As doenças metabólicas hereditárias são uma grande classe de doenças humanas hereditárias, incluindo mais de 600 formas diferentes. O número de novas formas de doenças e até classes metabólicas cresce a cada ano, e o número de publicações relacionadas às possibilidades de diagnóstico, prevenção e, principalmente, tratamento de doenças metabólicas aumenta exponencialmente. Certas formas de doenças metabólicas são raras ou extremamente raras, mas a sua frequência total é bastante elevada e ascende a 1:3.000-1:5.000 recém-nascidos vivos. Uma propriedade característica dessas doenças são alterações bioquímicas pronunciadas que aparecem antes do início dos primeiros sintomas clínicos.

De acordo com a classificação bioquímica, as doenças metabólicas são divididas em 22 grupos dependendo do tipo de via metabólica danificada (aminoacidopatia, distúrbios do metabolismo de carboidratos, etc.) ou dependendo de sua localização dentro de um componente celular específico (doenças lisossomais, peroxissomais e mitocondriais).

A classificação bioquímica das doenças metabólicas é a seguinte.
Doenças de depósito lisossômico.
Doenças mitocondriais.
Doenças peroxissomais.
Distúrbios congênitos da glicosilação.
Distúrbios do metabolismo da creatinina.
Distúrbios do metabolismo do colesterol.
Síntese prejudicada de citocinas e outros imunomoduladores.
Distúrbios do metabolismo de aminoácidos/ácidos orgânicos.
Distúrbios da b-oxidação mitocondrial.
Distúrbios do metabolismo dos corpos cetônicos.
Distúrbios do metabolismo de gorduras e ácidos graxos, lipoproteínas.
Distúrbios do metabolismo de carboidratos e glicogênio.
Distúrbios do transporte de glicose.
Distúrbios do metabolismo do glicerol.
Distúrbios do metabolismo das vitaminas.
Distúrbios do metabolismo de metais e ânions.
Distúrbios do metabolismo dos ácidos biliares.
Distúrbios do metabolismo dos neurotransmissores.
Distúrbios do metabolismo de esteróides e outros hormônios.
Distúrbios do metabolismo do heme e da porfirina.
Distúrbios do metabolismo das purinas/pirimidinas.
Distúrbios do metabolismo da bilirrubina.

Mecanismos básicos da patogênese das doenças metabólicas
ACÚMULO DE SUBSTRATO
O acúmulo de substrato para uma reação enzimática bloqueada é um dos principais mecanismos de patogênese na grande maioria das doenças metabólicas.

Em primeiro lugar, isto diz respeito à perturbação de reações catabólicas, como a quebra de grandes macromoléculas, aminoácidos, ácidos orgânicos, etc. Se o substrato acumulado for facilmente removido das células e a sua concentração nos fluidos biológicos for muitas vezes superior à homeostática nível, o equilíbrio ácido-base pode mudar (ácidos orgânicos na acidúria orgânica), seu acúmulo ocorre em vários tecidos (ácido homogentísico na alcaptonúria). Em alguns casos, o substrato compete com compostos semelhantes durante o transporte através da barreira hematoencefálica, levando à sua depleção no cérebro (aminoacidopatia). Se o substrato acumulado for pouco solúvel, acumula-se no interior da célula, o que desencadeia os mecanismos de morte apoptótica. Uma das consequências adicionais do acúmulo de substrato pode ser a ativação de vias metabólicas menores, cuja gravidade específica durante o metabolismo normal é insignificante.

Este mecanismo, por exemplo, está subjacente ao acúmulo de ácido fenilpirúvico na fenilcetonúria.

Os metabólitos acumulados têm importante valor diagnóstico, em alguns casos sua análise quantitativa ou semiquantitativa permite determinar com precisão a forma da doença. No caso de acidúria orgânica e aminoacidopatia, o acúmulo de grandes quantidades de compostos solúveis em água no plasma sanguíneo e na urina permite sua rápida determinação quantitativa ou qualitativa por meio de métodos de análise cromatográficos.

INSUFICIÊNCIA DE PRODUTOS DE REAÇÃO
A insuficiência de produtos de reação é o segundo principal mecanismo na patogênese das doenças metabólicas. A causa das alterações patológicas pode ser uma deficiência direta do produto da reação bloqueada. Por exemplo, com um defeito na biotinidase, a clivagem da biotina das proteínas da dieta é prejudicada e as manifestações clínicas da doença estão associadas à deficiência desta vitamina.

A insuficiência de produtos de reação no processo cíclico da uréia cria uma situação metabólica notável - alguns aminoácidos passam de não essenciais à categoria de essenciais. Assim, na acidúria arginina-succínica, ocorre uma violação da formação de arginina a partir do ácido arginina-succínico, o que leva à deficiência de arginina e ornitina. Em alguns casos pode haver deficiência de um produto mais distante dessa cadeia metabólica por exemplo aldosterona e cortisol com síndrome adrenogenital

ISOLAMENTO METABÓLICO
É necessário incluir as doenças associadas à liberação metabólica do produto da reação em um grupo separado. Este é o principal mecanismo de patogênese nos casos de distúrbios de proteínas transportadoras, que não são enzimas, mas estão envolvidas na regulação de uma determinada reação bioquímica. A cascata de eventos metabólicos desencadeada nestas doenças tem consequências semelhantes para o corpo e para a célula. A síndrome de hiperornitinemia-hiperamonemia-homocitrulinúria (um acrônimo para três principais marcadores bioquímicos - hiperamonemia, hiperornitinemia, homocitrulinemia) está associada ao transporte prejudicado de ornitina. Como resultado, há uma deficiência de ornitina nas mitocôndrias, o que leva ao acúmulo de carbamoil fosfato e amônio.

É quase impossível destacar um único mecanismo principal de patogênese, uma vez que os processos metabólicos estão intimamente inter-relacionados. Via de regra, observa-se uma combinação de todos os mecanismos descritos e, com cada um dos blocos enzimáticos, ocorrem alterações significativas em toda a rede metabólica da célula.

Diagnóstico laboratorial de doenças metabólicas hereditárias
O diagnóstico diferencial de doenças metabólicas hereditárias depende inteiramente do uso de uma gama incomumente ampla de métodos bioquímicos, físico-químicos e de genética molecular. Na maioria dos casos, apenas uma interpretação combinada de todos os resultados obtidos permite determinar com precisão a forma da doença. Via de regra, a estratégia geral para o diagnóstico de doenças metabólicas hereditárias inclui várias etapas.

I - identificação de ligação defeituosa na via metabólica por meio de análise (quantitativa, semiquantitativa ou qualitativa) de metabólitos.
II - identificação de disfunção proteica através da determinação de sua quantidade e/ou atividade.
III - esclarecimento da natureza da mutação, ou seja, caracterização do alelo mutante em nível gênico.

Esta estratégia é utilizada não apenas para resolver problemas relacionados ao estudo dos mecanismos moleculares da patogênese das doenças metabólicas hereditárias e à identificação de correlações genofenotípicas, mas também é necessária principalmente para o diagnóstico prático das doenças metabólicas hereditárias.

A verificação do diagnóstico ao nível da proteína e do gene mutante é necessária tanto para o diagnóstico pré-natal, como para o aconselhamento médico e genético de famílias sobrecarregadas e, em alguns casos, para a prescrição de terapia adequada. Por exemplo, na deficiência de desidropteridina redutase, o fenótipo clínico e os níveis de fenilalanina serão indistinguíveis da forma clássica de fenilcetonúria, mas as abordagens para o tratamento destas doenças são fundamentalmente diferentes. A importância da diferenciação do locus das doenças metabólicas hereditárias para o aconselhamento genético médico pode ser ilustrada pelo exemplo da mucopolissacaridose tipo II (doença de Hunter). Com base no espectro de glicosaminoglicanos excretados, é impossível distinguir entre as mucopolissacaridoses tipos I, II e VII, mas destas doenças, apenas a doença de Hunter é herdada de forma recessiva ligada ao X, o que é de fundamental importância para o prognóstico da prole em uma família com histórico familiar. Quanto ao diagnóstico pré-natal, tendo dados sobre a forma da mucopolissacaridose (isso só pode ser determinado pelo estudo da atividade enzimática), é possível realizar o diagnóstico pré-natal já na 8-11ª semana de gestação, mas se a forma não for especificada, então apenas na 20ª semana. A prioridade dos métodos de genética molecular no estabelecimento do transporte heterozigoto, bem como no diagnóstico pré-natal de doenças em que a enzima mutante não é expressa nas células das vilosidades coriônicas, por exemplo, fenilcetonúria, algumas glicogenoses e defeitos em β- mitocondriais oxidação, é inquestionável.

