Para cotação: Belov B.S., Nasonov E.L. Medicamentos biológicos de engenharia genética e infecções em pacientes com artrite reumatóide: estado atual do problema // RMZh. 2009. Nº 21. S. 1418

Nas últimas décadas, ocorreram mudanças significativas na reumatologia, principalmente associadas à introdução ativa na prática clínica dos chamados medicamentos biológicos geneticamente modificados (GEBPs), cuja ação visa componentes específicos da patogênese das doenças reumáticas (DR) . À medida que a experiência clínica global se acumula, tornou-se claro que o uso destes medicamentos está associado a um risco crescente de desenvolvimento de infecções de diversas origens e locais.

Até o momento, os mecanismos subjacentes ao aumento do risco de infecções causadas pelo uso de medicamentos biologicamente ativos não foram totalmente elucidados. No entanto, a susceptibilidade dos pacientes a certos tipos de infecções pode ser explicada pelo facto de os “alvos” destes medicamentos serem componentes-chave da defesa imunitária humana, nomeadamente factor de necrose tumoral-a (TNF-a), interleucina-1, interleucina-6 (IL-6) , linfócitos B e T, etc.

A discussão de questões relacionadas à associação de “infecções por GBD” deve ser realizada levando-se em consideração o risco de desenvolvimento de complicações infecciosas, causado tanto pela presença de RD autoimune quanto pela necessidade de prescrição de outros medicamentos antirreumáticos amplamente utilizados que tenham efeito imunossupressor. efeito.

A alta incidência de infecções comórbidas (ICs) que complicam o curso da AR é conhecida há 45 anos. Os ICs em pacientes com AR desenvolvem-se 1,5 vezes mais frequentemente do que na população e ocupam 2-3º lugar em frequência entre as causas de morte nesses pacientes. Segundo estudos russos, em 2002-2005. (ou seja, antes do uso ativo do GEBD), a incidência de IC na população hospitalar foi de 9,7%. Ao mesmo tempo, a frequência de infecções secundárias foi maior entre pacientes com artrite reumatóide (AR) - 38,1%.

De acordo com os resultados de um estudo de coorte, as complicações infecciosas mais comuns da AR incluem (em ordem decrescente): artrite séptica, osteomielite, infecções de pele e tecidos moles, pneumonia. Segundo os mesmos autores, os principais preditores do desenvolvimento de IC na DR são doenças pulmonares crônicas, leucopenia, manifestações extra-articulares da doença, presença de fator reumatoide, aumento da VHS e tratamento com glicocorticóides. Um estudo prospectivo de um ano mostrou que o uso de metotrexato em pacientes com AR levou a um aumento significativo no número total de ICs secundários em comparação com controles (62,5 e 47%, respectivamente, p.<0,05) .

Inibidores do fator de necrose
tumores- a

Descoberta das principais citocinas pró-inflamatórias, principalmente fator de necrose tumoral - a(TNF- a), levou à criação de um grupo de medicamentos (infliximab, adalimumab, etanercept) que bloqueiam a sua ação. O uso de inibidores de TNF a(TNF- a), principalmente na AR, foi um grande sucesso. No entanto, durante os estudos clínicos, foi identificado um problema como o aumento da incidência e gravidade de infecções, incluindo as oportunistas (micoses invasivas, pneumonia por Pneumocystis, etc.), bem como um risco aumentado de reactivação de uma infecção latente, principalmente tuberculose (TB). Além disso, foram registrados casos de infecções graves (pneumonia, sepse, artrite bacteriana, lesões de pele e tecidos moles, etc.), incluindo mortes. Os dados relativos ao risco de desenvolver infecções têm sido altamente inconsistentes. Assim, a maioria dos ensaios clínicos randomizados (ECR) indicou uma baixa incidência de infecções graves, semelhante à de outros DMARDs (em particular, metotrexato) ou em geral para pacientes com AR (Tabela 1). Ao mesmo tempo, o uso de TNF- α na prática clínica real com AR e outras DR levou a um claro aumento na frequência de infecções, incluindo as graves. Em estudo randomizado que incluiu 709 pacientes com diversas DRs, autores britânicos afirmaram que com o uso ativo de TNF- α entre 1997 e 2004, a incidência de infecções graves, ou seja, necessitando de hospitalização e uso de antibióticos parenterais aumentou de 3,4 para 10,5 por 100 pacientes-ano. Ainda mais impressionantes são os dados de investigadores suíços, segundo os quais, durante a terapia com infliximab e etanercept, desenvolveram-se infecções graves em 18,3% dos casos. Ao mesmo tempo, a incidência anual de infecções graves em pacientes com AR durante o tratamento com estes medicamentos biologicamente ativos aumentou de 0,008 para 0,181 por 100 pacientes-ano, ou seja, 22 (!) vezes.

De acordo com um grande estudo de coorte que incluiu mais de 5 mil pacientes com AR, o risco de desenvolver infecções bacterianas verificadas em pacientes que receberam inibidores de TNF-α, em comparação com aqueles que tomaram metotrexato, foi 2 vezes maior no geral e 4 vezes maior durante os primeiros 6 meses terapia

O aumento da incidência de complicações infecciosas durante o tratamento com inibidores do TNF-α é confirmado por dados de registros nacionais. Assim, entre os pacientes com AR incluídos no Registro Britânico de Medicamentos Biológicos, a incidência de complicações infecciosas graves durante os primeiros 90 dias de terapia com inibidor de TNF-α excedeu a do tratamento com DMARD tanto em geral quanto para etanercepte, infliximabe e adalimumabe separadamente (4,6, 4,1 , 5,6 e 3,9 vezes, respectivamente). Segundo o registro alemão, a incidência de infecções bacterianas graves no tratamento da AR com etanercepte foi de 6,4, com infliximabe - 6,2, DMARDs - 2,3 por 100 pacientes-ano (p = 0,016). Uma análise dos dados do registro sueco mostrou que a incidência de infecções graves durante a terapia inicial com TNF-α foi de 5,4, e quando esta última foi ineficaz e um TNF-α foi substituído por outro, foi de 10 por 100 pacientes-ano.

Dado que o TNF-α desempenha um papel fundamental na formação do granuloma através da indução da apoptose e na sua manutenção, assume-se que o bloqueio desta citocina leva ao desenvolvimento (ou exacerbação de uma infecção granulomatosa existente). Nesse sentido, os resultados de um estudo realizado por J. Keane et al., baseado na análise do banco de dados AERS (Adverse Effects Report System) da American Food & Drug Administration (FDA), que coleta todos os relatos espontâneos de reações adversas , são bastante indicativos, tanto de médicos quanto de fabricantes de medicamentos. Descobriu-se que, no contexto da introdução ativa do infliximabe no tratamento de pacientes com AR, a frequência da infecção ativa por TV aumentou 4 vezes. De acordo com o registro espanhol BIOBADASER, a frequência de TV ativa em pacientes com AR durante o tratamento com TNF-α aumentou 6,2 vezes. Na Suécia, no período 1999-2001. foi declarado um aumento de 4 vezes no risco de desenvolver TV. Como resultado de um estudo prospectivo de 3 anos realizado na França ( RAZÃO ), foram identificados 69 novos casos de TV em pacientes com DR que receberam inibidores de TNF-a. Destes, 36 pacientes receberam infliximabe, 28 receberam adalimumabe e 5 receberam etanercepte. Numa análise de caso-controle, descobriu-se que o uso de infliximabe ou adalimumabe estava associado a um risco aumentado de infecção por TV em comparação com o etanercepte em 13,3 e 17,1 vezes, respectivamente. Segundo os pesquisadores, esse fato se deve às diferenças no mecanismo de ação dos dois tipos de inibidores do TNF-a sobre o TNF ligado à membrana e, consequentemente, aos diferentes efeitos nas células T efetoras e reguladoras. Outros fatores de risco para o desenvolvimento de TV incluíram idade, primeiro ano de tratamento com inibidores de TNF-α e residência em região endêmica. Dados semelhantes são apresentados no British Biologics Registry, onde foi diagnosticada infecção ativa por TV em 29 pacientes recebendo inibidores de TNF-α. Em comparação com o etanercept, o risco de desenvolver TV aumentou 2,84 vezes para o infliximab e 3,53 vezes para o adalimumab. Supõe-se que nas fases iniciais do tratamento com inibidores do TNF-a ocorra a reativação do processo latente de TV e, numa fase posterior, o desenvolvimento da infecção por TV de novo. Esses pacientes podem ter problemas no tratamento da TV devido à baixa eficácia dos regimes terapêuticos padrão.

O exposto gerou a necessidade de desenvolver recomendações para a detecção precoce, diagnóstico e prevenção de TV no planejamento e condução da terapia com TNF-a em pacientes com DR. Atualmente, recomendações relevantes foram desenvolvidas e implementadas na prática clínica em vários países, incl. na Rússia .

Os dados de estudos sobre o uso de inibidores do TNF-α em pacientes infectados pelos vírus da hepatite B (VHB) e vírus C (VHC) são controversos. Em particular, em pacientes com VHB, foi demonstrado o importante papel do TNF-a na depuração e, em interação com o interferon, na supressão da replicação viral. Portanto, a inibição do TNF-a pode levar à diminuição da depuração e ao aumento da replicação do VHB e, portanto, à recidiva da hepatite. Isto é confirmado pelas descrições de casos de reativação da infecção pelo VHB levando ao desenvolvimento de hepatite fulminante em pacientes com AR e doença de Still durante terapia com infliximabe. De acordo com o consenso publicado em 2008 sobre o uso de drogas biologicamente ativas no câncer, a administração de inibidores de TNF-a não está indicada para pacientes com infecção comprovada pelo VHB. No entanto, vários autores acreditam que se houver indicações claras e não houver alternativa à terapia com TNF-a, a terapia pode ser realizada (com cautela!) em portadores de HBV com uso profilático obrigatório de medicamentos antivirais de espectro estendido (lamivudina, entecavir, etc.). Estes últimos são prescritos 2 a 4 semanas antes do início da terapia com TNF-α e continuam por pelo menos 6 a 12 meses. após sua conclusão.

