. O efeito geral é coordenar as mudanças nos níveis de glicose.

Designações: UDP-glicose - uridina difosfato glicose

Regulação hormonal da atividade da adenilato ciclase

A Figura 2-9 A mostra o principal mecanismo de estimulação e inibição da adenilato ciclase induzida por hormônio. A interação de um ligante com um receptor associado a uma subunidade α do tipo α s (estimulante) causa ativação da adenilato ciclase, enquanto a interação de um ligante com um receptor associado a uma subunidade α do tipo α i (inibitório) causa inibição de a enzima. A subunidade G βγ é idêntica nas proteínas G estimulantes e inibitórias. As subunidades e receptores G α são diferentes. A formação de complexos G α GTP ativos estimulada por ligantes ocorre através dos mesmos mecanismos nas proteínas G αs e G αi. No entanto, G αs GTP e G αi GTP interagem de maneira diferente com a adenilato ciclase. Um (G αs GTP) estimula e o outro G αi GTP) inibe sua atividade catalítica.

A Figura 2.9 B mostra o mecanismo de ativação e inibição da adenilato ciclase induzido por certos hormônios. Os receptores β 1 -, β 2 - e D 1 interagem com subunidades que ativam a adenilato ciclase e aumentam os níveis de AMPc. Os receptores α 2 e D 2 interagem com as subunidades G αi, que inibem a adenilato ciclase. (Já o receptor α 1 interage com a subunidade G, que ativa a fosfolipase C.) Considere um dos exemplos apresentados na figura. A adrenalina se liga ao receptor β 1, o que leva à ativação da proteína G αs, que estimula a adenilato ciclase. Isto leva a um aumento nos níveis intracelulares de AMPc e, assim, aumenta a atividade da PKA. Por outro lado, a norepinefrina liga-se ao receptor α 2, o que leva à ativação da proteína G αi, que inibe a adenilato ciclase e, assim, reduz o nível intracelular de AMPc, reduzindo a atividade da PKA.

Arroz. 2-9. Ativação induzida por ligante (hormônio) e inibição da adenilato ciclase.

A é o mecanismo fundamental. B - mecanismo em relação a hormônios específicos

Proteína quinase C e vias de sinalização associadas

O receptor α 1 interage com a subunidade G αq da proteína G, que ativa a fosfolipase C. A fosfolipase C cliva o fosfatidilinositol 4,5-difosfato em IP 3 e DAG. IP 3, ligando-se a canais de Ca 2+ dependentes de ligante específicos do retículo endoplasmático, libera Ca 2+ dele, ou seja, aumenta a concentração de Ca 2+ no citosol. DAG causa ativação da proteína quinase C. Em uma célula não estimulada, esta enzima é inativa no citosol

forma. Se o nível citosólico de Ca 2+ aumentar, o Ca 2+ interage com a proteína quinase C, o que leva à ligação da proteína quinase C à superfície interna da membrana celular. Nesta posição, a enzima é ativada pelo diacilglicerol formado durante a hidrólise do fosfatidilinositol-4,5-difosfato. A fosfatidilserina de membrana também pode ser um ativador da proteína quinase C se a enzima estiver localizada na membrana.

A Tabela 2-3 lista as isoformas da proteína quinase C de mamíferos e as propriedades dessas isoformas.

Tabela 2-3.Propriedades das isoformas da proteína quinase C de mamíferos

DAG - diacilglicerol; PS - fosfatidilserina; AGL - ácidos graxos cis-insaturados; LPC - lisofosfatidilcolina.

Arroz. 2-10. Vias de sinalização de diacilglicerol/inositol 1,4,5-trifosfato

Fosfolipases e vias de sinalização associadas usando o exemplo do ácido araquidônico

Alguns agonistas via proteínas G ativam fosfolipase A2, que atua nos fosfolipídios da membrana. Os produtos de suas reações podem ativar a proteína quinase C. Em particular, a fosfolipase A 2 separa o ácido graxo localizado na segunda posição dos fosfolipídios. Devido ao fato de alguns fosfolipídios conterem ácido araquidônico nesta posição, causada pela fosfolipase A 2, a quebra desses fosfolipídios libera uma quantidade significativa dele.

A via de sinalização do ácido araquidônico associada à fosfolipase A 2 descrita acima é chamada direta. A via indireta de ativação do ácido araquidônico está associada à fosfolipase C β.