IDENTIFICANDO UM LINK DEFEITUOSO NA VIA METABÓLICA
A análise de metabólitos é a etapa mais importante no diagnóstico de muitas doenças da classe das doenças metabólicas hereditárias. Em primeiro lugar, isto está relacionado com distúrbios no metabolismo intersticial de aminoácidos e ácidos orgânicos. Para a maioria destas doenças, a determinação quantitativa de metabólitos em fluidos biológicos permite um diagnóstico preciso. Para tanto, são utilizados métodos de análise química qualitativa, métodos espectrofotométricos para avaliação quantitativa de compostos, bem como diversos tipos de cromatografia (camada fina, líquido de alta eficiência, gás, espectrometria de massa em tandem). O material biológico para esses estudos geralmente são amostras de plasma ou soro e urina.

Para doenças metabólicas hereditárias, como distúrbios do metabolismo energético, metabolismo de carboidratos e aminoácidos, a análise de compostos comuns a muitas vias metabólicas (metabólitos principais) permite o diagnóstico diferencial de doenças e o planejamento de táticas de exame adicionais. Para muitos grupos de doenças metabólicas hereditárias, a análise semiquantitativa é utilizada para determinar a concentração de metabólitos. Às vezes, uma análise qualitativa é a primeira etapa de uma busca diagnóstica e permite suspeitar com alta confiança de uma determinada forma nosológica de uma doença ou de um grupo de doenças.

TESTES DE URINA QUALITATIVOS E SEMI-QUANTITATIVOS
Como muitas doenças metabólicas hereditárias envolvem o acúmulo de substratos de reações enzimáticas bloqueadas ou seus derivados, concentrações excessivas desses metabólitos podem ser detectadas por meio de testes químicos qualitativos. Esses testes são sensíveis, fáceis de usar, de baixo custo e não dão resultados falsos negativos, e as informações obtidas com sua utilização permitem suspeitar de doenças metabólicas hereditárias em um paciente com alto grau de probabilidade. Deve-se levar em conta que os resultados destes testes são influenciados por medicamentos, aditivos alimentares e seus metabólitos. Testes de análise qualitativa são usados ​​em programas de triagem seletiva.

Testes qualitativos
Cor e odor: leucinose, tirosinemia, acidemia isovalérica, fenilcetonúria, alcaptonúria, cistinúria, acidúria 3-hidroxi-3-metilglutárica.
Teste de Benedict (galactosemia, intolerância congênita à frutose, alcaptonúria). Também positivo para síndrome de Fanconi, diabetes mellitus, deficiência de lactase e uso de antibióticos.
Teste de cloreto férrico (fenilcetonúria, leucinose, hiperglicinemia, alcaptonúria, tirosinemia, histidinemia). Também positivo para cirrose hepática, pleocromacitoma, hiperbilirrubinemia, acidose láctica, cetoacidose, melanoma.
Teste de dinitrofenilhidrazina (fenilcetonúria, leucinose, hiperglicinemia, alcaptonúria). Também positivo para glicogenose, acidose láctica.
Teste de P-nitroanilina: acidúria metilmalônica.
Teste de sulfito: deficiência de cofator de molibdênio.
Teste do ácido homogentísico: alcaptonúria.
Teste de nitrozonaftol: tirosinemia. Também positivo para frutosemia e galactosemia.

METABÓLITOS CHAVE
Para muitos grupos de doenças metabólicas hereditárias, um passo importante no diagnóstico laboratorial diferencial é a medição da concentração de certos metabolitos em vários fluidos biológicos (sangue, plasma, líquido cefalorraquidiano e urina). Esses compostos incluem glicose, ácido láctico (lactato), ácido pirúvico (piruvato), amônio, corpos cetônicos b-hidroxibutirato e acetoacetato), ácido úrico. A concentração desses compostos muda em muitas doenças metabólicas hereditárias, e sua avaliação abrangente possibilita o desenvolvimento de algoritmos para posteriores diagnósticos laboratoriais.

Lactato e piruvato
As concentrações de lactato, piruvato e corpos cetônicos são os indicadores mais importantes de distúrbios do metabolismo energético. São conhecidas cerca de 25 formas nosológicas de doenças metabólicas hereditárias, nas quais se observa aumento do nível de lactato no sangue (acidose láctica).

A acidose láctica é uma condição na qual o nível de ácido láctico excede 2,1 mm. A acidose láctica primária pode estar associada à deficiência de piruvato desidrogenase (complexo piruvato desidrogenase), distúrbios da cadeia respiratória mitocondrial (a grande maioria das formas), gliconeogênese e metabolismo do glicogênio. A acidose láctica secundária é observada em algumas acidúrias orgânicas, distúrbios da β-oxidação mitocondrial e defeitos do ciclo da ureia. A concentração destes metabólitos depende em grande parte do estado fisiológico (antes ou depois de uma carga alimentar); os níveis de lactato também são influenciados pela atividade física e até mesmo pelo estresse associado ao procedimento de coleta de sangue, especialmente em crianças pequenas. Tudo isso deve ser levado em consideração na interpretação dos dados bioquímicos. A relação entre concentrações de lactato/piruvato no sangue é um importante critério diagnóstico diferencial. Bioquimicamente, esta proporção reflete a proporção entre as formas reduzidas e oxidadas de dinucleotídeos de nicotinamida no citoplasma - o chamado estado oxidativo do citoplasma.

Corpos cetônicos
Os corpos cetônicos são formados no fígado e sua principal fonte é a b-oxidação dos ácidos graxos. Eles são então transferidos para vários tecidos do corpo. A proporção de corpos cetônicos 3-hidroxibutirato/acetoacetato reflete o status redox das mitocôndrias, uma vez que sua proporção está associada exclusivamente ao pool mitocondrial de dinucleotídeos de nicotinamida. O b-hidroxibutirato é relativamente estável no plasma sanguíneo, ao contrário do acetoacetato, que se degrada rapidamente. Muitos defeitos de b-oxidação mitocondrial são caracterizados por baixos níveis de corpos cetônicos mesmo após jejum prolongado, o que está associado à depleção de acetil-CoA, o principal precursor dos corpos cetônicos. Nas doenças mitocondriais associadas a defeitos na cadeia respiratória mitocondrial, observa-se hipercetonemia paradoxal - o nível de corpos cetônicos após uma carga alimentar aumenta significativamente (normalmente, um aumento na concentração de corpos cetônicos é observado após jejum prolongado).

Amônio
Nas doenças metabólicas hereditárias que ocorrem como descompensação metabólica aguda, é importante determinar o nível de amônio no sangue. Um aumento significativo de amônio no sangue é observado em doenças metabólicas hereditárias causadas por distúrbios do ciclo da uréia e do metabolismo dos ácidos orgânicos. Com estas doenças, a concentração de amônio aumenta de 200 para 1000 mícrons. A hiperamonemia não é apenas uma importante característica diagnóstica diferencial, mas também requer medidas terapêuticas urgentes, uma vez que leva rapidamente a danos cerebrais graves. É importante diferenciar essa condição da hiperamonemia transitória do recém-nascido, que ocorre em recém-nascidos prematuros com indicadores de altura e peso elevados e sintomas clínicos de lesão pulmonar. O nível de amônio nesta condição não excede 200 mícrons. A concentração de amônio no sangue pode aumentar com lesões hepáticas graves. Valores normais de concentração de amônio no sangue: no período neonatal - menos de 110 mícrons, em crianças mais velhas - menos de 100 mícrons.

Glicose
Uma diminuição nos níveis de glicose no sangue pode ser observada em várias doenças metabólicas hereditárias. Em primeiro lugar, isto aplica-se a distúrbios do metabolismo do glicogénio e a defeitos na β-oxidação mitocondrial, nos quais a hipoglicemia pode ser a única alteração bioquímica detectada por testes laboratoriais padrão. A resposta fisiológica à diminuição dos níveis de glicose no sangue é a abolição da liberação de insulina, da produção de glucagon e de outros hormônios reguladores. Isso leva à formação de glicose a partir do glicogênio no fígado e à conversão de proteínas em glicose na cadeia de gliconeogênese. A lipólise também é ativada, o que leva à formação de glicerol e ácidos graxos livres. Os ácidos graxos são transportados para as mitocôndrias do fígado, onde são β-oxidados e os corpos cetônicos são formados, e o glicerol é convertido em glicose na cadeia da gliconeogênese. As crianças têm uma necessidade muito maior de glicose do que os adultos. Acredita-se que isso ocorra porque a proporção do tamanho do cérebro para o corpo é maior nas crianças e o cérebro é o principal consumidor de glicose.

Além disso, o cérebro adulto está mais adaptado ao uso de corpos cetônicos como fonte de energia do que o cérebro da criança. É por estas razões que as crianças são mais sensíveis às condições hipoglicêmicas do que os adultos. Nos casos de distúrbios do metabolismo do glicogênio, a hipoglicemia está associada à incapacidade de formar glicose a partir do glicogênio, por isso é mais pronunciada durante períodos de jejum prolongado.