Não foram descritos até o momento casos de reativação do VHC durante o tratamento com drogas biologicamente ativas. Apesar disso, o interesse dos pesquisadores por esse problema ainda é grande. Sabe-se que o TNF-a, juntamente com outras citocinas pró-inflamatórias, é produzido durante a infecção pelo HCV e, portanto, desempenha um papel importante no curso natural da doença. Foi demonstrado que o TNF-a pode induzir a produção do fator transformador de crescimento-b, cuja expressão está intimamente relacionada à gravidade histológica da atividade do processo e à necrose lobular em pacientes com infecção crônica pelo HCV. Além disso, níveis elevados de TNF-a têm um impacto negativo na resposta do paciente com VHC à terapia com interferon. Portanto, o bloqueio do TNF-a poderia ter efeitos benéficos em pacientes com infecção pelo VHC. Foi demonstrado que a combinação de etanercepte com terapia antiviral padrão (interferon + ribavirina) levou a um resultado mais favorável (p=0,04). Contudo, a duração da terapia neste estudo não excedeu 3-9 meses. Para uma avaliação final da segurança do uso de inibidores de TNF-a, bem como de outros GIBDs para DR em combinação com HCV, são necessários estudos em larga escala com períodos mais longos de tratamento e observação.

Assim, o risco aumentado de desenvolver infecções é um fenómeno indesejável específico de todo o grupo de inibidores do TNF-a. Sua presença geralmente não depende do mecanismo específico de bloqueio do TNF, da tecnologia de produção, da via de administração e de outras características do medicamento. A incidência de infecções bacterianas graves durante o tratamento com inibidores do TNF-α aumenta 2 a 4 vezes, especialmente nos primeiros 90 dias de tratamento, e aumenta quando combinado com metotrexato. Com base em estudos controlados por placebo, a incidência e o padrão de infecções são aproximadamente os mesmos para infliximab, etanercept (excepto TB) e adalimumab.

Rituximabe

Rituximabe é um anticorpo monoclonal quimérico geneticamente modificado (ou seja, consistindo em proteína humana e de camundongo) para o antígeno CD-20 das células B. A principal indicação de seu uso é o tratamento da AR moderada e grave, resistente ao TNF-α a. Além disso, o rituximabe é utilizado com sucesso em outras doenças (lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Sjögren, vasculite, etc.).

De acordo com os dados do ECR (Tabela 2), o tratamento com rituximabe mostrou um aumento na incidência de infecções (incluindo infecções graves do trato respiratório e urinário), mas não foram observadas diferenças significativas em relação aos medicamentos de comparação. Especificamente, nos estudos de fase IIB, a taxa de infecção foi de 28% entre os pacientes tratados com metotrexato e de 35% para cada grupo de rituximabe. Durante o estudo REFLEXO as taxas de infecções graves foram de 3,7 e 5,2 por 100 pacientes-ano para placebo e rituximabe, respectivamente. De acordo com os ECRs, a incidência global de infecções graves entre pacientes com AR tratados com rituximabe foi de 5,0, no grupo controle de 3,4, por 100 pacientes-ano. A observação prospectiva de longo prazo de uma grande coorte de pacientes com AR (1.053 pessoas) que receberam ≥1 injeção de rituximabe mostrou uma incidência persistente (mas não crescente) de infecções (incluindo as graves) (Tabela 3).

Não existem dados que indiquem um risco aumentado de desenvolvimento de TV ou infecções oportunistas causadas por agentes patogénicos oportunistas em doentes a tomar rituximab para a AR. Ao mesmo tempo, há descrições de casos de reativação da infecção pelo VHB em pacientes com linfomas. Isto pode impor restrições ao uso de rituximab na AR em combinação com a infecção acima mencionada. Os fatos do uso seguro e bem-sucedido de rituximabe em pacientes com vasculite crioglobulinêmica associada ao VHC são dignos de nota. No entanto, alguns destes pacientes apresentaram viremia transitória pelo VHC. De acordo com as recomendações da Sociedade Francesa de Reumatologia, em pacientes com infecções ativas por HBV e HCV, a questão da prescrição de rituximabe deve ser decidida somente após consulta a um hepatologista.

Assim, o uso de rituximabe, assim como outras drogas imunomoduladoras, aumenta o risco de desenvolvimento de infecções em pacientes com AR. A incidência de infecções graves é de 5/100 pacientes-ano e não muda significativamente após repetidas injeções do medicamento. Apesar da falta de indicações para o desenvolvimento de TV nos estudos com rituximabe, deve-se enfatizar que a grande maioria dos pacientes incluídos nos ECR eram pacientes com terapia prévia com TNF-α sem sucesso. Conseqüentemente, todos eles já haviam sido exibidos na TV. Segundo os especialistas do já citado consenso de 2008, atualmente não há dados suficientes para tomar uma decisão sobre a necessidade (ou inadequação) do rastreamento de TV em pacientes com AR antes de iniciar o uso de rituximabe. Portanto, o médico deve permanecer atento ao possível desenvolvimento de TV durante a terapia com este medicamento.

Abatacept

Abatacept é uma molécula de proteína híbrida solúvel que consiste em 2 componentes - o domínio extracelular de CTLA4 e o fragmento Fc da globulina IgG1. Ao se ligarem ao CD80/86, as moléculas CTLA4 impedem competitivamente o CD28 de interagir com elas na superfície dos linfócitos T, bloqueando assim a ativação destes últimos.

Nos ECR, a incidência de infecções (incluindo as graves) durante o tratamento com abatacept foi bastante baixa (Tabela 2). Contudo, no estudo AIM de um ano, predominaram infecções graves no grupo tratado com abatacept. Ao avaliar a segurança do abatacept na prática clínica real (estudo ASSEGURAR ) a frequência de complicações infecciosas, incluindo infecções graves, não diferiu significativamente do controle (56,0 e 54,1%, 2,9 e 1,9%, respectivamente). Foi demonstrado um aumento na incidência de infecções graves quando o abatacept é combinado com outros inibidores do TNF-a. Globalmente, numa avaliação de 5 grandes ensaios clínicos randomizados, a incidência de infecções graves durante o tratamento com abatacept foi superior à dos controlos (3 e 1,3%, respectivamente). Os locais mais comuns de infecções graves foram o sistema respiratório (pneumonia, bronquite, sinusite), o trato urogenital (pielonefrite), a pele e tecidos moles e o sistema digestivo (diverticulite). Foram relatados 6 casos de TV, o que totalizou 0,06 por 100 pacientes-ano. Também foi observado um aumento na frequência de infecção viral por herpes em comparação com o controle (2 e 1%, respectivamente). Não houve casos de infecção pelo vírus HBV, HCV, HIV ou JC.

Assim, o tratamento com abatacept está associado a um risco moderado de desenvolvimento de infecções bacterianas, que aumenta com o uso simultâneo de abatacept e inibidores do TNF-a.

Tocilizumabe

O tocilizumabe é um medicamento que é um anticorpo monoclonal humanizado recombinante para o receptor da interleucina-6 (IL-6) humana, bloqueando ambas as vias de sinalização da ativação celular dependente de IL-6.

Atualmente, o programa de ensaios clínicos do tocilizumabe inclui cerca de 4 mil pacientes com AR, o que nos permite ter uma certa impressão não só sobre a eficácia, mas também sobre a segurança desse medicamento.

Como pode ser observado na Figura 1, a incidência de infecções graves que se desenvolveram durante o tratamento com tocilizumabe foi semelhante à dos pacientes que receberam inibidores do TNF-α. Também semelhante foi a estrutura das complicações infecciosas, que incluíam pneumonia, flegmão, herpes zóster-infecção, artrite bacteriana e reativação, infecções latentes, incl. micobacteriano. Em alguns casos, infecções graves resultaram em morte. Dois casos de desenvolvimento de TV foram descritos em pacientes com AR que receberam tocilizumabe por longo período (1,5 e 2 anos), o que torna necessária a triagem adequada antes de iniciar o tratamento. Além disso, segundo especialistas do Colégio Japonês de Reumatologia, para minimizar o desenvolvimento de infecções oportunistas, os pacientes com AR devem atender às seguintes condições antes de prescrever o tocilizumabe; a) contagem de leucócitos no sangue periférico ≥4000/mm3, b) contagem de linfócitos no sangue periférico ≥1000/mm3, c) teste sérico negativo para 1,3-b-D-glucano (um marcador de micoses invasivas profundas).

Na formação da defesa antibacteriana do macrorganismo, o papel especial da IL-6 é que, por um lado, sendo um pirogênio endógeno, inicia o aumento da temperatura corporal e, por outro, estimula a produção da fase aguda proteínas. Como resultado, ao tratar pacientes com AR com tocilizumabe, os sintomas clínicos (febre, fraqueza) e laboratoriais (aumento da VHS e PCR) do processo infeccioso podem ser apagados ou ausentes. Portanto, é necessário manter um alto grau de vigilância para detectar precocemente complicações infecciosas, incl. sério. Como casuística, é apresentada a descrição de um caso de pneumonia grave com manifestações clínicas inicialmente mínimas e o desenvolvimento de um estado de choque dentro de 1 dia a partir do início da terapia com tocilizumabe.

Vacinação

Atualmente, os médicos têm em seu arsenal um número suficiente de medicamentos anti-infecciosos. Mas só com a ajuda deles é impossível resolver todos os problemas associados às infecções na reumatologia, como em outras áreas da medicina. Portanto, num futuro próximo, muita atenção será dada à criação, aprimoramento e introdução ativa de diversas vacinas na prática clínica.