O próprio ácido araquidônico é uma molécula efetora e, além disso, serve como precursor da síntese intracelular. prostaglandinas, prostaciclinas, tromboxanos E leucotrienos- classes importantes de moléculas reguladoras. O ácido araquidônico também é formado a partir dos produtos de degradação dos diacilgliceróis.

Prostaglandinas, prostaciclinas e tromboxanos são sintetizados a partir do ácido araquidônico via dependente da ciclooxigenase, e leucotrienos - via dependente de lipoxigenase. Um dos efeitos antiinflamatórios dos glicocorticóides é justamente a inibição da fosfolipase A 2, que libera ácido araquidônico dos fosfolipídios. O ácido acetilsalicílico (aspirina ) e outros antiinflamatórios não esteróides inibem a oxidação do ácido araquidônico pela ciclooxigenase.

Arroz. 2-11. Vias de sinalização do ácido araquidônico.

Designações: PG - prostaglandina, LH - leucotrieno, GPETE - hidroperoxieicosatetraenoato, GETE - hidroxieicosatetraenoato, EPR - retículo endoplasmático

Calmodulina: estrutura e funções

Uma variedade de processos celulares vitais, incluindo liberação de neurotransmissores, secreção hormonal e contração muscular, são regulados pelos níveis citosólicos de Ca 2+. Uma forma pela qual esse íon influencia os processos celulares é através de sua ligação à calmodulina.

Calmodulina- proteína com peso molecular de 16.700 (Fig. 2-12 A). Está presente em todas as células, às vezes representando até 1% do seu conteúdo proteico total. A calmodulina liga-se a quatro íons de cálcio (Fig. 2.12 B e C), após o que esse complexo regula a atividade de várias proteínas intracelulares, muitas das quais não são proteínas quinases.

O complexo Ca 2+ com calmodulina também ativa proteínas quinases dependentes de calmodulina. Proteínas quinases específicas dependentes de calmodulina fosforilam proteínas efetoras específicas, como cadeias leves reguladoras de miosina, fosforilase e fator de alongamento II. As proteínas quinases multifuncionais dependentes de calmodulina fosforilam numerosas proteínas nucleares, do citoesqueleto ou de membrana. Algumas proteínas quinases dependentes de calmodulina, como

a cadeia leve da miosina e a fosforilase quinase atuam em apenas um substrato celular, enquanto outras são multifuncionais e fosforilam mais de uma proteína substrato.

A proteína quinase II dependente de calmodulina é uma proteína importante do sistema nervoso. Em algumas áreas do cérebro, representa até 2% da proteína total. Essa quinase está envolvida no mecanismo pelo qual um aumento na concentração de Ca 2+ na terminação nervosa provoca a liberação de um neurotransmissor por exocitose. Seu principal substrato é uma proteína chamada sinapsina eu, presente nas terminações nervosas e ligando-se à superfície externa das vesículas sinápticas. Quando a sinapsina I está ligada às vesículas, evita a exocitose. A fosforilação da sinapsina I faz com que ela se separe das vesículas, permitindo-lhes liberar neurotransmissores na fenda sináptica por exocitose.

A quinase de cadeia leve da miosina desempenha um papel importante na regulação da contração do músculo liso. Um aumento na concentração citosólica de Ca 2+ nas células musculares lisas ativa a quinase da cadeia leve da miosina. A fosforilação das cadeias leves reguladoras da miosina leva à contração prolongada das células musculares lisas.

Arroz. 2-12. Calmodulina.

A - calmodulina sem cálcio. B - ligação do cálcio à calmodulina e ao peptídeo alvo. B - esquema de conexão.

Designações: EF - domínios de ligação a Ca 2+ da calmodulina

Receptores com atividade enzimática intrínseca (receptores catalíticos)

Hormônios e fatores de crescimento ligam-se a proteínas da superfície celular que possuem atividade enzimática no lado citoplasmático da membrana. A Figura 2-13 mostra as cinco classes de receptores catalíticos.

Um dos exemplos típicos de transmembrana receptores com atividade de guanilato ciclase, receptor do peptídeo natriurético atrial (ANP). O receptor de membrana ao qual o ANP se liga é independente dos sistemas de transdução de sinal considerados. A ação dos agonistas extracelulares foi descrita acima, os quais, ao se ligarem aos receptores de membrana, ativam a adenilato ciclase através das proteínas G s ou a inibem através do G i . Os receptores de membrana para ANP são interessantes porque os próprios receptores possuem atividade de guanilato ciclase, estimulada pela ligação do ANP ao receptor.