A maioria das doenças do grupo de defeitos na b-oxidação mitocondrial também é acompanhada por uma diminuição nos níveis de glicose. Este grupo de doenças é uma das doenças metabólicas hereditárias mais comuns. A causa da hipoglicemia está associada à impossibilidade de aproveitamento das gorduras acumuladas durante o jejum e ao esgotamento do glicogênio acumulado, que passa a ser a única fonte de glicose e, consequentemente, de energia metabólica. A hipoglicemia devido a defeitos na b-oxidação mitocondrial, diferentemente da glicogenose, não é acompanhada de hipercetonemia. A hipoglicemia também pode ocorrer com galactosemia tipo I, intolerância hereditária à frutose e deficiência de frutose-1,6-bifosfatase.

Acidose metabólica
A acidose metabólica é uma das complicações comuns de doenças infecciosas, hipóxia grave, desidratação e intoxicação. As doenças metabólicas hereditárias que se manifestam na primeira infância também são frequentemente acompanhadas de acidose metabólica com deficiência de bases.

O critério mais importante no diagnóstico diferencial da acidose metabólica é o nível de corpos cetônicos no sangue e na urina, bem como a concentração de glicose. Se a acidose metabólica for acompanhada de cetonúria, isso indica distúrbios no metabolismo do piruvato, aminoácidos ramificados e distúrbios no metabolismo do glicogênio. Defeitos na β-oxidação mitocondrial, cetogênese e alguns distúrbios da gliconeogênese não são acompanhados por um aumento no nível de corpos cetônicos no sangue e na urina. As doenças metabólicas hereditárias mais comuns que ocorrem com acidose metabólica grave são acidemia propiônica, metilmalônica e isovalérica. Distúrbios do metabolismo do piruvato e da cadeia respiratória mitocondrial, manifestando-se em idade precoce, geralmente levam a acidose metabólica grave.

Ácido úrico
O ácido úrico é o produto final do metabolismo das purinas. As bases purinas - adenina, guanina, hipoxantina e xantina - são oxidadas em ácido úrico. O ácido úrico é sintetizado principalmente no fígado; não está ligado às proteínas da corrente sanguínea, por isso quase todo ele é filtrado nos rins. Um aumento na concentração de ácido úrico na urina está estritamente correlacionado com um aumento no seu nível no plasma sanguíneo.

O aumento da produção e excreção de ácido úrico (hiperuricemia e hiperuricosúria) surge como resultado de hiperatividade (um fenômeno único entre as doenças metabólicas hereditárias) ou deficiência de enzimas envolvidas na síntese de novo de purinas, poupando vias de seu metabolismo, ou devido a distúrbios em a formação de monofosfato de inosina a partir de monofosfato de adenosina no ciclo de nucleotídeos de purina. A hiperuricemia secundária também é observada na intolerância hereditária à frutose, deficiência de frutose-1,6-defosfatase, glicogenose tipos I, III, V, VII e deficiência de acetil-CoA desidrogenase de cadeia média de ácidos graxos.

ANÁLISE DE METABÓLITOS USANDO MÉTODOS ESPECIAIS DE ANÁLISE QUANTITATIVA
Os métodos cromatográficos de análise desempenham um papel vital no diagnóstico de doenças metabólicas hereditárias. O moderno arsenal de tecnologias cromatográficas é extremamente amplo, o que permite separar de forma eficaz e informativa misturas complexas e multicomponentes, que incluem material biológico. Para a análise quantitativa de metabólitos em doenças metabólicas hereditárias, métodos cromatográficos como cromatografia gasosa e líquida de alta eficiência, cromatografia gasosa-espectrometria de massa são utilizados com sucesso. A cromatografia gasosa e a cromatografia gasosa de alta eficiência são os métodos mais versáteis para separar misturas complexas de compostos e são caracterizados por alta sensibilidade e reprodutibilidade. Em ambos os casos, a separação ocorre como resultado de diferentes interações dos componentes da mistura com as fases estacionária e móvel da coluna cromatográfica. Para cromatografia gasosa, a fase móvel é um transportador de gás; para cromatografia gasosa de alta eficiência, é um líquido (eluente). A saída de cada composto é registrada pelo detector do dispositivo, cujo sinal é convertido em picos no cromatograma. Cada pico é caracterizado por um tempo e área de retenção. Ressalta-se que a cromatografia gasosa geralmente é realizada em altas temperaturas, portanto uma limitação para seu uso é a instabilidade térmica dos compostos. Para a cromatografia gasosa de alta eficiência não existem tais restrições, pois neste caso a análise é realizada em condições amenas. A espectrometria de cromatomassa é um sistema combinado de cromatografia gasosa ou cromatografia gasosa de alta eficiência com detector seletivo de massa, que permite obter informações não apenas quantitativas, mas também qualitativas, ou seja, a estrutura dos compostos na mistura analisada é determinada adicionalmente.

Ácidos orgânicos
Na genética bioquímica, o termo “ácidos orgânicos” refere-se a ácidos carboxílicos pequenos (peso molecular inferior a 300 kDa) solúveis em água que são produtos intermediários ou finais do metabolismo de aminoácidos, carboidratos, lipídios e aminas biogênicas.

Para determinar ácidos orgânicos, são utilizados vários métodos cromatográficos: cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia gasosa-espectrometria de massa e cromatografia gasosa de alta eficiência seguida de espectrometria de massa tandem. Mais de 250 diferentes ácidos orgânicos e conjugados de glicina podem ser detectados em uma amostra de urina. Sua concentração depende da dieta, dos medicamentos e de algumas outras razões fisiológicas. São conhecidas cerca de 65 doenças metabólicas hereditárias, caracterizadas por um perfil específico de ácidos orgânicos. Quantidades relativamente pequenas de ácidos orgânicos são altamente específicas; sua presença em altas concentrações na urina permite estabelecer o diagnóstico com precisão: succinilacetona para tirosinemia tipo I, N-acetilaspartato para doença de Canavan, ácido mevalônico para acidúria mevalônica. Na grande maioria dos casos, o diagnóstico de doenças metabólicas hereditárias baseado apenas na análise de ácidos orgânicos na urina é bastante difícil de estabelecer, sendo necessários diagnósticos confirmatórios adicionais.

A interpretação dos resultados da análise de ácidos orgânicos na urina apresenta alguns problemas, tanto devido ao grande número de ácidos excretados e seus derivados, como devido à sobreposição nos perfis de alguns metabólitos de drogas. Para um diagnóstico preciso, os dados obtidos na análise dos ácidos orgânicos devem estar correlacionados com as características clínicas da doença e ser confirmados pelos resultados de outros métodos laboratoriais de análise (análise de aminoácidos, lactato, piruvato, acilcarnitinas no sangue, atividade enzimática e dados genéticos moleculares).

A concentração de ácidos orgânicos nas doenças metabólicas hereditárias é caracterizada por uma faixa bastante ampla - desde um aumento em seu nível em várias centenas de vezes até um ligeiro excesso próximo do normal. Por exemplo, na acidúria glutárica tipo I, os níveis de ácido glutárico podem estar dentro dos limites normais em alguns pacientes; em caso de deficiência de acetil-CoA desidrogenase de cadeia média de ácidos graxos, a concentração de ácidos adípico, sebácico e subérico pode estar dentro dos limites normais. A detecção de um perfil anormal de ácidos orgânicos na urina às vezes só é possível em pacientes no estágio de descompensação metabólica. Isto é especialmente verdadeiro para formas benignas e leves de doenças, que, via de regra, se manifestam tardiamente.

Aminoácidos e acilcarnitinas
A concentração de aminoácidos e acilcarnitinas é determinada por espectrometria de massa em tandem. A espectrometria de massa é um método analítico que pode fornecer informações qualitativas (estrutura) e quantitativas (peso molecular ou concentração) sobre as moléculas analisadas após terem sido convertidas em íons. Uma diferença significativa entre a espectrometria de massa e outros métodos físico-químicos analíticos é que a massa das moléculas e seus fragmentos é determinada diretamente em um espectrômetro de massa. Os resultados são apresentados graficamente (o chamado espectro de massa). Às vezes é impossível analisar misturas complexas e multicomponentes de moléculas sem primeiro separá-las. As moléculas podem ser separadas cromatograficamente ou usando dois espectrômetros de massa conectados em série - espectrometria de massa em tandem. O método de espectrometria de massa em tandem foi usado pela primeira vez na década de 70. século passado e encontrou aplicação em química, biologia e medicina. Este método é usado para determinar a estrutura de substâncias desconhecidas, bem como para analisar misturas complexas com purificação mínima da amostra.

Antes da análise espectrométrica de massa, é necessário converter partículas neutras de uma substância em íons carregados, bem como transferi-las do estado líquido para o gasoso. Para tanto, foi utilizado pela primeira vez o método de ionização por bombardeio com átomos rápidos, recentemente deu-se preferência ao método de ionização por eletrospray. Com o advento de novos métodos de ionização, a aplicação da espectrometria de massa em tandem no campo da bioquímica analítica tornou-se mais acessível. A primeira análise de acilcarnitinas por espectrometria de massa em tandem foi realizada por David Millington et al., que utilizou derivatização química de amostras biológicas para formar ésteres butílicos de acilcarnitina. Em 1993, Donald Chase et al. adaptaram este método para a análise de aminoácidos em manchas de sangue seco, formando assim a base para a triagem de múltiplos componentes em doenças metabólicas hereditárias. O método foi posteriormente adaptado para análises em larga escala necessárias para a triagem neonatal.