De acordo com as recomendações de 2009 do Center for Disease Control (CDC) e da Infectious Disease Society of North America, a vacinação contra influenza é aconselhável para todos os pacientes adultos com imunossupressão devido à própria doença ou ao uso de medicamentos imunomoduladores e infecção pneumocócica. Esta disposição pode ser legitimamente extrapolada para a maioria dos pacientes com DR, incluindo a categoria de pacientes considerada neste artigo.

Poderiam os mecanismos que causam o aumento da suscetibilidade dos pacientes com DR às infecções causar um enfraquecimento da resposta imunológica à vacina? A ativação do sistema imunológico induzida pela vacina levará ao desenvolvimento ou exacerbação das DR existentes? Estas duas questões permaneceram até recentemente como os principais factores limitantes para a utilização generalizada da vacinação em reumatologia. Os dados hoje disponíveis indicam a ausência de qualquer impacto negativo da imunização no curso da RD principal, bem como a preservação ou ligeira diminuição estatisticamente insignificante do nível de anticorpos anti-infecciosos induzidos pela vacina, incl. em pacientes com AR recebendo medicamentos biológicos.

Os dados sobre o efeito do TNF-α na resposta imune pós-vacinação estão resumidos na Tabela 4. Kaine et al. após a administração da vacina contra influenza, o nível protetor de anticorpos em pacientes com AR que receberam adalimumabe não diferiu daquele do controle com placebo (98 e 94,55%, respectivamente). Segundo os mesmos autores, os níveis de anticorpos protetores após a administração da vacina pneumocócica polissacarídica 23-valente também foram semelhantes nestes grupos (85,9 e 81,7%, respectivamente). Num estudo de coorte prospectivo realizado por autores holandeses, o nível protector de anticorpos em resposta à vacinação contra a gripe foi mantido em 80% dos pacientes que receberam inibidores do TNF-α, 82-93% em outros DMARDs e 89-94% em controlos saudáveis. Os títulos pós-vacinais de anticorpos antipneumocócicos em pacientes com AR que receberam inibidores de TNF-a não diferiram daqueles do controle e excederam significativamente os dados obtidos durante o tratamento com metotrexato.

Assim, a vacinação contra influenza e infecção pneumocócica é importante no manejo de pacientes com AR que recebem medicamentos biológicos, apesar de em alguns estudos a resposta imune a essas vacinas ter sido incompleta. A administração de vacinas vivas é contraindicada. É aconselhável realizar a imunização com estas vacinas pelo menos 4 semanas antes do início do tratamento com agentes biológicos biologicamente ativos. A fim de desenvolver indicações mais claras para a vacinação e avaliar o impacto de vários medicamentos biologicamente ativos nos seus resultados, são necessários mais estudos multicêntricos em grande escala.

Concluindo, consideramos aconselhável focar a atenção dos médicos nos pontos mais importantes relacionados à minimização do impacto da infecção na terapia com medicamentos biologicamente ativos.

Na fase inicial:

. seleção criteriosa dos pacientes estritamente de acordo com as indicações;

. exclusão de pacientes com infecção ativa clinicamente significativa;

. exame minucioso para identificação de infecção latente, tratamento adequado caso seja detectada, retardando o início da terapia com medicamentos biologicamente ativos;

. extrema cautela ao decidir sobre o tratamento da GIBD em pacientes com maior suscetibilidade a infecções, com infecção crônica ou história de infecções recorrentes.

Durante e após o tratamento:

. informações dos pacientes sobre a possibilidade de medicamentos biologicamente ativos aumentarem a capacidade de desenvolver infecções;

. orientar os pacientes sobre a necessidade de consultar imediatamente um médico caso apresentem sintomas de infecção (aumento da temperatura corporal, fraqueza geral, tosse ou sintomas semelhantes aos da gripe) ou sinais que sugiram tuberculose (febre baixa, tosse prolongada, perda de peso, etc.). ) aparecem durante ou após tratamento com medicamento biologicamente ativo. );

. observação atenta por pelo menos 6 meses. após conclusão do tratamento com GIBD (em particular, inibidores de TNF-a);

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GOU VPO "Estado Siberiano

Universidade Médica" do Ministério da Saúde da Rússia

Faculdade de Fármacia

Departamento de Tecnologia Farmacêutica

TRABALHO DO CURSO

“Medicamentos obtidos por engenharia genética”

Concluído por um aluno

V ano Faculdade de Farmácia

gr. 3004 Isachenko K.A.

Verificado por um professor sênior

Candidato em Ciências Farmacêuticas, Teplyakova E. M.

Introdução

1. Nomenclatura de medicamentos geneticamente modificados

2. Anticorpos monoclonais

Conclusão

Bibliografia

Introdução

biológico genético médico

A engenharia genética, ou tecnologia de DNA recombinante, é uma mudança que utiliza técnicas bioquímicas e genéticas de material cromossômico - a principal substância hereditária das células. Com isso, é possível realizar alterações no genoma que dificilmente ocorreriam naturalmente. Vários medicamentos já foram obtidos por meio de engenharia genética, incluindo a insulina humana e o medicamento antiviral interferon. Na medicina, esta é uma forma muito promissora de criar e produzir vacinas. Na agricultura, o DNA recombinante pode ser usado para produzir variedades de plantas cultivadas resistentes à seca, ao frio, a doenças, a pragas de insetos e a herbicidas.

Transferência de plasmídeos em bactérias. A maior parte do trabalho sobre a transferência de secções de ADN, ou genes, foi realizada até recentemente em bactérias. Nas bactérias, a informação genética está contida em uma grande molécula de DNA – o cromossomo bacteriano. Como as bactérias se reproduzem assexuadamente, esta informação genética permanece praticamente inalterada ao longo de muitas gerações. Numa célula bacteriana, além do seu cromossomo principal, existem também pequenos segmentos circulares de DNA. Essas moléculas de DNA, as chamadas. Os plasmídeos geralmente carregam genes responsáveis ​​pela resistência aos antibióticos. Os plasmídeos podem ser extraídos de uma célula e transferidos para outra. Esse trabalho é realizado, por exemplo, com Escherichia coli (Escherichia coli), uma bactéria inofensiva que vive no trato gastrointestinal humano. Algumas das células de E. coli contêm um plasmídeo com genes de resistência ao antibiótico tetraciclina. Esses plasmídeos - chamados de fatores de resistência - são facilmente separados do DNA cromossômico principal. As bactérias que não são resistentes à tetraciclina (destruídas por ela) podem ser forçadas a incorporar esses plasmídeos submetendo as células a um tratamento químico apropriado, que tornará o envelope permeável a plasmídeos estranhos. As células que receberam o fator de resistência dessa forma sobrevivem em meio de cultura contendo tetraciclina, enquanto as células instáveis ​​morrem. De cada célula - como resultado de divisões repetidas - surge um clone, ou seja, uma coleção de cópias exatas de uma única célula obtida por meio de reprodução assexuada. O plasmídeo é replicado em cada célula do clone e sua reprodução é chamada de clonagem molecular.

Conexão de diferentes plasmídeos. Os plasmídeos podem ser cortados, os fragmentos unidos e então esses plasmídeos combinados podem ser introduzidos nas células. Fragmentos de DNA da mesma espécie ou de espécies diferentes podem ser combinados. Como o DNA plasmidial é uma molécula circular fechada, o anel deve primeiro ser quebrado para que as extremidades livres sejam quimicamente reativas, adequadas para posterior união. Isto pode ser conseguido usando várias enzimas chamadas nucleases (enzimas de restrição). Os fragmentos de DNA são então unidos usando ligases, enzimas que reparam danos no DNA e unem as pontas dos fios quebrados. É desta forma que os plasmídeos de uma estirpe de E. coli resistente à tetraciclina e os plasmídeos de uma estirpe resistente a outro antibiótico, a canomicina, podem ser combinados para produzir uma estirpe de E. coli resistente a ambos os antibióticos.

Experimentos com duas espécies. Plasmídeos de outro tipo de bactéria, como Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus), por si só não são capazes de se reproduzir nas células de E. coli. No entanto, eles podem multiplicar plasmídeos híbridos feitos artificialmente a partir de parte do plasmídeo de S. aureus e de um fragmento do plasmídeo de E. coli. Foi realizada uma experiência na qual plasmídeos de S. aureus resistente à penicilina foram combinados com plasmídeos de uma cepa de E. coli resistente à tetraciclina. Quando os plasmídeos híbridos foram então introduzidos em células de E. coli, a estirpe resultante era resistente tanto à penicilina como à tetraciclina. Esta experiência, na qual a informação genética foi transferida entre organismos não relacionados, sugeriu que moléculas de ADN de organismos superiores poderiam ser introduzidas em células bacterianas e que seriam replicadas (copiadas) nestas células.

Transferência de genes animais. Dos genes animais, os genes da rã com garras Xenopus laevis foram os primeiros a serem introduzidos na bactéria. Esses genes são bem estudados e fáceis de identificar. Eles foram introduzidos em células de uma cepa de E. coli resistente à tetraciclina e ali se replicaram. Os clones resultantes tinham uma composição de DNA que combinava as características de X. laevis e E. coli. Atualmente já aprendemos como transferir genes de um animal para outro e de animais para plantas. Foram obtidos camundongos, porcos, ovelhas, vacas e peixes "transgênicos". O DNA pode ser injetado diretamente no óvulo fertilizado da espécie receptora, ou pode-se usar como transportador um vírus que, tendo penetrado na célula, trará consigo o gene desejado. O terceiro método envolve o uso de células-tronco embrionárias não especializadas. Os genes são introduzidos nas células-tronco por injeção ou com um vírus, e as células transgênicas resultantes são injetadas em outro embrião, que incorpora essas células estranhas em seus tecidos. Os genes humanos também foram introduzidos em plantas, como o tabaco, na esperança de obter desta forma grandes quantidades das proteínas necessárias, em particular anticorpos e enzimas.