Os receptores ANP possuem um domínio extracelular de ligação ao ANP, uma única hélice transmembrana e um domínio intracelular de guanilato ciclase. A ligação do ANP ao receptor aumenta os níveis intracelulares de cGMP, o que estimula a proteína quinase dependente de cGMP. Em contraste com a proteína quinase dependente de cAMP, que possui subunidades reguladoras e catalíticas, os domínios reguladores e catalíticos da proteína quinase dependente de cGMP estão localizados na mesma cadeia polipeptídica. A quinase dependente de cGMP fosforila proteínas intracelulares, levando a várias respostas celulares.

Receptores com atividade serina-treonina quinase fosforilam proteínas apenas em resíduos de serina e/ou treonina.

Outra família de receptores de membrana não acoplados à proteína G consiste em proteínas com atividade intrínseca de tirosina-proteína quinase. Receptores com sua própria atividade tirosina-proteína quinase são proteínas com um domínio extracelular glicosilado, o único

região transmembrana e domínio intracelular com atividade tirosina-proteína quinase. Ligar um agonista a eles, por ex. fator de crescimento nervoso (NGF), estimula a atividade da tirosina-proteína quinase, que fosforila proteínas efetoras específicas em certos resíduos de tirosina. A maioria dos receptores do fator de crescimento dimeriza quando o NGF se liga a eles. É a dimerização do receptor que leva ao aparecimento de sua atividade tirosina proteína quinase. Os receptores ativados geralmente se fosforilam, o que é chamado de autofosforilação.

Para a superfamília receptores peptídicos incluem receptores de insulina. Estas também são proteínas tirosina quinases. Na subclasse de receptores pertencentes à família dos receptores de insulina, o receptor não ligado existe como um dímero ligado por dissulfureto. A interação com a insulina leva a alterações conformacionais em ambos os monômeros, o que aumenta a ligação à insulina, ativa o receptor tirosina quinase e leva ao aumento da autofosforilação do receptor.

A ligação de um hormônio ou fator de crescimento ao seu receptor desencadeia uma variedade de respostas celulares, incluindo a entrada de Ca 2+ no citoplasma, aumento do metabolismo Na + /H +, estimulação da captação de aminoácidos e açúcares, estimulação da fosfolipase C β e hidrólise de difosfato de fosfatidilinositol.

Receptores hormônio do crescimento, prolactina E eritropoetina, assim como os receptores interferon e muitos citocinas, não servem diretamente como proteínas quinases. No entanto, após a ativação, esses receptores formam complexos de sinalização com tirosina-proteína quinases intracelulares, que desencadeiam seus efeitos intracelulares. É por isso que eles não são verdadeiros receptores com atividade própria de tirosina-proteína quinase, mas simplesmente se ligam a eles.

Com base na estrutura, pode-se supor que a transmembrana proteína tirosina fosfatases também são receptores, e sua atividade da proteína tirosina fosfatase é modulada por ligantes extracelulares.

Arroz. 2-13. Receptores catalíticos.

A - receptor de guanil ciclase, B - receptor com atividade de serina-treonina quinase, B - receptor com sua própria atividade de tirosina-proteína quinase, D - receptores associados à atividade de tirosina-proteína quinase

Proteína tirosina quinases associadas a receptores usando o exemplo de receptores de interferon

Os receptores de interferon não são diretamente proteínas quinases. Uma vez ativados, esses receptores formam complexos de sinalização com tirosina-proteína quinases intracelulares, que desencadeiam seus efeitos intracelulares. Ou seja, eles não são verdadeiros receptores com atividade própria de tirosina-proteína quinase, mas simplesmente se ligam a eles, os chamados receptores tirosina-proteína quinases associadas a receptores (dependentes de receptores).

Os mecanismos pelos quais esses receptores exercem seus efeitos são desencadeados quando um hormônio se liga ao receptor, causando sua dimerização. Um dímero receptor liga um ou mais membros Jano-família de proteínas tirosina quinases (JAK). JAK então cruza

fosforilam entre si e também com o receptor. Membros da família de transdutores de sinal e ativadores de transcrição (STAT) ligam domínios fosforilados no receptor e no complexo JAK. As proteínas STAT são fosforiladas pelas quinases JAK e depois dissociadas do complexo de sinalização. As proteínas STAT fosforiladas eventualmente formam dímeros que se movem para o núcleo para ativar a transcrição de certos genes.