A análise por espectrometria de massa em tandem é mais eficaz para compostos que possuem íons filhos semelhantes ou moléculas neutras, como a análise de aminoácidos e acilcarnitinas. Também é necessário destacar a possibilidade de análise MS/MS de vários grupos químicos em uma única análise em um tempo muito curto (~2 min). Isto proporciona uma ampla gama de ensaios e alto rendimento, o que é rentável para o rastreio de um grande número de doenças. Com base no aumento da concentração de certas acilcarnitinas, doenças do grupo dos distúrbios da β-oxidação mitocondrial podem ser suspeitadas por alterações no perfil de aminoácidos - aminoacidopatia. Usando espectrometria de massa em tandem, é possível detectar metabólitos estranhos de ácidos biliares que aparecem em distúrbios do metabolismo do colesterol e lipídios, ácidos biliares, bem como em defeitos na biogênese do peroxissomo. Para vários distúrbios hepatobiliares colestáticos (doença hepática crônica de etiologia desconhecida, síndrome de Zellweger, deficiência de proteína bifuncional peroxissomal, tirosinemia tipo I, atresia biliar, colestase intra-hepática familiar progressiva de tipo indeterminado), a espectrometria de massa em tandem pode determinar as concentrações de ácidos biliares conjugados em vários fluidos biológicos.

São descritos métodos para a determinação de ácidos graxos de cadeia muito longa: eicosanóico (C20:0), docosanóico (C22:0), tetracosanóico (C24:0), hexacosanóico (C26:0), bem como ácidos fitânico e pristânico usando espectrometria de massa em tandem em plasma e manchas de sangue, potencialmente útil para triagem de muitas doenças peroxissomais.

O diagnóstico de distúrbios do metabolismo das purinas e pirimidinas (deficiência de purina nucleosídeo fosforilase, ornitina transcarbamilase, cofator de molibdênio, adenilosuccinase, desidropirimidina desidrogenase) é baseado na presença de metabólitos anormais ou na ausência de metabólitos normais no soro, urina ou células sanguíneas. Assim, foram desenvolvidos métodos rápidos de espectrometria de massa em tandem que permitem quantificar de 17 a 24 purinas e pirimidinas na urina em uma análise.

A espectrometria de massa em tandem também pode ser usada para estudar outras classes de metabólitos. Assim, um novo método de espectrometria de massa em tandem foi desenvolvido para medir a hexose monofosfato total em manchas de sangue, um marcador de galactose-1-fosfato, que pode ser usado na triagem de galactosemia.

A determinação de catecolaminas na urina é importante para o diagnóstico de distúrbios do metabolismo de catecolaminas e neurotransmissores. Desvantagens significativas dos métodos existentes são o longo tempo de análise e a possível interferência de medicamentos e seus metabólitos, que são estruturalmente semelhantes às catecolaminas. Novos métodos em combinação com o preparo de amostras específicas para compostos contendo grupos catecol permitem diagnosticar rapidamente esse grupo de doenças, eliminando as desvantagens dos métodos de HPLC.

Pesquisa de proteínas
A grande maioria das doenças metabólicas hereditárias é causada por atividade enzimática prejudicada, portanto, no diagnóstico dessas doenças, identificar uma diminuição na atividade de enzimas específicas é o mais importante e, às vezes, o único método confiável para confirmar o diagnóstico.

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMA
Atualmente, o diagnóstico pós e pré-natal de muitas doenças metabólicas hereditárias (principalmente isso se aplica a doenças de armazenamento lisossômico) é realizado usando métodos de análise da atividade enzimática. O material para medir a atividade enzimática em doenças metabólicas hereditárias são principalmente os leucócitos do sangue periférico: em quase todas as doenças de armazenamento lisossômico, acidúria metilmalônica e algumas glicogenoses. Para diagnosticar gangliosidose GM2 e deficiência de biotinidase, utiliza-se plasma ou soro. Em alguns casos, os objetos de estudo são tecidos musculares ou hepáticos, ou uma cultura de fibroblastos cutâneos.

Os substratos para enzimas podem ser cromogênicos, fluorogênicos ou conter um marcador radioativo. Para medir a atividade enzimática, são utilizados métodos de medição espectrofotométrica, fluorométrica e de radioatividade. O princípio geral do uso de substratos fluorogênicos é que o substrato é um derivado químico de um fluorocromo, incapaz de fluorescência em seu estado original, mas sob a ação de moléculas de enzima apropriadas, o substrato é clivado cataliticamente para liberar um fluorocromo, a fluorescência dos quais podem ser medidos. Os métodos espectrofotométricos permitem medir a absorção dos produtos da reação enzimática obtidos após a adição de substratos cromogênicos. Para muitas enzimas (por exemplo, desidrogenases), os produtos de reação resultantes podem ser cromogênicos. Existem muitos substratos fluorogênicos para o estudo de várias enzimas: esterases de diferentes especificidades, peroxidases, peptidases, fosfatases, sulfatases, lipases, etc. Substratos marcados radioativamente são usados ​​​​no diagnóstico de acidúrias orgânicas, defeitos na β-oxidação mitocondrial, distúrbios do metabolismo de carboidratos e doenças de armazenamento lisossômico.

Cada reação enzimática requer certas condições: pH e composição da mistura tampão, substrato(s) específico(s), presença de ativadores e cofatores, condições de temperatura, etc. Quase cada célula contém seu próprio conjunto de enzimas, portanto sua distribuição nos tecidos varia significativamente. . Muitas enzimas estão presentes nos tecidos em diversas formas (isoenzimas). Na maioria dos casos, isso se deve à presença de subunidades polipeptídicas que, quando combinadas, formam diferentes isoenzimas. A distribuição das isoenzimas pode variar de tecido para tecido. Algumas enzimas são encontradas apenas em um órgão ou tecido específico.

Doenças de depósito lisossômico
O teste de atividade enzimática é o padrão ouro para o diagnóstico confirmatório de doenças de armazenamento lisossômico. Substratos cromogênicos e fluorogênicos são usados ​​para analisar a atividade enzimática. Substratos fluorogênicos à base de 4-metilumberifelona são sempre muito sensíveis; com a ajuda deles é possível determinar a atividade de enzimas mesmo em microquantidades de material biológico (manchas de sangue seco). Como regra, a atividade enzimática em pacientes com doenças de depósito lisossômico é inferior a 10% do normal, e os testes bioquímicos não apresentam dificuldades significativas para fazer um diagnóstico preciso. Existem vários fatores que dificultam a interpretação dos estudos bioquímicos. Um deles é a presença de alelos de “pseudoinsuficiência”, que levam a alterações na estrutura da enzima e não permitem que a proteína quebre adequadamente um substrato artificial in vitro, enquanto com um substrato natural esta enzima não apresenta uma diminuição na atividade. Este fenômeno foi descrito para arilsulfatase A, p-galactosidase, p-glucuronidase, a-iduronidase, a-galactosidase e galactocerebrosidase.

Estudo de genes mutantes
O desenvolvimento de métodos de biologia molecular foi uma verdadeira revolução no campo da bioquímica clínica. O desenvolvimento de protocolos padrão para pesquisa molecular e automação dos métodos utilizados atualmente é um conjunto completo de abordagens diagnósticas que podem se tornar um procedimento de rotina em laboratórios clínicos. O rápido desenvolvimento da pesquisa no campo da decifração do genoma humano e da determinação da sequência de DNA dos genes torna possível o diagnóstico de DNA de várias doenças hereditárias. Métodos de diagnóstico de DNA, análise da estrutura de genes normais e seus análogos mutantes em doenças metabólicas hereditárias começaram a ser utilizados na última década.

Para diagnóstico de DNA de doenças hereditárias, são utilizadas duas abordagens principais - diagnóstico de DNA direto e indireto. O diagnóstico direto de DNA é um estudo da estrutura primária de um gene danificado e a identificação de mutações que levam à doença. Para detectar danos moleculares em genes que causam doenças hereditárias, é utilizado um arsenal padrão de métodos de biologia molecular. Dependendo das características e tipos de mutações, prevalência em diversas doenças hereditárias, certos métodos são mais preferíveis.

Para o diagnóstico de doenças metabólicas hereditárias, nos casos em que o defeito bioquímico é conhecido com precisão e determinado de forma fácil e confiável por meio de técnicas bioquímicas, é improvável que os métodos de DNA tenham prioridade. Nestes casos, o uso da análise de DNA é mais uma abordagem de pesquisa do que diagnóstica. Após um diagnóstico estabelecido com precisão, os métodos de análise de DNA serão úteis para posterior diagnóstico pré-natal, identificação de portadores heterozigotos na família e prognóstico da doença em homozigotos, bem como para seleção de pacientes para fins de terapia casual no futuro ( substituição enzimática e terapia genética). Além disso, nos casos em que o defeito bioquímico não é conhecido com precisão, o diagnóstico bioquímico é difícil, não é suficientemente confiável ou requer métodos de pesquisa invasivos, o método de diagnóstico do DNA é o único e insubstituível para um diagnóstico preciso.