Uso pratico. Agora eles são capazes de sintetizar genes e, com a ajuda desses genes sintetizados introduzidos nas bactérias, são obtidas várias substâncias, em particular hormônios e interferon. Sua produção constituiu um importante ramo da biotecnologia. O interferão, uma proteína sintetizada pelo organismo em resposta a uma infecção viral, está agora a ser estudado como um possível tratamento para o cancro e a SIDA. Seriam necessários milhares de litros de sangue humano para obter a quantidade de interferon que apenas um litro de cultura bacteriana fornece. Os benefícios da produção em massa desta substância são muito grandes. A insulina, obtida a partir da síntese microbiológica, necessária ao tratamento do diabetes, também desempenha um papel muito importante. A engenharia genética também tem sido utilizada para criar uma série de vacinas que estão agora a ser testadas para testar a sua eficácia contra o vírus da imunodeficiência humana (VIH), que causa a SIDA. Com a ajuda do DNA recombinante, o hormônio do crescimento humano também é obtido em quantidades suficientes, o único meio de tratar uma doença rara da infância - o nanismo hipofisário. Outra direção promissora na medicina associada ao DNA recombinante é a chamada. terapia de genes. Nesses trabalhos, que ainda não saíram da fase experimental, uma cópia geneticamente modificada de um gene que codifica uma poderosa enzima antitumoral é introduzida no corpo para combater um tumor. A terapia genética também começou a ser usada para combater distúrbios hereditários do sistema imunológico. Na agricultura, dezenas de culturas alimentares e rações foram geneticamente modificadas. Na pecuária, o uso do hormônio do crescimento produzido biotecnologicamente aumentou a produção de leite; Uma vacina contra herpes em porcos foi criada a partir de um vírus geneticamente modificado.

Opinião pública. Apesar dos benefícios óbvios da investigação e experimentação genética, o próprio conceito de “engenharia genética” deu origem a várias suspeitas e receios, e tornou-se objecto de preocupação e até de controvérsia política. Muitos temem, por exemplo, que algum vírus que causa câncer em humanos seja introduzido em uma bactéria que normalmente vive no corpo ou na pele de uma pessoa, e então essa bactéria cause câncer. Também é possível que um plasmídeo portador de um gene de resistência a medicamentos seja introduzido num pneumococo, fazendo com que o pneumococo se torne resistente aos antibióticos e fazendo com que a pneumonia se torne intratável. Esses tipos de perigos existem sem dúvida. A investigação genética é conduzida por cientistas sérios e responsáveis, e os métodos para minimizar a possibilidade de propagação acidental de micróbios potencialmente perigosos estão constantemente a ser melhorados. Ao avaliar os possíveis perigos que estes estudos representam, devem ser comparados com as verdadeiras tragédias causadas pela desnutrição e pelas doenças que matam e mutilam as pessoas.

1. Nomenclatura de medicamentos geneticamente modificados

Preparações biológicas obtidas por engenharia genética.

Das muitas centenas de medicamentos obtidos por engenharia genética, apenas uma parte foi introduzida na prática: interferons, interleucinas, fator VIII, insulina, hormônio do crescimento, ativador do plasminogênio tecidual, vacina contra hepatite B, anticorpos monoclonais para prevenir a rejeição em transplantes renais, diagnóstico medicamentos para detectar o HIV, etc. Esta circunstância pode ser explicada por vários motivos. Em primeiro lugar, durante muito tempo estes medicamentos e estirpes recombinantes de microrganismos foram tratados com cautela, temendo que pudesse ocorrer uma propagação descontrolada de microrganismos recombinantes ambientalmente perigosos. No entanto, hoje em dia estas preocupações foram largamente eliminadas. Em segundo lugar, a utilização de estirpes produtoras recombinantes envolve o desenvolvimento de processos tecnológicos complexos para a produção e isolamento de produtos alvo. O desenvolvimento de tecnologia para produção de medicamentos por meio de engenharia genética, testes pré-clínicos e clínicos geralmente custa significativamente mais dinheiro do que a obtenção de uma cepa. Em terceiro lugar, na produção de medicamentos pelo método de engenharia genética, surge sempre a questão sobre a identidade da substância activa produzida pela estirpe produtora recombinante com uma substância natural, ou seja, são necessários trabalhos de investigação destinados a comprovar a identidade, bem como por vezes resolver problemas adicionais para dar caráter natural ao produto.

Tabela 1. Medicamentos desenvolvidos com métodos biotecnológicos modernos

Ao determinar a viabilidade e relação custo-benefício dos métodos de engenharia genética para obtenção de medicamentos ou outros medicamentos em comparação com os métodos tradicionais, muitas circunstâncias são levadas em consideração, principalmente a disponibilidade deste método, sua relação custo-benefício, a qualidade do medicamento resultante, novidade, segurança do trabalho, etc.

O método da engenharia genética é o único utilizado para obter medicamentos caso o microrganismo natural ou as células animais e vegetais não sejam cultivadas em condições industriais. Por exemplo, o agente causador da sífilis ou do plasmódio da malária praticamente não cresce em meio nutriente artificial. Portanto, para obter medicamentos diagnósticos ou vacinas, recorrem à clonagem ou síntese de genes para antígenos protetores e sua integração em bactérias de fácil cultivo. Quando essas bactérias receptoras recombinantes são cultivadas, são obtidos os antígenos necessários, com base nos quais é criado um medicamento ou vacina para diagnóstico. Assim, já está sendo produzida uma vacina contra a hepatite B. O gene para o antígeno HBs do vírus da hepatite está incorporado na célula da levedura; Quando a levedura é cultivada, é produzido o antígeno HBs, a partir do qual a vacina é preparada.

O método de engenharia genética também é preferível nos casos em que o microrganismo é altamente patogênico e perigoso na produção industrial. Por exemplo, para obter medicamentos e vacinas para diagnóstico do HIV, eles preferem não cultivar o vírus em grandes quantidades, mas obter os antígenos necessários por meio da engenharia genética. Até à data, quase todos os principais antigénios do VIH (p24, gp41, gp!20, etc.) foram obtidos através do cultivo de estirpes recombinantes de E. coli ou leveduras capazes de produzir estes antigénios. Já foram criados medicamentos diagnósticos para detecção da AIDS com base em proteínas recombinantes.

O método de engenharia genética é utilizado quando as matérias-primas para obtenção do medicamento pelo método tradicional são escassas ou caras. Por exemplo, o interferon α de leucócitos é obtido a partir de leucócitos de sangue de um doador humano. A partir de 1 litro de sangue são obtidas 2,3 doses de interferon altamente concentrado. Um curso de tratamento para um paciente com câncer requer centenas de doses do medicamento. Portanto, a produção em massa e o uso de interferon leucocitário a partir do sangue não são realistas. A produção de interferon leucocitário por engenharia genética é muito mais econômica e não requer matéria-prima escassa (sangue). É obtido pelo cultivo de cepas recombinantes de bactérias (E. coli, pseudomonas) capazes de produzir interferon como resultado da inserção do gene do interferon α. A partir de 1 litro de cultura de bactérias recombinantes são obtidas 100.150 doses de interferon leucocitário com atividade de 106 UI. Obtenção de insulina natural. hormônio para tratamento do diabetes, baseado em sua extração do pâncreas de bovinos e suínos, é prejudicado pela escassez de matéria-prima. Além disso, o hormônio é de origem animal. Um método desenvolvido pela engenharia genética para produzir insulina humana através do cultivo de uma cepa recombinante de E. coli resolveu o problema de fornecer aos pacientes esse medicamento vital. A mesma situação é observada em relação ao hormônio do crescimento humano, obtido da glândula pituitária de pessoas falecidas. Este hormônio não foi suficiente para tratar o nanismo, acelerar a cicatrização de feridas, etc. A engenharia genética resolveu este problema: uma cultura de 1000 litros de uma cepa recombinante de E. coli é suficiente para obter hormônio suficiente para tratar o nanismo, por exemplo, em um país tão grande como os EUA.

Um grande grupo de imunocitocinas de origem endógena, que desempenham grande papel na regulação da imunidade, cooperação de células imunocompetentes e, portanto, utilizadas para fins terapêuticos e profiláticos de imunodeficiências, tumores e distúrbios do sistema imunológico, são obtidos principalmente por engenharia genética, uma vez que este método é mais eficaz que o tradicional. As imunocitocinas incluem interleucinas (existem 18 variedades: IL-1, IL-2... IL-18), mielopeptídeos, fator de crescimento, hormônios do timo. Todos eles são peptídeos produzidos por células imunocompetentes e têm efeito biológico, afetando a proliferação, diferenciação ou atividade fisiológica de células imunocompetentes e outras (linfócitos T e B, macrófagos). As imunocitocinas são obtidas pela cultura de células (linfócitos, macrófagos, etc.) em meio nutriente artificial. Porém, esse processo é complexo, a produção de imunocitocinas é insignificante e não tem significado prático. Portanto, a engenharia genética é utilizada para obter imunocitocinas. Já foram criadas cepas recombinantes de E. coli e outras cepas que produzem interleucinas (IL-1, 2, 6, etc.), fator de necrose tumoral, fator de crescimento de fibroblastos, etc. .

O método da engenharia genética é usado para obter produtos e medicamentos fundamentalmente novos que não existem na natureza. Por exemplo, somente com a ajuda da engenharia genética é possível obter vacinas vivas polivalentes recombinantes contendo antígenos de vários microrganismos. "Foi obtida uma cepa recombinante do vírus da vacina contra a varíola que produz o antígeno HBs do vírus da hepatite B, raiva e encefalite transmitida por carrapatos. Essas vacinas vivas são chamadas de vacinas vetoriais.