A especificidade do receptor para cada hormônio depende em parte da especificidade dos membros da família JAK ou STAT que se combinam para formar o complexo de sinalização. Em alguns casos, o complexo de sinalização também ativa a cascata de quinases MAP (proteína ativadora de mitógenos) por meio de proteínas adaptadoras usadas pelos receptores tirosina quinases. Algumas das respostas do ligante do receptor tirosina quinase também envolvem as vias JAK e STAT.

Arroz. 2-14. Exemplo de receptores catalíticos associados à atividade da proteína tirosina quinase. receptor ativado por α -interferon (A) eγ - interferon (B)

Proteínas G monoméricas semelhantes a Ras e suas vias de transdução mediadas

Um ligante, como um fator de crescimento, liga-se a um receptor que possui sua própria atividade de proteína tirosina quinase, resultando em aumento da transcrição em um processo de 10 etapas. Proteínas monoméricas de ligação a GTP semelhantes a Ras participar da via de transdução de sinal na fase de transmissão do sinal de receptores com sua própria atividade tirosina-proteína quinase (por exemplo, receptores de fator de crescimento) para efetores intracelulares. A ativação e inativação de proteínas monoméricas de ligação ao GTP requerem proteínas reguladoras adicionais. As proteínas G monoméricas são ativadas por proteínas liberadoras de nucleotídeos de guanina (GNRPs) e inativadas por proteínas ativadoras de GTPase (GAPs).

As proteínas monoméricas de ligação ao GTP da família Ras medeiam a ligação de ligantes mitogênicos e seus receptores de proteína tirosina quinase, o que desencadeia processos intracelulares que levam à proliferação celular. Quando as proteínas Ras estão inativas, as células não respondem aos fatores de crescimento que atuam através dos receptores tirosina quinase.

A ativação de Ras desencadeia uma via de transdução de sinal, levando em última análise à transcrição de certos genes que promovem o crescimento celular. A cascata da MAP quinase (MAPK) está envolvida nas respostas após a ativação do Ras. A proteína quinase C também ativa a cascata da MAP quinase. Assim, a cascata da MAP quinase parece ser um importante ponto de convergência para uma variedade de efeitos que induzem a proliferação celular. Além disso, há um cruzamento entre a proteína quinase C e a tirosina quinase. Por exemplo, a isoforma γ da fosfolipase C é ativada pela ligação à proteína Ras ativada. Essa ativação é transmitida à proteína quinase C no processo de estimulação da hidrólise dos fosfolipídios.

A Figura 2-15 mostra um mecanismo que inclui 10 estágios.

1. A ligação do ligante leva à dimerização do receptor.

2. A proteína tirosina quinase ativada (RTK) se fosforila.

3.GRB 2 (proteína 2 ligada ao receptor do fator de crescimento), uma proteína contendo SH 2, reconhece resíduos de fosfotirosina no receptor ativado.

4. A ligação GRB 2 inclui SOS (filho de sete) proteína de troca de nucleotídeos guanina.

5.SOS ativa Ras formando GTP em Ras em vez de PIB.

6.O complexo ativo Ras-GTP ativa outras proteínas incorporando-as fisicamente na membrana plasmática. O complexo ativo Ras-GTP interage com a porção N-terminal da serina-treonina quinase Raf-1 (conhecida como proteína ativadora de mitógeno, MAP), a primeira de uma série de proteínas quinases ativadas que transmitem um sinal de ativação para a célula núcleo.

7.Raf-1 fosforila e ativa uma proteína quinase chamada MEK, que é conhecida como MAP quinase quinase (MAPKK). MEK é uma proteína quinase multifuncional que fosforila substratos de resíduos de tirosina e serina/treonina.

8.MEK fosforila a MAP quinase (MAPK), que também é desencadeada pela quinase reguladora do sinal extracelular (ERK 1, ERK 2). A ativação da MAPK requer dupla fosforilação em resíduos adjacentes de serina e tirosina.

9. A MAPK serve como uma molécula efetora crítica na transdução de sinal dependente de Ras porque fosforila muitas proteínas celulares após estimulação mitogênica.