Em geral, as táticas de diagnóstico de doenças metabólicas hereditárias em cada caso específico devem ser planejadas em conjunto com um bioquímico e um geneticista. As condições necessárias para um diagnóstico rápido e bem-sucedido são a compreensão da etiologia, dos mecanismos de patogênese da doença e do conhecimento de marcadores bioquímicos específicos.

Controle de qualidade laboratorial
Um dos componentes mais importantes de qualquer diagnóstico laboratorial é o constante controle de qualidade dos estudos realizados. Numa área tão complexa e multifacetada como as doenças metabólicas hereditárias, o controlo de qualidade externo e interno adquire particular importância. Isso se deve ao fato de o laboratório lidar com doenças raras e, via de regra, não ser possível ganhar experiência no diagnóstico de cada doença em quantidade suficiente. Além disso, o equipamento laboratorial e as abordagens metodológicas podem variar entre laboratórios.

Genética Entrevista com um especialista

Ekaterina Zakharova: “Para evitar consequências incapacitantes graves, é necessário um diagnóstico precoce”

“Todos nós apoiamos os nossos antepassados” - este ditado aplica-se não só às tradições familiares, à mentalidade, à educação, mas também à saúde. As crianças carregam a informação genética das gerações anteriores. Infelizmente, às vezes há uma ruptura nesta “cadeia”. O que causa essa falha? Como e quais doenças são herdadas e é possível prever e prevenir antecipadamente o seu desenvolvimento? Conversamos sobre isso e muito mais com o chefe do laboratório de doenças metabólicas hereditárias do Centro de Pesquisa Genética Médica, Presidente do Conselho da Sociedade Russa de Doenças Raras (Órfãs) (OMS), Doutor em Ciências Médicas Ekaterina Yuryevna Zakharova.

— Diga-nos, o que faz o seu laboratório?
— Nosso laboratório é uma subdivisão estrutural do Centro de Pesquisa em Genética Médica. Estamos engajados em diagnósticos metabólicos. Este é um grupo bastante grande de patologias, incluindo 500-600 doenças. Esses distúrbios surgem como resultado de mutações genéticas que causam uma mudança significativa no metabolismo, portanto, para diagnosticá-los, juntamente com métodos de genética molecular, são utilizados testes bioquímicos: vários estudos de metabólitos, atividade enzimática.

Em geral, foram desenvolvidas abordagens de tratamento para 20-30 doenças metabólicas hereditárias, incluindo galactosemia, leucinose (doença do xarope de bordo), tirosinemia, acidúria orgânica e outras.

— Se bem entendi, a maioria das doenças hereditárias são incuráveis?
— Para curar qualquer doença, sua causa deve ser completamente eliminada. Numa doença hereditária, é uma mutação. O único método que pode eliminá-lo é a terapia genética. No entanto, apesar das grandes esperanças depositadas na terapia genética, este método ainda não produziu efeitos significativos. Até o momento, existem apenas alguns protocolos oficialmente aprovados para . A peculiaridade das doenças metabólicas hereditárias é que algumas dessas doenças podem ser tratadas com bastante sucesso, e para muitas delas já existem métodos eficazes de tratamento e correção, incluindo dietoterapia e nutrição médica especial, que repõem a enzima que falta no corpo humano. .

Em geral, foram desenvolvidas abordagens de tratamento para 20-30 doenças metabólicas hereditárias, incluindo galactosemia, leucinose (doença do xarope de bordo), tirosinemia, acidúria orgânica e outras. A terapia de reposição enzimática é usada para a doença de Gaucher, mucopolissacaridoses, doença de Pompe, doença de Fabry e regimes de tratamento estão sendo desenvolvidos atualmente para uma série de outras doenças deste grupo.

“Apesar das grandes esperanças depositadas na terapia genética, este método ainda não produziu efeitos significativos.”

- Por exemplo?
— Um exemplo clássico é a fenilcetonúria, na qual o corpo carece de uma determinada enzima que pode quebrar e metabolizar moléculas complexas na célula. Nesse caso, o tratamento consiste na adesão vitalícia a uma determinada dieta, limitando uma série de produtos que contenham proteína animal. O mais importante é iniciar a dietoterapia na hora certa. Se uma criança começar a receber fórmulas especializadas nos primeiros dias após o nascimento, no futuro ela praticamente não será diferente de seus pares saudáveis. Se isso não acontecer, ele inevitavelmente desenvolverá graves danos ao sistema nervoso central, comprometimento do desenvolvimento mental e até demência.

Para evitar consequências incapacitantes graves, é necessário diagnosticar a doença o mais cedo possível. O método mais promissor para a detecção precoce de doenças hereditárias é a triagem neonatal. Inicialmente, em nosso país, 2 doenças foram incluídas no programa de triagem neonatal: o hipotireoidismo congênito. Desde 2006, foram acrescentadas mais 3 doenças hereditárias: galactosemia e síndrome adrenogenital.

— Por que você escolheu essas doenças em particular? Tanto quanto sei, nos EUA, por exemplo, o rastreio neonatal inclui testes para 50 doenças hereditárias.
- Há várias razões para isso. Em primeiro lugar, é preciso compreender que o rastreio não é apenas um exame para determinar uma determinada doença. Trata-se de todo um sistema de medidas que inclui, além da testagem, o aconselhamento familiar, o tratamento da criança doente, o acompanhamento constante da mesma, etc. Vamos supor que a doença tenha sido identificada. Como tratar uma criança se o medicamento ou nutrição especializada de que necessita não está registrado na Rússia e só pode ser adquirido no exterior, se não houver especialistas com experiência no atendimento desses pacientes? Estas são questões muito complexas que precisam ser abordadas de forma abrangente e gradual.

Inicialmente, em nosso país, 2 doenças foram incluídas no programa de triagem neonatal: fenilcetonúria e hipotireoidismo congênito. Desde 2006, foram acrescentadas mais 3 doenças hereditárias: galactosemia, fibrose cística e síndrome adrenogenital.

Outro problema sério é financeiro. Hoje, o programa de triagem neonatal é financiado pelo orçamento federal, mas a partir de 2015 está previsto para ser transferido para as regiões. Esta situação causa grande preocupação entre os especialistas. A triagem neonatal deve abranger mais de 95% dos recém-nascidos, ser contínua e estar sob constante controle estatal. Somente neste caso será eficaz. E se alguma região decidir subitamente que não tem dinheiro para o rastreio? Então todo o sistema entrará simplesmente em colapso, e isso não deve, em circunstância alguma, acontecer. E a saúde das crianças está em jogo. Especialistas acreditam que seria mais lógico manter o programa do governo federal.

E, claro, o rastreio de doenças hereditárias deve ser alargado, seguindo as melhores práticas globais. Os primeiros passos nessa direção já estão sendo dados. Em duas regiões russas - Moscovo e região de Sverdlovsk - foram lançados projectos-piloto para alargar o rastreio neonatal para 30 doenças hereditárias.

“Antes de mais nada, é preciso entender que o rastreamento não é apenas um exame para determinar uma determinada doença. Este é todo um sistema de eventos"

— É possível saber antecipadamente que uma pessoa tem predisposição para uma determinada doença genética?
- Existe esse método - sequenciamento genômico. Com sua ajuda, o genoma de cada pessoa. Até agora, este é um prazer bastante caro - o seu custo ronda os 10.000 euros. Acredita-se que num futuro próximo o preço deste procedimento diminuirá dez vezes. Parece que fiz a análise e tudo se sabe. Contudo, aqui entramos no campo da ética médica e das decisões relacionadas. Posso dizer uma coisa: o conhecimento científico moderno não é suficiente para dar uma resposta inequívoca sobre como certas mudanças podem afetar a qualidade e a duração da vida de uma pessoa, e se as mutações genéticas existentes levarão ao desenvolvimento da doença nesta pessoa em particular.

Aqui surge outra questão: quão necessário é tal conhecimento para uma pessoa? Por exemplo, existe uma doença hereditária tão grave - a coreia de Huntington, que se baseia em distúrbios neurológicos que se manifestam como movimentos involuntários e desregulados, tiques nervosos e espasmos. Então ocorrem mudanças intelectuais e, em pouco tempo, a pessoa se transforma em uma pessoa gravemente deficiente. Isso geralmente acontece após 30 anos. Ainda não é possível curar esta doença, mas é bem possível determinar a probabilidade de uma determinada pessoa desenvolver a doença se um de seus parentes (mãe ou pai) estiver doente por meio de testes. Contudo, algumas pessoas, conscientes do risco potencial, recusam o diagnóstico. Foi exactamente isso que fizeram duas irmãs, fundadoras da Fundação Coreia de Huntington. Tendo realizado um enorme trabalho de recolha de informação, criação de um banco de biomateriais e financiamento de investigação científica para encontrar o gene responsável pela doença, eles próprios não ousaram submeter-se a testes. Foi sua escolha consciente. Às vezes, uma pessoa simplesmente não quer saber o que a espera no futuro se não puder mudar nada.