O método de engenharia genética também permite substituir "muitos métodos baseados na obtenção de produtos in vivo por métodos de obtenção desses produtos in vitro. Até recentemente, os soros diagnósticos, terapêuticos e profiláticos eram obtidos a partir do sangue de cavalos imunizados ou de doadores humanos vacinados. . Atualmente, este método caro e difícil está sendo substituído pela técnica de hibridoma para produção de anticorpos. Esta técnica é baseada na produção de células de hibridoma pela fusão de linfócitos B retirados de animais imunizados e células de mieloma (câncer). célula (hibridoma) tem a capacidade da célula do mieloma de se multiplicar rapidamente em meio nutriente artificial e produzir anticorpos (assim como um linfócito B) contra o antígeno usado para imunização.

Os hibridomas produtores de anticorpos podem ser cultivados em larga escala em cultivadores ou máquinas especiais. Como os anticorpos produzidos por um hibridoma se originam de uma célula-mãe (linfócito B), eles são chamados de anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais são amplamente utilizados para criar medicamentos diagnósticos e, em alguns casos, também são utilizados para fins terapêuticos (em oncologia).

Os primeiros produtos OGM - antibióticos

Os antibióticos incluem substâncias de baixo peso molecular que diferem na estrutura química. O que estes compostos têm em comum é que, sendo produtos da actividade vital de microrganismos, perturbam especificamente o crescimento de outros microrganismos em concentrações insignificantes.

A maioria dos antibióticos são metabólitos secundários. Eles, assim como as toxinas e os alcalóides, não podem ser classificados como substâncias estritamente necessárias para garantir o crescimento e desenvolvimento dos microrganismos. Nesta base, os metabólitos secundários diferem dos primários, na presença dos quais ocorre a morte do microrganismo.

A biossíntese de antibióticos, como outros metabólitos secundários, geralmente ocorre em células que pararam de crescer (idiofase). O seu papel biológico na garantia da atividade vital das células produtoras ainda não foi totalmente explorado. Especialistas que estudam as perspectivas da biotecnologia no campo da produção microbiológica de antibióticos acreditam que, em condições desfavoráveis, eles suprimem o crescimento de microrganismos concorrentes, proporcionando assim condições mais favoráveis ​​para a sobrevivência do micróbio que produz um determinado antibiótico. A importância do processo de formação de antibióticos na vida de uma célula microbiana é confirmada pelo fato de que nos estreptomicetos, cerca de 1% do DNA genômico é representado por genes que codificam enzimas para a biossíntese de antibióticos, que podem não ser expressos por um período. muito tempo. Os produtores de antibióticos conhecidos são principalmente seis gêneros de fungos filamentosos, três gêneros de actinomicetos (quase 4.000 antibióticos diferentes) e dois gêneros de bactérias verdadeiras (aproximadamente 500 antibióticos). Entre os fungos filamentosos, atenção especial deve ser dada aos fungos mofados dos gêneros Cephalosporium e Penicillium, produtores dos chamados antibióticos betalactâmicos - penicilinas e cefalosporinas. A maioria dos actinomicetos que sintetizam substâncias antibióticas, incluindo tetraciclinas, pertencem ao gênero Streptomyces.

Das 5.000-6.000 substâncias antibióticas naturais conhecidas, apenas cerca de 1.000 são produzidas para venda aos consumidores. Na época em que o efeito antibacteriano da penicilina e a possibilidade de seu uso como medicamento foram estabelecidos (H.W. Flory, E.B. Chain et al., 1941), a produtividade da cepa de mofo de laboratório - 2 mg da droga por 1 litro de líquido de cultura - era claramente insuficiente para a produção industrial do antibiótico. A exposição sistemática repetida da cepa original de Penicillium chrisogenum a mutagênicos como raios X e irradiação ultravioleta, mostarda nitrogenada em combinação com mutações espontâneas e seleção dos melhores produtores, conseguiu aumentar a produtividade do fungo em 10.000 vezes e aumentar a concentração de penicilina no fluido de cultura para 2%.

O método de aumentar a eficiência de cepas produtoras de antibióticos, baseado em mutações aleatórias e que se tornou clássico, apesar dos enormes custos de mão de obra, ainda é utilizado até hoje. Esta situação é consequência do facto de um antibiótico, ao contrário de uma proteína, não ser produto de um gene específico; a biossíntese de antibióticos ocorre como resultado da ação combinada de 10 a 30 enzimas diferentes, codificadas por um número correspondente de genes diferentes. Além disso, para muitos antibióticos, cuja produção microbiológica foi estabelecida, os mecanismos moleculares da sua biossíntese ainda não foram estudados. O mecanismo poligênico subjacente à biossíntese de antibióticos é a razão pela qual as alterações nos genes individuais não levam ao sucesso. A automação de técnicas de rotina para análise da produtividade de mutantes permite estudar dezenas de milhares de cepas funcionais e, assim, agiliza o procedimento de seleção ao utilizar técnicas genéticas clássicas.

A nova biotecnologia, baseada na utilização de cepas superprodutoras de antibióticos, envolve a melhoria dos mecanismos de proteção do produtor contra o antibiótico que ele sintetiza.

Cepas resistentes a altas concentrações de antibióticos no meio de cultura apresentam alta produtividade. Esta propriedade também é levada em consideração no projeto de células superprodutoras. Desde a descoberta da penicilina no final da década de 1920, mais de 6.000 antibióticos foram isolados de vários microrganismos, com especificidades variadas e mecanismos de ação diferentes. A sua utilização generalizada para tratar doenças infecciosas ajudou a salvar milhões de vidas. A grande maioria dos principais antibióticos foi isolada da bactéria Gram-positiva do solo Streptomyces, embora também sejam produzidos por fungos e outras bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Todos os anos, são produzidas 100.000 toneladas de antibióticos em todo o mundo, avaliadas em aproximadamente 500 milhões de dólares, incluindo mais de 100 milhões de dólares em antibióticos adicionados à alimentação do gado como aditivos ou estimuladores de crescimento.

Estima-se que os cientistas descubram entre 100 e 200 novos antibióticos todos os anos, principalmente através de extensos programas de investigação que procuram entre milhares de microrganismos diferentes aqueles que sintetizam antibióticos únicos. A produção e os testes clínicos de novos medicamentos são muito caros e apenas são comercializados aqueles que têm grande valor terapêutico e interesse económico. Eles representam 1-2% de todos os antibióticos detectados. A tecnologia do DNA recombinante tem um grande efeito aqui. Em primeiro lugar, pode ser usado para criar novos antibióticos com uma estrutura única que tenham um efeito mais poderoso sobre certos microrganismos e tenham efeitos secundários mínimos. Em segundo lugar, as abordagens da engenharia genética podem ser utilizadas para aumentar o rendimento dos antibióticos e, consequentemente, reduzir o custo da sua produção.

Pode-se considerar que a biotecnologia clínica teve origem com o início da produção industrial da penicilina na década de 40. e seu uso na terapia. Aparentemente, o uso desta primeira penicilina natural teve um impacto maior na redução da morbidade e mortalidade do que qualquer outro medicamento, mas, por outro lado, levantou uma série de novos problemas que foram resolvidos, novamente, com a ajuda da biotecnologia.

Em primeiro lugar, o uso bem sucedido da penicilina criou uma grande necessidade deste medicamento e, para satisfazê-la, foi necessário aumentar drasticamente o rendimento da penicilina durante a sua produção. Em segundo lugar, a primeira penicilina - C (benzilpenicilina) - atuou principalmente sobre bactérias gram-positivas (por exemplo, estreptococos e estafilococos), sendo necessária a obtenção de antibióticos com espectro de ação e/ou atividade mais amplo que afetassem também bactérias gram-negativas. bactérias do tipo E. coli e Pseudomonas. Terceiro, como os antibióticos causavam reações alérgicas (na maioria das vezes menores, como erupções cutâneas, mas às vezes manifestações de anafilaxia mais graves e com risco de vida), era necessário ter uma variedade de agentes antibacterianos para que se pudesse escolher entre medicamentos igualmente eficazes. que não causaria alergias no paciente. Em quarto lugar, a penicilina é instável no ambiente ácido do estômago e não pode ser administrada por via oral. Finalmente, muitas bactérias tornam-se resistentes aos antibióticos. Um exemplo clássico disso é a formação, pelos estafilococos, da enzima beta-lactamase, que hidrolisa a ligação amida no anel beta-lactâmico da penicilina para formar ácido penicilóico farmacologicamente inativo. Foi possível aumentar o rendimento da penicilina durante sua produção principalmente devido ao uso sequencial de uma série de mutantes da cepa original de Penicillium chrysogenum, bem como pela alteração das condições de cultivo.

O processo de biossíntese de um antibiótico pode consistir em dezenas de reações enzimáticas, portanto clonar todos os genes para sua biossíntese não é uma tarefa fácil. Uma abordagem para isolar um conjunto completo de tais genes baseia-se na transformação de uma ou mais cepas mutantes que são incapazes de sintetizar um determinado antibiótico com um banco de clones criado a partir do DNA cromossômico de uma cepa do tipo selvagem. Após a introdução do banco de clones nas células mutantes, são selecionados transformantes capazes de sintetizar o antibiótico. Em seguida, o DNA plasmidial do clone contendo o gene funcional do antibiótico expressivo (ou seja, o gene que restaura a função perdida pela cepa mutante) é isolado e usado como sonda para triagem de outro banco de clones de DNA cromossômico da cepa do tipo selvagem. , a partir dos quais são selecionados clones contendo sequências de nucleotídeos que se sobrepõem à sequência da sonda. Desta forma, os elementos de DNA adjacentes à sequência complementar são identificados e depois clonados, e o agrupamento completo de genes da biossíntese de antibióticos é recriado. O procedimento descrito se aplica ao caso em que esses genes estão agrupados em um sítio do DNA cromossômico. Se os genes da biossíntese estiverem espalhados na forma de pequenos aglomerados em locais diferentes, então você precisa ter pelo menos um mutante por aglomerado para obter clones de DNA com os quais seja possível identificar os genes restantes dos aglomerados.