10.A MAPK ativada é translocada para o núcleo, onde fosforila o fator de transcrição. Em geral, Ras ativado ativa MAP

conectando-se com ela. Esta cascata resulta na fosforilação e ativação da MAP quinase, que por sua vez fosforila fatores de transcrição, substratos proteicos e outras proteínas quinases importantes para a divisão celular e outras respostas. A ativação de Ras depende da ligação de proteínas adaptadoras aos domínios de fosfotirosina em receptores ativados por fator de crescimento. Essas proteínas adaptadoras se ligam e ativam a GNRF (proteína de troca de nucleotídeos de guanina), que ativa Ras.

Arroz. 2-15. Regulação da transcrição por proteínas G monoméricas semelhantes a Ras, desencadeadas por um receptor com atividade própria de tirosina-proteína quinase

Regulação da transcrição pela proteína de interação com elementos de DNA dependente de cAMP (CREB)

CREB, um fator de transcrição amplamente distribuído, está normalmente associado a uma região do DNA chamada CRE (elemento de resposta cAMP). Na ausência de estimulação, o CREB é desfosforilado e não tem efeito na transcrição. Numerosas vias de transdução de sinal através da ativação de quinases (como PKA, Ca2+/calmodulina quinase IV, MAP quinase) levam à fosforilação de CREB. CREB fosforilado se liga C.B.P.(proteína de ligação a CREB- Proteína de ligação a CREB), que possui um domínio estimulador da transcrição. Paralelamente, a fosforilação ativa PP1

(fosfoproteína fosfatase 1), que desfosforila o CREB, resultando em parada transcricional.

Foi demonstrado que a ativação do mecanismo mediado por CREB é importante para a implementação de funções cognitivas superiores, como aprendizagem e memória.

A Figura 2.15 também mostra a estrutura da PKA dependente de AMPc, que na ausência de AMPc consiste em quatro subunidades: duas regulatórias e duas catalíticas. A presença de subunidades reguladoras suprime a atividade enzimática do complexo. A ligação do AMPc induz alterações conformacionais nas subunidades reguladoras, resultando na separação das subunidades reguladoras das subunidades catalíticas. A PKA catalítica entra no núcleo da célula e inicia o processo descrito acima.

Arroz. 2-16. Regulação da transcrição gênica por CREB (proteína de ligação ao elemento de resposta cAMP) através de um aumento nos níveis de monofosfato de adenosina cíclico

I. Penetração do esteróide (C) na célula

II. Formação do complexo SR

Todos os hormônios esteróides P são proteínas globulares de aproximadamente o mesmo tamanho que se ligam aos hormônios com afinidade muito alta.

III. Transformação de CP em uma forma capaz de se ligar a aceitadores nucleares [CP]

Qualquer célula contém toda a informação genética. No entanto, com a especialização celular, a maior parte do DNA fica privada da capacidade de servir como modelo para a síntese de mRNA. Isto é conseguido dobrando-se em torno de proteínas histonas, levando à inibição da transcrição. A este respeito, o material genético de uma célula pode ser dividido em 3 tipos de DNA:

1. transcricionalmente inativo

2. constantemente expresso

3.induzido por hormônios ou outras moléculas sinalizadoras.

4. Ligação de [CP] ao aceitador de cromatina

Ressalta-se que esta etapa da ação C não foi totalmente estudada e apresenta uma série de questões controversas. Acredita-se que [CP] interage com regiões específicas do DNA de uma forma que permite que a RNA polimerase entre em contato com domínios específicos do DNA.

Uma experiência interessante mostrou que a meia-vida do mRNA aumenta quando estimulado por um hormônio. Isto leva a muitas contradições: não fica claro se um aumento na quantidade de mRNA indica que [CP] aumenta a taxa de transcrição ou aumenta a meia-vida do mRNA; ao mesmo tempo, o aumento da meia-vida do mRNA é explicado pela presença de um grande número de ribossomos em uma célula estimulada por hormônio, que estabilizam o mRNA ou outro efeito de [CP] desconhecido para nós no momento.

V. Iniciação seletiva da transcrição de mRNAs específicos; síntese coordenada de tRNA e rRNA

Pode-se presumir que o principal efeito da [CP] é afrouxar a cromatina condensada, o que leva à abertura do acesso às moléculas de RNA polimerase. Um aumento na quantidade de mRNA leva a um aumento na síntese de tRNA e rRNA.

VI. Processamento de RNAs primários

VII. Transporte de mRNA para o citoplasma

VIII. Síntese proteíca

IX. Modificação de proteína pós-tradução

No entanto, como mostram as pesquisas, este é o principal, mas não o único mecanismo possível de ação dos hormônios. Por exemplo, andrógenos e estrogênios causam um aumento no AMPc em algumas células, sugerindo que também existem receptores de membrana para hormônios esteróides. Isso mostra que os hormônios esteróides atuam em algumas células sensíveis, como os hormônios solúveis em água.