— Um dos assuntos mais polêmicos discutidos pelos geneticistas do ponto de vista ético é a modelagem embrionária, na qual os pais poderão escolher a aparência, o caráter e as habilidades do feto. Quão realistas são essas previsões futurísticas?
“Com o desenvolvimento da ciência, eles parecem bastante reais, mas se vale a pena fazer isso é uma questão muito difícil. Por exemplo, na China não existem proibições que regulem os testes genéticos. Como sabem, até recentemente, as famílias chinesas só podiam ter um filho. Naturalmente, muitos pais escolheram meninos. Hoje, estas crianças cresceram e a sociedade enfrenta um grave problema relacionado com um grave desequilíbrio de género: para cada rapariga há sete rapazes. Como resultado, muitos jovens simplesmente não conseguem encontrar um parceiro.

Não há proibições que regulamentem os testes genéticos na China. Como sabem, até recentemente, as famílias chinesas só podiam ter um filho.

Hoje, os países da UE adotaram uma série de documentos que regulamentam os testes genéticos. Eles afirmam claramente o que pode e o que não pode ser feito. Em particular, os embriões não podem ser selecionados com base numa característica específica (cor dos olhos, sexo, etc.). Além disso, nos países europeus é proibido testar crianças para uma doença que é a priori considerada incurável. Se a família já tiver um filho doente, é proibido testar o segundo filho enquanto ele for pequeno. Isso é feito por razões morais e éticas - há uma grande probabilidade de que os pais se concentrem no filho doente ou, inversamente, dediquem todas as suas forças ao filho saudável, e os direitos do segundo sejam infringidos.

“Nos países europeus é proibido testar crianças para uma doença que é a priori considerada incurável”

Recentemente, em um dos canais de televisão britânicos, um programa discutiu a seleção de doadores para transplante de medula óssea. Em um transplante alogênico (isto é, não aparentado), a medula óssea do doador dada ao paciente deve corresponder geneticamente à do próprio paciente, tanto quanto possível. Infelizmente, nem sempre é possível encontrar tal doador. E então os pais recorrem aos geneticistas para que a mãe possa “plantar” um feto que seja adequado como doador para essa criança doente. O que fazer neste caso? Por um lado, os pais querem salvar a vida dos filhos. Nesse caso, o bebê que nasce não vai sofrer - será tirado o sangue do cordão umbilical e pronto. Por outro lado, para que ele nasça exatamente assim, vários embriões fecundados terão que ser destruídos durante o processo de seleção. Como tratar o nascimento de um filho que deveria se tornar doador, o que acontecerá com seu psiquismo quando ele souber disso? Voltando à sua pergunta. A genética ainda é uma ciência muito jovem e hoje não sabemos como poderá resultar esta ou aquela intrusão nesta delicada esfera.

Cada um de nós é portador de um certo número de diferentes mutações “prejudiciais” - de 20 a 50, de acordo com várias fontes.

— Em outras palavras, qualquer intrusão nos processos naturais está repleta de consequências imprevisíveis?
— Existem muitos exemplos na história da humanidade em que tais experimentos terminaram em completo fracasso. Mas se na Alemanha as experiências eugénicas pararam imediatamente após o fim da guerra, então na Suécia e noutros países escandinavos as mudanças correspondentes na legislação foram feitas apenas em meados da década de 1970. Em particular, nestes países, programas de esterilização para pessoas “inferiores” ( pacientes com doenças mentais, alcoólatras, viciados em drogas) eram amplamente praticados). Acreditava-se que a esterilização forçada reduziria o número de pessoas com determinadas características na população. Mas nada disso aconteceu.

- Por que?
“Esta atividade baseava-se numa falsa premissa sobre o papel determinante de um fator hereditário. Na verdade, isso está longe de ser o caso. Muitas doenças são poligênicas (multifatoriais), ou seja, muitos genes são responsáveis ​​pelo seu desenvolvimento, e o ambiente externo também influencia. Além disso, as mutações reaparecem e, numa população, de acordo com as leis da genética, a frequência de portadores de mutações é bastante constante. Cada um de nós é portador de um certo número de diferentes mutações “prejudiciais” - de 20 a 50, de acordo com várias fontes. E, provavelmente, do ponto de vista evolutivo, isso é necessário para alguma coisa.

Assim, já na década de 30 do século passado, levantou-se a hipótese de que uma doença hereditária tão grave como, quando aprendem a tratá-la, pode revelar-se um sinal muito útil: o aumento do sangramento na juventude será compensado pelo ausência de formação de trombose em idosos. Sabe-se também que os portadores de outra doença hereditária – a anemia falciforme – são resistentes à malária. Assim, o genótipo não existe por si só, e alguma característica avaliada como “prejudicial” em um ambiente pode ser bastante benéfica em outro.

A natureza está constantemente tentando diferentes combinações genéticas. Devemos sempre lembrar que quando uma pessoa começa a restringir artificialmente a diversidade genética existente, isso pode trazer sérias consequências negativas no futuro.

“Acreditava-se que a esterilização forçada reduziria o número de pessoas com determinadas características na população. Mas nada disso aconteceu"

— O mesmo se aplica aos casamentos entre parentes? Além disso, como se sabe, certas doenças genéticas são características de nacionalidades e grupos étnicos específicos. O grupo relacionado mais famoso nesse sentido são os judeus Ashkenazi...
— Pessoas próximas têm maior probabilidade de serem portadoras dos mesmos alelos e, consequentemente, quando se casam entre parentes, o risco de os seus filhos desenvolverem doenças hereditárias é bastante elevado. Quanto aos grupos étnicos, diferentes populações possuem características genéticas próprias. Por exemplo, a osteopetrose é muito mais comum entre os Chuvash do que em outras populações, a fenilcetonúria e a fibrose cística são comuns entre os russos e uma forma especial de epilepsia é comum entre os finlandeses.

Tais características podem surgir em povos que experimentaram um declínio acentuado nos números e, em seguida, no crescimento. Foi exatamente o que aconteceu com os judeus Ashkenazi, entre os quais existe uma elevada frequência de portadores de certas doenças genéticas. Uma das mais comuns é a doença de Tay-Sachs. Na população em geral ocorre na proporção de 1 em 100 mil recém-nascidos, e nos judeus Ashkenazi é de 1 em 3 mil.Hoje, em Israel, são realizados testes obrigatórios para o transporte desta doença. E essa abordagem se justifica: no ano passado, apenas uma criança com doença de Tay-Sachs nasceu no país. E esta foi uma decisão consciente dos pais, tomada por motivos religiosos. Conhecendo as características de uma determinada população, os geneticistas podem desenvolver programas de triagem neonatal em massa, testes de portadores e assim por diante.

— Quem vem com mais frequência ao seu centro médico genético?
— Em primeiro lugar, pais com filhos suspeitos de terem uma ou outra doença hereditária. Também realizamos diagnósticos pré-natais para detectar patologias em um estágio inicial do desenvolvimento intrauterino. Pessoas que têm parentes com doenças hereditárias também nos procuram para excluí-los de si mesmas.

— Testar não é barato. O estado apoia de alguma forma o centro neste aspecto?
“Hoje, nem todos podem pagar por essas pesquisas. Infelizmente, testes genéticos complexos não estão actualmente incluídos em nenhum sistema de garantia estatal. Algumas doenças são testadas como parte da investigação científica, mas isto é uma gota no oceano. É certamente necessário resolver estas questões. Afinal, quanto mais cedo for feito o diagnóstico, maiores serão as chances de ajudar uma pessoa, melhorar sua qualidade de vida e, às vezes, simplesmente salvá-la.

— O diagnóstico é seguido de tratamento e não está disponível para todas as pessoas com doenças raras (ou “órfãs”, como também são chamadas). Tudo novamente se resume às finanças.
- Infelizmente. Às vezes, uma pessoa vai ao médico durante anos para obter um diagnóstico. Nos últimos anos, esse termo apareceu até - “odisseia diagnóstica”. E finalmente, o diagnóstico fica claro. E aqui começam novas provações: existe tratamento para essa doença, mas o próprio paciente não pode pagar - é muito caro, e obtê-lo de graça também não é imediato e nem sempre possível.

“Infelizmente, testes genéticos complexos não estão atualmente incluídos em nenhum dos sistemas de garantia do Estado”

— Recentemente, o tema das doenças raras tem sido notícia. Desde 2014, estava prevista a transferência de financiamento do programa “7 nosologias” para as regiões; sob pressão pública, esta decisão foi adiada por um ano. Além disso, há também uma lista especial que inclui 24 doenças raras potencialmente fatais...
- Sim. O estado está, de uma forma ou de outra, tentando encontrar formas de proporcionar acesso à terapia para pacientes com doenças raras. Hoje, o fardo recai inteiramente sobre os ombros das regiões, e estas não conseguem fazer face a esse fardo.