Utilizando experiências genéticas ou bioquímicas, é possível identificar e depois isolar uma ou mais enzimas biossintéticas chave, determinar as suas sequências de aminoácidos N-terminais e, com base nestes dados, sintetizar sondas oligonucleotídicas. Esta abordagem foi usada para isolar o gene da isopenicilina N sintetase de Penicillium chrysogenum.

Novos antibióticos com propriedades e especificidade únicas podem ser obtidos através da realização de manipulações de engenharia genética com genes envolvidos na biossíntese de antibióticos já conhecidos. Um dos primeiros experimentos em que um novo antibiótico foi obtido consistiu na combinação de duas vias ligeiramente diferentes de biossíntese de antibióticos em um microrganismo.

Desenvolvimento de novos métodos para obtenção de antibióticos policiais modernos.

O termo “policetídeo” refere-se a uma classe de antibióticos que são formados como resultado da condensação enzimática sequencial de ácidos carboxílicos, como acetato, propionato e butirato. Alguns antibióticos policetídeos são sintetizados por plantas e fungos, mas a maioria deles é produzida por actinomicetos na forma de metabólitos secundários. Antes de manipular os genes que codificam enzimas para a biossíntese de antibióticos policetídeos, foi necessário elucidar o mecanismo de ação dessas enzimas.

Tendo estudado detalhadamente os componentes genéticos e bioquímicos da biossíntese da eritromicina em células de Saccharopolyspora erythraea, foi possível fazer alterações específicas nos genes associados à biossíntese deste antibiótico e sintetizar derivados da eritromicina com outras propriedades. Esses experimentos permitiram mostrar que se um conjunto de genes que codificam enzimas para a biossíntese de um determinado antibiótico policetídeo for identificado e caracterizado, então, ao introduzir neles alterações específicas, será possível alterar especificamente a estrutura do antibiótico.

Além disso, cortando e unindo certas seções do DNA, é possível mover domínios da policetídeo sintase e obter novos antibióticos policetídeos.

Tecnologia de DNA para melhorar a produção de antibióticos.

Com a ajuda da engenharia genética, é possível não só criar novos antibióticos, mas também aumentar a eficiência da síntese dos já conhecidos. O fator limitante na produção industrial de antibióticos é o Streptomyces spp. Freqüentemente, a quantidade de oxigênio disponível para as células. Devido à baixa solubilidade do oxigênio na água e à alta densidade da cultura de Streptomyces, muitas vezes é insuficiente, o crescimento celular diminui e o rendimento do antibiótico é reduzido. Para resolver este problema, é possível, em primeiro lugar, alterar o desenho dos biorreatores onde a cultura de Streptomyces é cultivada e, em segundo lugar, através de métodos de engenharia genética, criar cepas de Streptomyces que utilizem de forma mais eficiente o oxigênio disponível. Estas duas abordagens não são mutuamente exclusivas.

Uma estratégia utilizada por alguns microrganismos aeróbios para sobreviver em condições de deficiência de oxigênio é sintetizar um produto semelhante à hemoglobina que possa acumular oxigênio e distribuí-lo às células. Por exemplo, a bactéria aeróbica Vitreoscilla sp. Sintetiza uma proteína homodimérica contendo heme, funcionalmente semelhante à hemoglobina eucariótica. O gene da “hemoglobina” de Vitreoscilla foi isolado, inserido em um vetor plasmídico de Streptomyces e introduzido nas células desse microrganismo. Uma vez expressa, a hemoglobina de Vitreoscilla representou aproximadamente 0,1% de todas as proteínas celulares de S. coelicoior, mesmo quando a expressão estava sob o controle do próprio promotor do gene da hemoglobina de Vitreoscilla, em vez do de Streptomyces. Células transformadas de S. coelicoior crescendo com baixo teor de oxigênio dissolvido (aproximadamente 5% da concentração saturante) sintetizaram 10 vezes mais actinorodina por 1 g de massa celular seca e tiveram uma taxa de crescimento maior do que as células não transformadas. Esta abordagem também pode ser usada para fornecer oxigênio a outros microrganismos que crescem em condições de deficiência de oxigênio.

A matéria-prima para a síntese química de algumas cefalosporinas - antibióticos que apresentam efeitos colaterais menores e são ativos contra muitas bactérias - é o ácido 7-aminocefalosporânico (7ASA), que por sua vez é sintetizado a partir do antibiótico cefalosporina C. Infelizmente, microrganismos naturais capazes de sintetizar 7ACA ainda não foi identificado.

Uma nova via para a biossíntese de 7ACA foi construída através da incorporação de genes específicos no plasmídeo do fungo Acremonium chrysogenum, que normalmente sintetiza apenas cefalosporina-C. Um desses genes foi representado pelo cDNA do fungo Fusarium solani, codificando a D-aminoácido oxidase, e o outro veio do DNA genômico de Pseudomonas diminuta e codificou a cefalosporina acilase. No plasmídeo, os genes estavam sob o controle do promotor de A. chrysogenum.

Interferons

No final dos anos 70 - início dos anos 80. No século XX, a tecnologia do DNA começou a atrair a atenção do público e dos grandes investidores. Um dos produtos biotecnológicos promissores era o interferon, que na época era esperado como uma cura milagrosa contra muitas doenças virais e o câncer. O isolamento do cDNA do interferão humano e a sua subsequente expressão em Escherichia coli foi relatado por todas as publicações interessadas no mundo.

Várias abordagens são usadas para isolar genes ou proteínas humanas. Normalmente, a proteína desejada é isolada e a sequência de aminoácidos da parte correspondente da molécula é determinada. Com base nisso, a sequência de nucleotídeos que a codifica é encontrada, o oligonucleotídeo correspondente é sintetizado e usado como uma sonda de hibridização para isolar o gene ou cDNA desejado a partir de bibliotecas genômicas ou de cDNA. Outra abordagem é gerar anticorpos para a proteína purificada e utilizá-los para rastrear bibliotecas nas quais genes específicos são expressos. Para proteínas humanas sintetizadas predominantemente num único tecido, uma biblioteca de ADNc derivada de ARNm isolado desse tecido será enriquecida para a sequência de ADN alvo. Por exemplo, a principal proteína sintetizada pelas células das ilhotas de Langerhans do pâncreas é a insulina, e 70% do mRNA isolado dessas células a codifica.

No entanto, o princípio do enriquecimento de ADNc não é aplicável às proteínas humanas cuja quantidade é muito pequena ou cujo local de síntese é desconhecido. Neste caso, outras abordagens experimentais podem ser necessárias. Por exemplo, os interferões humanos (IF), incluindo os interferões alfa, beta e gama, são proteínas naturais, cada uma das quais pode ter a sua própria utilização terapêutica. O primeiro gene do interferon foi isolado no início dos anos 80. Século XX. Desde então, vários interferons diferentes foram descobertos. Um polipeptídeo que tem efeito do interferon leucocitário humano é sintetizado em E. coli.

Várias características do interferon tornaram o isolamento do seu cDNA particularmente difícil. Em primeiro lugar, apesar de o interferão ter sido purificado mais de 80.000 vezes, só pôde ser obtido em quantidades muito pequenas, porque sua massa molecular exata não era conhecida na época. Em segundo lugar, ao contrário de muitas outras proteínas, o interferão não tem actividade química ou biológica facilmente identificável: foi avaliado apenas através da redução do efeito citopático de um vírus animal numa cultura celular, e este é um processo complexo e demorado. Terceiro, ao contrário da insulina, não se sabia se existiam células humanas capazes de produzir interferão em quantidades suficientemente grandes, ou seja, Existe uma fonte de mRNA de interferon? Apesar de todas estas dificuldades, o cDNA que codifica o interferão foi eventualmente isolado e caracterizado. Ao isolar os seus cDNAs, foi necessário desenvolver uma abordagem especial para superar as dificuldades associadas ao conteúdo insuficiente dos mRNA e proteínas correspondentes. Agora, este procedimento para isolamento de DNA é comum e padrão e para interferons é o seguinte.

1. O mRNA foi isolado de leucócitos humanos e fracionado por tamanho; a transcrição reversa foi realizada e inserida no sítio do plasmídeo.

2. O produto resultante foi transformado em Escherichia coli. Os clones resultantes foram divididos em grupos. Os testes foram realizados em um grupo de clones, o que permitiu agilizar o processo de sua identificação.

3. Cada grupo de clones foi hibridado com uma preparação bruta de ARNm de IF.

4. A partir dos híbridos resultantes contendo ADN clonado e ARNm, o ARNm foi isolado e traduzido num sistema de síntese proteica isento de células.

5. Foi determinada a atividade antiviral do interferon de cada mistura obtida como resultado da tradução. Os grupos que apresentaram atividade de interferon continham um clone com cDNA hibridizado com IF-mRNA.

6. Os grupos positivos foram divididos em subgrupos contendo vários clones e testados novamente. O subgrupo foi repetido até que um clone contendo cDNA de IF humano completo fosse identificado.

Desde então, vários tipos diferentes de interferons foram descobertos. Os genes de vários interferons foram isolados e sua eficácia foi demonstrada no tratamento de diversas doenças virais, mas, infelizmente, o interferon não se tornou uma panacéia.