Intermediários secundários

Hormônios peptídicos, aminas e neurotransmissores, ao contrário dos esteróides, são compostos hidrofílicos e não são capazes de penetrar facilmente na membrana plasmática da célula. Portanto, eles interagem com receptores de membrana localizados na superfície celular. A interação hormônio-receptor inicia uma reação biológica altamente coordenada que pode envolver muitos componentes celulares, alguns dos quais estão localizados a uma distância considerável da membrana plasmática.

O cAMP é o primeiro composto que Sutherland, que o descobriu, chamou de “segundo mensageiro”, porque considerou o “primeiro mensageiro” o próprio hormônio, que causa a síntese intracelular do “segundo mensageiro”, que medeia o efeito biológico do primeiro.

Hoje, pelo menos 3 tipos de segundos mensageiros podem ser nomeados: 1) nucleotídeos cíclicos (cAMP e cGMP); 2) íons Ca e 3) metabólitos de fosfatidilinositol.

Com a ajuda de tais sistemas, um pequeno número de moléculas hormonais, ligando-se aos receptores, provoca a produção de um número muito maior de moléculas de segundos mensageiros, e estas, por sua vez, influenciam a atividade de um número ainda maior de moléculas proteicas. Assim, ocorre uma amplificação progressiva do sinal que ocorre inicialmente quando o hormônio se liga ao receptor.

TsAMP

De forma simplificada, a ação do hormônio através do AMPc pode ser representada da seguinte forma:

1. hormônio + receptor estereoespecífico

2. ativação da adenilato ciclase

3. Formação de AMPc

4. garantir reação coordenada por cAMP

Ambiente externo hormonal

Membrana Receptora

5'-cAMP 3',5'-cAMP ATP

Proteína quinase inativa

Fosfodiesterase

Proteína quinase ativa

Defosfoproteína Fosfoproteína

Fosfoproteína fosfatase

Efeito biológico

Figura 1

1. Deve-se notar que os receptores também são estruturas dinâmicas. Isso significa que seu número pode diminuir ou aumentar. Por exemplo, em pessoas com peso corporal aumentado, o número de receptores de insulina diminui. Experimentos mostraram que quando sua massa é normalizada, nota-se um aumento no número de receptores para um nível normal. Em outras palavras, quando a concentração de insulina aumenta ou diminui, ocorrem alterações recíprocas na concentração do receptor. Acredita-se que esse fenômeno possa proteger a célula de uma estimulação muito intensa quando o nível hormonal está inadequadamente alto.

2. A ativação da adenilato ciclase (A) também é um processo regulado. Anteriormente, acreditava-se que o hormônio (G), ao se ligar ao receptor (P), muda sua conformação, o que leva à ativação de A. Porém, descobriu-se que A é uma enzima alostérica que é ativada pelo GTP. O GTP transporta uma proteína especial (transdutor) G. Nesse sentido, foi adotado um modelo que descreve não apenas a ativação de A, mas também o término desse processo

a) G + P + G·GDF ® G·R·G + GDF

b) G P G + GTP ® G + P + G GTP

c) G GTP + A ® cAMP + G PIB

Assim, o sinal que “desliga” o sistema é a hidrólise do GTP. Para retomar o ciclo, o HDF deve se separar de G, o que ocorre quando o hormônio se liga a P.

Alguns fatores têm efeito inibitório sobre A e causam diminuição na concentração de AMPc. Exemplos de agonistas estimuladores da ciclase incluem glucagon, ADH, LH, FSH, TSH e ACTH. Os fatores que inibem a ciclase incluem opioides, somatostatina, angiotensina II e acetilcolina. A adrenalina pode estimular (através dos receptores b) e inibir (através dos receptores a) esta enzima. Surge a questão de como é realizada a regulação bidirecional de A. Descobriu-se que o sistema inibitório inclui uma proteína tridimensional que é extremamente semelhante à proteína G dada acima. O efeito Gi pode ser descrito da seguinte forma:

a) G + P + Gi·GDF ® G·R·Gi + GDF

b) G P Gi + GTP ® G + P + Gi GTP

c) Gi·GTP + A ® ¯cAMP + Gi·PIB

Após a fosforilação das proteínas enzimáticas durante as reações descritas acima (ver Fig. 1), sua conformação muda. Consequentemente, a conformação do seu centro ativo também muda, o que leva à sua ativação ou inibição. Acontece que, graças ao segundo mensageiro cAMP, a ação de enzimas específicas dele é ativada ou inibida na célula, o que provoca certo efeito biológico característico dessa célula. Nesse sentido, apesar do grande número de enzimas que atuam através do mensageiro secundário cAMP, ocorre uma certa resposta específica na célula.