Para abordar eficazmente as questões de fornecimento de medicamentos e terapia nutricional aos pacientes com doenças raras, é necessário manter um certo equilíbrio entre os orçamentos federal e regional. Encontrá-lo é difícil, mas possível. Por exemplo, segundo estimativas de especialistas, tendo em conta diferentes nosologias, a chamada “lista das 24” inclui muito mais doenças, cerca de 58. Metade delas são tratadas com dietoterapia. Em comparação com os medicamentos, as misturas especializadas são relativamente baratas e as regiões podem facilmente suportar este encargo financeiro. Além disso, muitas vezes é necessário adquirir alimentos terapêuticos numa base de emergência, a fim de garantir que os pacientes jovens recentemente identificados como resultado do rastreio neonatal sejam fornecidos, o que por vezes é mais fácil para a região. Quanto às outras doenças raras, é mais lógico incluí-las no programa “7 nosologias”, porque inicialmente este programa foi criado especificamente para o tratamento.

Por exemplo, segundo estimativas de especialistas, tendo em conta diferentes nosologias, a chamada “lista das 24” inclui cerca de 58 doenças.

“E aqui as organizações públicas de pacientes devem ter uma palavra a dizer.
— É claro que os pacientes com doenças raras deveriam ter acesso ao tratamento. E a nossa tarefa como organização pública é ajudá-los a conquistar esse direito à vida. Atualmente, assistimos a tendências positivas na tomada de decisões: o público está a ser ouvido e é dada mais atenção aos problemas das pessoas com doenças raras. Foi criado um Conselho para a Protecção dos Direitos dos Pacientes, no âmbito do Ministério da Saúde da Federação Russa, e conselhos semelhantes foram organizados no âmbito dos ministérios regionais da saúde. Eles também incluem organizações públicas de pacientes. Graças a este trabalho conjunto sistemático, foi possível alcançar alguns resultados: foram feitas alterações em algumas leis e regulamentos e, em alguns casos, os pacientes começaram a receber a terapia necessária.

“Hoje, o financiamento da lista de 24 doenças raras recai inteiramente sobre os ombros das regiões, e elas não conseguem fazer face a este fardo”

Contudo, precisamos de avançar e ajudar a melhorar as abordagens ao fornecimento de medicamentos aos pacientes com doenças raras. É muito importante desenvolver critérios transparentes e compreensíveis para a formação de listas de medicamentos em programas de financiamento público. Os especialistas estão confiantes de que as listas não devem ser estáticas, devem ser constantemente atualizadas, inclusive levando em conta o surgimento de novas doenças e novas opções de tratamento para doenças raras que antes eram consideradas incuráveis, como esclerose tuberosa, doença de Pompe, doenças associadas à criopirina. doenças. Por vezes, existem apenas algumas dezenas destes pacientes no país e não recebem tratamento porque estas doenças e medicamentos não estão incluídos em nenhuma lista.

A ciência permite tratar cada vez mais doenças que antes eram incuráveis. Médicos e pacientes não perdem a esperança de que, com o apoio do Estado, todos os métodos eficazes e inovadores de terapia estarão disponíveis para os pacientes russos, independentemente do diagnóstico.

Foto do arquivo pessoal de E. Zakharova

Entrevistado por Irina Tretyakova

Classificação de 22 subclasses dependendo da via metabólica afetada Subclasses: frequência Aminoacidopatia 31% Acidúria orgânica 27% Defeitos no ciclo da uréia 21% Defeitos na cadeia respiratória mitocondrial 12% Glicogenose 8% Defeitos na β-oxidação mitocondrial 8% Doenças peroxissomais 4%

Herança autossômica recessiva Fenilcetonúria1:8.000 Doença de Tay-Sachs 1: (entre judeus Ashkenazi)1:3.000 Doença de Gaucher1: Doença de Krabbe1: Herança recessiva ligada ao X Adrenoleucodistrofia ligada ao X1: Mucopolissacaridose tipo II1: Herança de herança autossômica recessiva Fenilcetonúria1:8.000 Tay-Sachs doença 1: (entre judeus Ashkenazi)1:3.000 Doença de Gaucher1: Doença de Krabbe1: Tipo de herança recessiva ligada ao X Adrenoleucodistrofia ligada ao X1: Mucopolissacaridose tipo II1: Frequência de ocorrência da DoençaFrequência

Por que identificar NBOs? NBO é um pequeno número de doenças monogênicas extremamente raras. A grande maioria são incuráveis. As NBO constituem uma grande classe de doenças monogénicas raras, cuja frequência total é elevada (pelo menos 1:5000 recém-nascidos vivos). Muitos NBOs são tratáveis. Para alguns, a correção clínica completa é possível. Com um diagnóstico estabelecido com precisão, é possível realizar diagnósticos pré-natais (pré-natais) na família.

Métodos cromatográficos utilizados no diagnóstico de NBO Aminoácidos ACA, HPLC Aminoacidopatia Ácidos orgânicos GC-MS Acidúria orgânica, Aminoacidopatia Purinas/pirimidinas HPLC Distúrbios do metabolismo purina/pirimidina ODLCFA, ácido fitânico, plasmógenos GC-MS Peroxisomal b-ni Metabólitos de colesterol GC- Síndrome de EM SLO Catecolaminas, aminoácidos HPLC Doenças do metabolismo de neurotransmissores Mono- e dissacarídeos HPLC Distúrbios do metabolismo de carboidratos hormônios HPLC Endocrinopatias hereditárias Carnitina e seus ésteres GC-MS Distúrbios da oxidação mitocondrial

A espectrometria de massa tandem é uma tecnologia moderna para diagnosticar NBOs. Permite analisar um grande número de metabólitos e, portanto, identificar um grande número de distúrbios metabólicos hereditários. O tempo de análise para uma amostra é de vários minutos. É necessária uma pequena quantidade de material biológico ( mancha de sangue seco)

Controle m/z, amu 50% Intensidade 100 PADRÕES INTERNOS Gly Ala Val Leu Met Cit Phe Tyr Glu Gly Ala Ser Pro Val Leu + Ile Gln Tyr Phe Glu Asp Aminoácidos

Doença da urina em xarope de bordo m / z, amu 50% Intensidade 100 PADRÕES INTERNOS Gly Ala Val Leu Met Cit Phe Tyr Glu Gly Ala Ser Pro Val Leu + Ile Gln Tyr Phe Glu Asp

Tirosinemia m/z, amu 50% Intensidade 100 PADRÕES INTERNOS Gly Ala Val Leu Met Cit Phe Tyr Glu Gly Ala Ser Pro Val Leu + Ile Gln Tyr Phe Glu Asp

M/z, amu % Intensidade C3C3 PADRÕES INTERNOS C4C4 C5C5 C8 C16 Acidúria glutárica tipo 1 C6C6 C18 C10 C12 C14 C5DC

Espectrometria de massa em tandem Espectrometria de massa em tandem Defeitos de β-oxidação Deficiência de SCAD Deficiência de MCAD (1:8000) Deficiência de VLCAD Deficiência de LCAHD Deficiência de CPT1 Deficiência de CPT2 Outros defeitos de β-oxidação Acidúrias orgânicas Acidúria glutárica tipo 1 (1:30.000) Acidemia propiônica (1:50.000) Acidúria metilmalônica (1:48.000) Acidúria isovalérica (1:50.000) Aminoacidopatia Leucinose (1:) PKU (1:8000) Tirosinemia tipo 1 (1:) Hiperglicinemia não cetótica (1:55.000) Citrulinemia (1:)

Diagnóstico de DNA Diagnóstico de portador de doença (extremamente importante para formas de doenças ligadas ao cromossomo X e doenças comuns em certos grupos étnicos) Diagnóstico de doenças com defeito bioquímico primário desconhecido Diagnóstico de doenças para as quais os métodos bioquímicos são complexos e requerem procedimentos invasivos (para exemplo, biópsia hepática) Diagnóstico pré-natal Diagnóstico pré-implantação

Princípios gerais de diagnóstico laboratorial de doenças metabólicas hereditárias

A nível clínico, o diagnóstico de NBO só pode ser suspeitado, e o diagnóstico adicional depende inteiramente da utilização de uma gama invulgarmente ampla de métodos bioquímicos e genéticos moleculares. Na maioria dos casos, apenas uma interpretação combinada de todos os resultados obtidos permite determinar com precisão a forma da doença.

A estratégia para um diagnóstico confiável de NBO inclui várias etapas: 1. Identificação de uma ligação defeituosa na via metabólica através da análise (quantitativa, semiquantitativa ou qualitativa) dos metabólitos correspondentes; 2. Detecção de disfunção proteica avaliando sua quantidade e/ou atividade; 3. Esclarecimento sobre a natureza da mutação, ou seja, características do alelo mutante no nível do gene.