Com base nas propriedades químicas e biológicas do interferon, três grupos podem ser distinguidos: IF-alfa, IF-beta e IF-gama. O IF-alfa e o IF-beta são sintetizados por células tratadas com drogas de vírus ou RNA viral, e o IF-gama é produzido em resposta à ação de substâncias que estimulam o crescimento celular. O IF-alfa é codificado por uma família de genes que compreende pelo menos 15 genes não alélicos, enquanto o IF-beta e o IF-gama são codificados por um único gene cada. Os subtipos IF-alfa exibem especificidades diferentes. Por exemplo, ao testar a eficácia de IF-alfa-1 e IF-alfa-2 numa linha celular bovina tratada com vírus, estes interferões mostraram actividade antiviral semelhante, mas no caso de células humanas tratadas com vírus, IF-alfa- 2 foi sete vezes mais ativo que o IF-alfa-1. Quando a atividade antiviral é testada em células de camundongos, o IF-alfa-2 parece ser 30 vezes menos eficaz que o IF-alfa-1.

Como existe uma família de interferons, foram feitas diversas tentativas para criar IFs com propriedades combinadas, aproveitando o fato de que diferentes membros da família IF-alfa variam na extensão e especificidade de sua atividade antiviral. Teoricamente, isto pode ser conseguido combinando partes das sequências genéticas de diferentes IF-alfas. Isto resultará na formação de uma proteína híbrida com propriedades diferentes de cada uma das proteínas originais. A comparação das sequências de cDNA de IF-alfa-1 e IF-alfa-2 mostrou que elas contêm os mesmos locais de restrição. Após clivagem de ambos os cDNAs nestes locais e subsequente ligação dos fragmentos, foram obtidos vários genes híbridos. Esses genes foram expressos em E. coli, as proteínas sintetizadas foram purificadas e suas funções biológicas estudadas. Testar as propriedades protetoras dos IFs híbridos em culturas de células de mamíferos mostrou que alguns deles exibem maior atividade do que as moléculas parentais. Além disso, muitos IFs híbridos induziram a formação de 2"-5"-oligoisoadenilato sintetase em células de controle. Esta enzima está envolvida na síntese de oligonucleotídeos ligados em 2"-5", que por sua vez ativam a endorribonuclease celular latente, que cliva o mRNA viral. Outros IFs híbridos exibiram maior actividade antiproliferativa do que as suas moléculas parentais em culturas de várias células cancerígenas humanas.

Um hormônio de crescimento

A estratégia de construção de novas proteínas através da substituição de domínios funcionais ou por mutagénese dirigida pode ser utilizada para aumentar ou enfraquecer a propriedade biológica de uma proteína. Por exemplo, o hormônio do crescimento humano nativo (HGH) liga-se em diferentes tipos de células ao receptor do hormônio do crescimento e ao receptor da prolactina. Para evitar efeitos colaterais indesejados durante o tratamento, é necessário excluir a ligação do hGH ao receptor de prolactina. Como a porção da molécula do hormônio do crescimento que se liga a esse receptor é apenas parcialmente idêntica em sua sequência de aminoácidos à porção da molécula que interage com o receptor da prolactina, foi possível reduzir seletivamente a ligação do hormônio a este último. Para tanto, foi utilizada mutagênese sítio-específica, como resultado da qual ocorreram certas alterações nos grupos laterais de alguns aminoácidos - ligantes para íons Zn2+ necessários para a ligação de alta afinidade do hGH ao receptor de prolactina. O hormônio do crescimento modificado liga-se apenas ao “seu” receptor. Os resultados obtidos são de interesse indiscutível, mas ainda não está claro se o hGH modificado pode encontrar aplicação clínica.

Fibrose cística

A doença hereditária fatal mais comum entre os caucasianos é a fibrose cística. Nos Estados Unidos foram identificados 30.000 casos desta doença, no Canadá e em países europeus - 23.000.Pacientes com fibrose cística muitas vezes sofrem de doenças infecciosas que afetam os pulmões. O tratamento de infecções recorrentes com antibióticos eventualmente leva ao surgimento de cepas resistentes de bactérias patogênicas. As bactérias e seus produtos de lise causam o acúmulo de muco viscoso nos pulmões, dificultando a respiração. Um dos componentes do muco é o DNA de alto peso molecular, que é liberado das células bacterianas durante a lise. Cientistas da empresa de biotecnologia Genentech (EUA) isolaram e expressaram o gene DNase, enzima que divide o DNA de alto peso molecular em fragmentos mais curtos. A enzima purificada é administrada em aerossol nos pulmões de pacientes com fibrose cística, quebra o DNA, a viscosidade do muco diminui, o que facilita a respiração. Embora essas medidas não curem a fibrose cística, elas aliviam o quadro do paciente. A enzima foi recentemente aprovada pelo Departamento de Alimentos, Medicamentos e Cosméticos dos EUA e gerou vendas de aproximadamente US$ 100 milhões em 2000.

Outro produto biotecnológico que auxilia os pacientes é o alginato liase. O alginato é um polissacarídeo sintetizado por diversas algas marinhas, bem como por bactérias do solo e marinhas. Suas unidades monoméricas são dois sacarídeos - beta-D-manuronato e alfa-1-guluronato, cujo conteúdo relativo e distribuição determinam as propriedades de um alginato específico. Assim, os resíduos de a-L-guluronato formam ligações cruzadas intercadeias e intracadeias ligando-se a iões de cálcio; resíduos de beta-D-manuronato ligam-se a outros íons metálicos. O alginato contendo tais ligações cruzadas forma um gel elástico, cuja viscosidade é diretamente proporcional ao tamanho das moléculas de polissacarídeo.

A secreção de alginato por cepas mucosas de Pseudomonas aeruginosa aumenta significativamente a viscosidade do muco em pacientes com fibrose cística. Para desobstruir as vias aéreas e proporcionar alívio aos pacientes, além do tratamento com DNase, a despolimerização do alginato deve ser realizada com alginato liase.

O gene da alginato liase foi isolado de Flavobacterium sp., uma bactéria Gram-negativa do solo que produz ativamente esta enzima. Com base em E. coli, foi criado um banco de clones de Flavobacterium e aqueles que sintetizam alginato liase foram selecionados plaqueando todos os clones em meio sólido contendo alginato suplementado com íons cálcio. Sob tais condições, todo o alginato presente no meio, com exceção daquele que circunda as colônias produtoras de alginato liase, forma reticulações e torna-se turvo. O alginato hidrolisado perde a capacidade de formar ligações cruzadas, de modo que o ambiente ao redor das colônias que sintetizam o alginato liase permanece transparente. A análise de um fragmento de DNA clonado presente em uma das colônias positivas mostrou a presença de um quadro de leitura aberto que codifica um polipeptídeo com peso molecular de cerca de 69.000. Estudos bioquímicos e genéticos mais detalhados mostraram que este polipeptídeo parece ser o precursor de três alginatos liases produziram Flavobacterium sp. Primeiro, alguma enzima proteolítica corta o peptídeo N-terminal com uma massa de cerca de 6.000. A proteína restante com um peso molecular de 63.000 é capaz de despolimerizar o alginato produzido por bactérias e algas. Quando é posteriormente cortado, produz um produto de peso molecular 23.000 que despolimeriza o alginato de algas marinhas e uma enzima de peso molecular 40.000 que degrada o alginato bacteriano. Para obter grandes quantidades da enzima com peso molecular de 40.000, o DNA que a codifica foi amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR) e depois inserido em um vetor plasmídeo isolado de B.subrjlis, carregando o gene que codifica o α- de B.subrjlis. peptídeo sinal da amilase. A transcrição foi monitorada usando um sistema de expressão gênica da penicilinase. Quando células de B. subrjlis foram transformadas com o plasmídeo resultante e plaqueadas em meio sólido contendo alginato com adição de íons cálcio, formaram-se colônias com um grande halo. Quando tais colónias foram cultivadas em meio líquido, a alginato liase recombinante foi libertada no meio de cultura. Testes subsequentes mostraram que esta enzima foi capaz de liquefazer com eficácia alginatos sintetizados por cepas mucosas de P. aeruginosa isoladas de pulmões de pacientes com fibrose cística. Pesquisas adicionais são necessárias para determinar se os testes clínicos de alginato liase recombinante são viáveis.

Prevenção da rejeição de órgãos transplantados.

Na década de 1970 As opiniões sobre a imunização passiva foram revisadas: ela passou a ser considerada um meio preventivo de combate à rejeição de órgãos transplantados. Foi proposto injetar nos pacientes anticorpos específicos que se ligassem a um determinado tipo de linfócito, reduzindo a resposta imunológica dirigida contra o órgão transplantado.

As primeiras substâncias recomendadas pelo Departamento de Alimentos, Medicamentos e Cosméticos dos EUA para uso como imunossupressores em transplantes de órgãos humanos foram os anticorpos monoclonais de camundongo OKTZ. As chamadas células T, linfócitos que se diferenciam no timo, são responsáveis ​​pela rejeição do órgão. OKTZ se liga a um receptor encontrado na superfície de qualquer célula T chamado CD3. Isso evita o desenvolvimento de uma resposta imunológica completa e a rejeição do órgão transplantado. Este tipo de imunossupressão é muito eficaz, embora apresente alguns efeitos colaterais, como febre e erupção cutânea.

Técnicas foram desenvolvidas para produzir anticorpos usando E. coli. Os hibridomas, como a maioria das outras culturas de células animais, crescem de forma relativamente lenta, não atingem densidades elevadas e requerem meios complexos e caros. Os anticorpos monoclonais assim obtidos são muito caros, o que não permite a sua ampla utilização na clínica.

Para resolver este problema, foram feitas tentativas de criar uma espécie de “biorreatores” baseados em bactérias, plantas e animais geneticamente modificados. Para estes fins, foram introduzidas construções genéticas capazes de codificar regiões de anticorpos individuais no genoma do hospedeiro. Para distribuição e funcionamento eficazes de alguns agentes imunoterapêuticos, uma região de ligação ao antígeno de um anticorpo (fragmento Fab ou Fv) é frequentemente suficiente, isto é, a presença do fragmento Fc do anticorpo é opcional.