Mensageiros– substâncias de baixo peso molecular que transportam sinais hormonais dentro da célula. Eles têm uma alta taxa de movimento, clivagem ou remoção (Ca 2+, cAMP, cGMP, DAG, ITP).

As violações na troca de mensageiros acarretam consequências graves. Por exemplo, os ésteres de forbol, que são análogos do DAG, mas ao contrário dos quais não são decompostos no corpo, contribuem para o desenvolvimento de tumores malignos.

acampamento descoberto por Sutherland na década de 50 do século passado. Por esta descoberta ele recebeu o Prêmio Nobel. O AMPc está envolvido na mobilização das reservas de energia (quebra de carboidratos no fígado ou triglicerídeos nas células adiposas), na retenção de água pelos rins, na normalização do metabolismo do cálcio, no aumento da força e frequência das contrações cardíacas, no formação de hormônios esteróides, no relaxamento dos músculos lisos e assim por diante.

cGMP ativa PC G, PDE, Ca 2+ -ATPase, fecha canais de Ca 2+ e reduz o nível de Ca 2+ no citoplasma.

Enzimas

Enzimas de sistemas em cascata catalisam:

• formação de mensageiros secundários do sinal hormonal;
• ativação e inibição de outras enzimas;
• transformação de substratos em produtos;

Adenilato ciclase (AC)

Glicoproteína com massa de 120 a 150 kDa, possui 8 isoformas, enzima chave do sistema adenilato ciclase, com Mg 2+ catalisa a formação do mensageiro secundário cAMP a partir do ATP.

AC contém 2 grupos –SH, um para interação com a proteína G e outro para catálise. AC contém vários centros alostéricos: para Mg 2+, Mn 2+, Ca 2+, adenosina e forscolina.

Encontrado em todas as células, localizado na parte interna da membrana celular. A atividade AC é controlada por: 1) reguladores extracelulares - hormônios, eicosanóides, aminas biogênicas através de proteínas G; 2) regulador intracelular de Ca 2+ (4 isoformas AC dependentes de Ca 2+ são ativadas por Ca 2+).

Proteína quinase A (PK A)

PC A está presente em todas as células, catalisa a reação de fosforilação dos grupos OH da serina e treonina de proteínas e enzimas reguladoras, participa do sistema adenilato ciclase e é estimulada pelo AMPc. PC A consiste em 4 subunidades: 2 regulatórias R(massa 38.000 Da) e 2 catalíticos COM(massa 49.000 Da). As subunidades reguladoras possuem 2 locais de ligação ao cAMP. O tetrâmero não tem atividade catalítica. A adição de 4 cAMP a 2 subunidades R leva a uma mudança na sua conformação e dissociação do tetrâmero. Isto libera 2 subunidades catalíticas ativas C, que catalisam a reação de fosforilação de proteínas e enzimas reguladoras, o que altera sua atividade.

Proteína quinase C (PK C)

PC C participa do sistema inositol trifosfato e é estimulado por Ca 2+ , DAG e fosfatidilserina. Possui um domínio regulatório e catalítico. PC C catalisa a reação de fosforilação de proteínas enzimáticas.

Proteína quinase G (PK G) encontrado apenas nos pulmões, cerebelo, músculos lisos e plaquetas, participa do sistema guanilato ciclase. PC G contém 2 subunidades, é estimulado por cGMP, catalisa a reação de fosforilação de proteínas enzimáticas.

Fosfolipase C (PL C)

Hidrolisa a ligação fosfoéster em fosfatidilinositóis para formar DAG e IP 3, possui 10 isoformas. A PL C é regulada através de proteínas G e ativada por Ca 2+ .

Fosfodiesterase (PDE)

PDE converte cAMP e cGMP em AMP e GMP, inativando o sistema adenilato ciclase e guanilato ciclase. PDE é ativado por Ca 2+ , 4Ca 2+ -calmodulina, cGMP.