Esta estratégia é utilizada não apenas para resolver problemas científicos relacionados ao estudo do metabolismo normal, aos mecanismos moleculares da patogênese da NBO e à identificação de correlações geno-fenotípicas, mas é necessária principalmente para o diagnóstico prático da NBO. A verificação do diagnóstico ao nível da proteína e do gene mutante é necessária tanto para o diagnóstico pré-natal, como para o aconselhamento médico e genético de famílias sobrecarregadas e, em alguns casos, para a prescrição de terapia adequada. Por exemplo, na deficiência de dihidropteridina redutase, o fenótipo clínico e os níveis de fenilalanina serão indistinguíveis da forma clássica de PKU, mas as abordagens para o tratamento destas doenças são fundamentalmente diferentes. A importância da diferenciação do locus do NBO para o aconselhamento genético médico pode ser demonstrada pelo exemplo da mucopolissacaridose tipo II (doença de Hunter). Com base no espectro de glicosaminoglicanos excretados, é impossível diferenciar as mucopolissacaridoses dos tipos II, I e VII, mas dessas doenças, apenas a doença de Hunter é herdada do tipo recessivo ligado ao X, o que é de fundamental importância para o prognóstico de descendentes de uma família afetada. A prioridade dos métodos de genética molecular é incondicional no estabelecimento do transporte heterozigoto, bem como no diagnóstico pré-natal de doenças em que a enzima mutante não é expressa nas células das vilosidades coriônicas.

Estágio de pesquisa de metabólitos

A avaliação de metabólitos em fluidos biológicos é uma etapa necessária no diagnóstico de aminoacidopatia, acidúria orgânica, mucopolissacaridose, doenças mitocondriais e peroxissomais, defeitos no metabolismo de purinas e pirimidinas, etc. Os métodos de análise cromatográfica desempenham um papel crítico no diagnóstico de NBO. Isso se deve ao fato de que o moderno arsenal de tecnologias cromatográficas é extremamente amplo e permite separar de forma eficaz e informativa misturas multicomponentes complexas, que também incluem material biológico. Para a triagem seletiva de NBOs, a cromatografia em camada delgada é utilizada com sucesso, o que permite obter informações em nível qualitativo. Este método de cromatografia é aplicável para a separação de aminoácidos, purinas e pirimidinas, carboidratos e oligossacarídeos. Para a análise quantitativa de marcadores metabólitos NBO, métodos cromatográficos como cromatografia gasosa e líquida de alta eficiência, bem como cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC, HPLC e CMS, respectivamente), são utilizados com sucesso. GC e HPLC são métodos universais para separação de misturas complexas de compostos e são caracterizados por alta sensibilidade e reprodutibilidade. Em ambos os casos, a separação ocorre como resultado de diferentes interações dos componentes da mistura com as fases estacionária e móvel da coluna cromatográfica. Para GC a fase móvel é um gás de arraste, para HPLC é um líquido (eluente). A saída de cada composto é registrada pelo detector do dispositivo, cujo sinal é convertido em picos no cromatograma. Cada pico é caracterizado por um tempo e área de retenção. Ressalta-se que a GC geralmente é realizada em altas temperaturas, portanto uma limitação para seu uso é a instabilidade térmica dos compostos. Para HPLC não existem tais restrições, porque neste caso, a análise é realizada em condições amenas. CMS é um sistema combinado de GC ou HPLC com detector seletivo de massa, que permite obter informações não apenas quantitativas, mas também qualitativas, ou seja, A estrutura dos compostos na mistura analisada é determinada adicionalmente.

Uma das direções promissoras no desenvolvimento de programas de diagnóstico de NBO é a utilização de métodos que possibilitem quantificar diversos metabólitos que são marcadores de diferentes grupos de NBO. Esses métodos incluem espectrometria de massa em tandem (TMS). O TMS permite caracterizar a estrutura, peso molecular e quantificar 3.000 compostos simultaneamente. Nesse caso, não é necessária uma preparação demorada da amostra para análise (como, por exemplo, para GC) e o tempo de pesquisa leva alguns segundos.

Estágio de pesquisa de proteínas mutantes

O estudo de proteínas mutantes pode ser realizado por vários métodos:

1. Determinação da atividade enzimática utilizando substratos naturais;
2. Determinação da atividade enzimática utilizando substratos artificiais;
3. Carregamento de fibroblastos cultivados com substratos acumulados;
4. Medição da concentração de proteínas usando métodos imunoquímicos.

O material para medir a atividade enzimática na NBO são principalmente os leucócitos do sangue periférico: em quase todas as doenças de armazenamento lisossômico, na acidúria metilmalônica e em algumas glicogenoses. Para diagnosticar gangliosidose GM2 e deficiência de biotinidase, utiliza-se plasma ou soro. Em alguns casos, os objetos de estudo são tecidos musculares ou hepáticos: enzimas da cadeia respiratória mitocondrial, glicogenose. A cultura de fibroblastos da pele também é amplamente utilizada para diagnóstico.

Estágio de pesquisa de genes mutantes

O desenvolvimento de métodos de biologia molecular foi uma verdadeira revolução no campo da bioquímica clínica. O desenvolvimento de protocolos padrão para pesquisa molecular e a automação dos métodos utilizados constituem hoje um conjunto completo de abordagens diagnósticas e, junto com os métodos bioquímicos, estão se tornando um procedimento de rotina em laboratórios clínicos. O rápido desenvolvimento da pesquisa no campo da decifração do genoma humano e da determinação da sequência de DNA dos genes torna agora possível o diagnóstico de DNA de várias doenças hereditárias. Métodos para diagnóstico de DNA e análise da estrutura de genes normais e seus análogos mutantes em doenças metabólicas hereditárias começaram a ser utilizados na última década.

Para diagnóstico de DNA de doenças hereditárias, são utilizadas duas abordagens principais - diagnóstico de DNA direto e indireto. O diagnóstico direto de DNA é um estudo da estrutura primária de um gene danificado e a identificação de mutações que levam à doença. Para detectar danos moleculares em genes que causam doenças hereditárias, é utilizado um arsenal padrão de métodos de biologia molecular. Dependendo das características e tipos de mutações, sua frequência de ocorrência em diversas doenças hereditárias, certos métodos são os mais preferíveis.

Para diagnosticar NBO nos casos em que o defeito bioquímico é conhecido com precisão e determinado de forma fácil e confiável usando técnicas bioquímicas, é improvável que os métodos de DNA tenham prioridade. Nestes casos, o uso da análise de DNA é mais uma abordagem de pesquisa do que diagnóstica. Porém, após um diagnóstico estabelecido com precisão, os métodos de análise de DNA serão úteis para posterior diagnóstico pré-natal, identificação de portadores heterozigotos na família e prognóstico da doença em homozigotos, bem como para seleção de pacientes para fins de terapia casual no futuro (substituição enzimática e terapia genética). Além disso, nos casos em que o defeito bioquímico não é conhecido com precisão, o diagnóstico bioquímico é difícil, não é suficientemente fiável ou requer métodos de investigação invasivos, os métodos de diagnóstico de ADN são os únicos e indispensáveis ​​para um diagnóstico preciso.

Em geral, as táticas de diagnóstico de NBO em cada caso específico devem ser planejadas em conjunto com um bioquímico e um geneticista. As condições necessárias para um diagnóstico rápido e bem-sucedido são a compreensão da etiologia, dos mecanismos de patogênese da doença e do conhecimento de marcadores bioquímicos específicos.

Ao prestar serviços médicos, os médicos devem, antes de mais nada, permanecer humanos. Depois de encontrar conosco um laboratório de doenças metabólicas hereditárias, não esqueça de deixar sua opinião.

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Centro de pesquisa médico-genética da Academia Russa de Ciências Médicas. O site do Laboratório de Doenças Metabólicas Hereditárias contém informações sobre diagnósticos laboratoriais de doenças hereditárias raras, suas manifestações clínicas e opções de tratamento. No site: espectrometria de massa em tandem / doenças detectadas usando TMS / indicações para análise de TMS / doenças de armazenamento lisossômico / regras de amostragem de sangue / lista de preços / encaminhamento de amostra para análise / como chegar até nós / links úteis

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Comentários e perguntas

Anna Mignenko, 01/09/2015

Olá. Somos de Stavropol. A criança tem 3,5 anos. Procuramos aconselhamento de um geneticista do SKKKDC sobre atraso no desenvolvimento psicomotor com perda de habilidades adquiridas precocemente de origem desconhecida e ataxia de origem desconhecida.
O seguinte foi realizado. exames:
-estudo citogenético (cariótipo): 46,XX
-exame de sangue para FA - 0,7 mg%
-TLC de aminoácidos e carboidratos no sangue - sem patologia
-TLC de aminoácidos na urina: hiperaminoacidúria generalizada!
-análise urinária: leucócitos++; teste para ácido xanturênico - fracamente positivo.
Nas condições do laboratório NBO foram realizados:
- exame de sangue pelo método TMS - não foram revelados dados para aminoacidopatia hereditária, acidúria orgânica e defeitos na beta-oxidação mitocondrial;
- diagnóstico enzimático para 6 doenças de armazenamento - não foram detectados desvios.
Foi-nos recomendado consultar Ekaterina Yuryevna Zakharova. Por favor, diga-me como podemos contatá-la e marcar uma consulta.