SEM sintaseé uma enzima complexa, que é um dímero com vários cofatores ligados a cada uma de suas subunidades. NÃO sintase possui isoformas.

A maioria das células do corpo humano e animal são capazes de sintetizar e liberar NO, mas três populações celulares têm sido mais estudadas: o endotélio dos vasos sanguíneos, os neurônios e os macrófagos. De acordo com o tipo de tecido sintetizador, a NO sintase possui 3 isoformas principais: neuronal, macrófago e endotelial (referidas como NO sintase I, II e III, respectivamente).

As isoformas neuronais e endoteliais da NO sintase estão constantemente presentes nas células em pequenas quantidades e sintetizam NO em concentrações fisiológicas. Eles são ativados pelo complexo calmodulina-4Ca 2+.

A NO sintase II está normalmente ausente nos macrófagos. Quando os macrófagos são expostos a lipopolissacarídeos de origem microbiana ou citocinas, eles sintetizam uma enorme quantidade de NO sintase II (100-1000 vezes mais que as NO sintases I e III), que produz NO em concentrações tóxicas. Os glicocorticóides (hidrocortisona, cortisol), conhecidos por sua atividade antiinflamatória, inibem a expressão da NO sintase nas células.

Ação NÃO

O NO é um gás de baixo peso molecular, penetra facilmente nas membranas celulares e nos componentes da substância intercelular, possui alta reatividade, sua meia-vida em média não ultrapassa 5 s, a distância de difusão possível é pequena, em média 30 mícrons.

Em concentrações fisiológicas, o NO tem um poderoso efeito vasodilatador.:

· O endotélio produz constantemente pequenas quantidades de NO.

· Sob várias influências - mecânicas (por exemplo, com aumento do fluxo sanguíneo ou pulsação), químicas (lipopolissacarídeos bacterianos, citocinas de linfócitos e plaquetas sanguíneas, etc.) - a síntese de NO nas células endoteliais aumenta significativamente.

· O NO do endotélio se difunde para as células musculares lisas vizinhas da parede do vaso e ativa nelas a guanilato ciclase, que sintetiza o cGMP através do 5c.

· O cGMP leva a uma diminuição do nível de íons cálcio no citosol das células e a um enfraquecimento da ligação entre a miosina e a actina, o que permite que as células relaxem após 10 s.

A droga nitroglicerina opera com base neste princípio. Quando a nitroglicerina é decomposta, forma-se NO, o que leva à dilatação dos vasos sanguíneos do coração e, como resultado, alivia a sensação de dor.

NO regula o lúmen dos vasos cerebrais. A ativação de neurônios em qualquer área do cérebro leva à excitação de neurônios contendo NO sintase e/ou astrócitos, nos quais a síntese de NO também pode ser induzida, e o gás liberado das células leva à dilatação local dos vasos sanguíneos na área de excitação.

O NO está envolvido no desenvolvimento do choque séptico, quando um grande número de microrganismos circulantes no sangue ativam acentuadamente a síntese de NO no endotélio, o que leva à dilatação prolongada e forte de pequenos vasos sanguíneos e, como resultado, a uma diminuição significativa na pressão arterial, que é difícil de responder aos efeitos terapêuticos.

Em concentrações fisiológicas, o NO melhora as propriedades reológicas do sangue:

O NO, formado no endotélio, evita a adesão de leucócitos e plaquetas sanguíneas ao endotélio e também reduz a agregação destas.

O NO pode atuar como um fator anticrescimento que impede a proliferação de células musculares lisas na parede vascular, um importante elo na patogênese da aterosclerose.

Em altas concentrações, o NO tem efeito citostático e citolítico nas células (bacterianas, cancerígenas, etc.) da seguinte forma:

· quando o NO interage com o ânion radical superóxido, forma-se peroxinitrito (ONOO-), que é um forte agente oxidante tóxico;

· O NO liga-se fortemente ao grupo hemina das enzimas que contêm ferro e inibe-as (a inibição das enzimas de fosforilação oxidativa mitocondrial bloqueia a síntese de ATP, a inibição das enzimas de replicação do ADN contribui para a acumulação de danos no ADN).

· O NO e o peroxinitrito podem danificar diretamente o ADN, o que leva à ativação de mecanismos de proteção, em particular a estimulação da enzima poli(ADP-ribose) sintetase, que reduz ainda mais os níveis de ATP e pode levar à morte celular (via apoptose).

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