Plantas GM - produtoras de medicamentos farmacológicos

Hoje, as perspectivas de que a biotecnologia agrícola forneça plantas que possam ser utilizadas como medicamentos ou vacinas são cada vez mais realistas.

Dentre os genes cuja expressão em plantas é considerada exótica, os mais importantes são aqueles que codificam a síntese de polipeptídeos de importância médica. Obviamente, o primeiro estudo realizado nesta área deve ser considerado a patente da Calgene sobre a expressão do interferon de camundongo em células vegetais. Posteriormente, foi demonstrada a síntese de imunoglobulinas nas folhas das plantas.

Além disso, é possível introduzir no genoma da planta um gene que codifica a proteína do envelope (proteínas) de um vírus. Ao consumir a planta como alimento, as pessoas vão adquirindo gradativamente imunidade a esse vírus. Em essência, esta é a criação de medicamentos fitoterápicos.

As plantas transgênicas apresentam uma série de vantagens em comparação ao cultivo de células microbianas, animais e humanas para a produção de proteínas recombinantes. Dentre as vantagens das plantas transgênicas, destacamos as principais: possibilidade de produção em larga escala, baixo custo, facilidade de purificação, ausência de impurezas que tenham efeitos alergênicos, imunossupressores, carcinogênicos, teratogênicos e outros ao homem. As plantas podem sintetizar, glicosilar e montar proteínas de mamíferos a partir de subunidades. Ao consumir vegetais crus e frutas que carregam genes que codificam a síntese das proteínas da vacina, ocorre a imunização oral.

Uma forma de reduzir o risco de fuga de genes para o ambiente, utilizada, nomeadamente, na criação de vacinas comestíveis, é introduzir genes estranhos nos cloroplastos, e não nos cromossomas nucleares, como é habitual. Acredita-se que este método ampliará o escopo de aplicação das plantas GM. Apesar de ser muito mais difícil introduzir os genes desejados nos cloroplastos, este método tem várias vantagens. Uma delas é que o DNA estranho dos cloroplastos não consegue entrar no pólen. Isto elimina completamente a possibilidade de transferência descontrolada de material GM.

Usando tecnologia de DNA para desenvolver vacinas

Uma direção promissora é a criação de plantas transgênicas que carreguem genes para proteínas características de bactérias e vírus causadores de doenças infecciosas. Ao consumir frutas e vegetais crus que carregam esses genes, ou seus sucos liofilizados, o corpo é vacinado. Por exemplo, quando o gene para a subunidade não tóxica da enterotoxina da cólera foi introduzido em plantas de batata e tubérculos crus foram dados a ratos experimentais, anticorpos contra patógenos da cólera foram formados em seus corpos. É claro que tais vacinas comestíveis poderiam ser um método eficaz, simples e barato de proteger as pessoas e garantir a segurança alimentar em geral.

O desenvolvimento da tecnologia do DNA nas últimas décadas revolucionou o desenvolvimento e a produção de novas vacinas. Utilizando métodos de biologia molecular e engenharia genética, foram identificados os determinantes antigênicos de muitos agentes infecciosos, clonados os genes que codificam as proteínas correspondentes e, em alguns casos, estabelecida a produção de vacinas baseadas nas subunidades proteicas desses antígenos. A diarreia causada por infecção por Vibrio cholerae ou Escherichia coli enterotoxigênica é uma das doenças mais perigosas e com alta taxa de mortalidade, principalmente em crianças. O número total de doenças de cólera no mundo ultrapassa 5 milhões de casos anualmente, resultando em cerca de 200 mil mortes. Por isso, a Organização Mundial da Saúde (OMS) está atenta à prevenção das infecções diarreicas, estimulando de todas as formas possíveis a criação de uma variedade de vacinas contra essas doenças. Surtos de cólera ocorrem em nosso país, principalmente nas regiões sul.

As doenças bacterianas diarreicas também estão disseminadas em animais de criação e aves, principalmente em animais jovens, o que causa grandes perdas nas explorações como resultado da perda de peso e da mortalidade do gado.

Um exemplo clássico de vacina recombinante obtida com a ajuda de microrganismos é a produção do antígeno de superfície da hepatite B. O gene viral HbsAg foi inserido em um plasmídeo de levedura, e como resultado a proteína viral começou a ser sintetizada em levedura em grandes quantidades , que, após purificação, é utilizado para injeção como uma vacina eficaz contra a hepatite (Pelre et al., 1992).

Muitos países do sul com alta incidência de hepatite realizam vacinação universal da população, inclusive crianças, contra esta doença. Infelizmente, o custo desta vacina é relativamente elevado, o que dificulta a disseminação generalizada de programas de vacinação universais em países com baixos padrões de vida. Em conexão com esta situação, no início dos anos 90, a OMS tomou a iniciativa de criar novas tecnologias para a produção de vacinas baratas contra doenças infecciosas, disponíveis para todos os países do mundo.

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De acordo com dados modernos, a artrite reumatóide (AR) afeta cerca de 0,7% da população mundial (cerca de 0,42% na Federação Russa), com o número máximo de casos da doença observado na faixa etária de 35 a 50 anos. A falta de eficácia e o frequente desenvolvimento de efeitos colaterais dos medicamentos de terapia básica tornam necessária a busca de novos métodos de tratamento desta nosologia.

A patogênese da AR é o desenvolvimento de inflamação autoimune, levando à destruição das articulações, do tecido periarticular, bem como a distúrbios sistêmicos generalizados. De particular importância, juntamente com a ativação dos linfócitos T CD4+, é a hipersecreção de citocinas pró-inflamatórias: interleucinas (IL-1, IL-8, IL-18) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), contra o pano de fundo de uma deficiência de peptídeos antiinflamatórios (IL -4, IL-10, TNF-β) . O TNF-α ativa os linfócitos B, que produzem grandes quantidades de fatores reumatóides (IgM, IgG) para o fragmento Fc alterado de IgG. Esses complexos imunes determinam o desenvolvimento de manifestações viscerais da AR. Além disso, o TNF-α promove a ativação da atividade proliferativa de fibroblastos, sinoviócitos, células endoteliais no tecido sinovial, o que leva à formação de pannus - tecido que infiltra a cartilagem articular, a superfície articular do osso e o aparelho ligamentar da articulação . Assim, o TNF-α pode servir como um dos “alvos” na terapia da AR.

A farmacoterapia para AR baseia-se no uso de antiinflamatórios básicos, glicocorticóides e antiinflamatórios não esteroidais (AINEs).

A terapia com AINE visa controlar os sintomas produtivos - dor, inflamação, inchaço - e não pode ser utilizada como monoterapia, pois não impede a progressão da doença. Além disso, esses medicamentos causam o desenvolvimento de uma série de efeitos colaterais indesejáveis ​​(danos à membrana mucosa do trato gastrointestinal com desenvolvimento de lesões ulcerativas, patologia cardiovascular, reações alérgicas, etc.).

Os glicocorticoides são indicados para uso na AR em caso de ineficácia ou contraindicação ao uso de AINEs e antiinflamatórios básicos. O medicamento mais comum neste grupo é a prednisolona. Para suprimir a inflamação ativa em pouco tempo, é possível utilizar pulsoterapia com metilprednisolona e dexametasona. Contudo, este tipo de tratamento é limitado pela possibilidade de desenvolvimento de fraturas osteoporéticas, infecções graves, hiperglicemia e outros efeitos colaterais.

O papel principal no tratamento da AR é atribuído aos antiinflamatórios básicos: citostáticos (metotrexato, ciclofosfamida, azatioprina, etc.), preparações de ouro, derivados do ácido 5-aminossalicílico, inibidores da metaloproteinase de matriz. Seu uso permite alcançar a remissão por um longo tempo. A eficácia desta terapia baseia-se na imunossupressão. As limitações no uso desses medicamentos devem-se à sua alta toxicidade e à ampla gama de efeitos colaterais (imunossupressão grave, pancitopenia, etc.), que, em alguns casos, exigem a interrupção do tratamento.

Os tipos de farmacoterapia apresentados para AR, devido a uma série de suas qualidades negativas (desenvolvimento de resistência ao tratamento, falta de remissão estável a longo prazo, alta toxicidade, ampla gama de efeitos colaterais e contra-indicações) mostram a necessidade de introdução de métodos de tratamento inovadores , que é a terapia anticitocina, que pertence ao grupo dos medicamentos biológicos geneticamente modificados (GBP).

Os BIBPs afetam diretamente os principais elos no desenvolvimento da inflamação autoimune - TNF-α, IL-1, IL-6, linfócitos T e B e são representados pelas seguintes classes: inibidores de TNF e IL, antígenos de superfície de linfócitos, recombinantes moléculas - receptores de citocinas, análogos de moléculas ativadoras de linfócitos T e B. Assim, vários medicamentos biologicamente ativos são inibidores seletivos da síntese de citocinas pró-inflamatórias e da atividade linfocitária.

A principal vantagem da terapia biológica por engenharia genética é a máxima seletividade do efeito sobre os mecanismos do sistema imunológico sem afetar as células de outros órgãos e sistemas.

O uso de anticitocinas (infliximabe, adalimumabe, etc.) é especialmente indicado em caso de resistência à terapia anterior com antiinflamatórios básicos. Seu uso pode reduzir a atividade da inflamação autoimune, retardando a progressão da AR. A inibição dose-dependente da destruição óssea em pacientes com AR foi estabelecida de forma confiável ao prescrever inibidores de TNF-α. A desaceleração do processo erosivo em pacientes com AR durante o tratamento com TNF-α monoclonal se deve ao fato de que o bloqueio dessa citocina com anticorpos leva à diminuição não só da função, mas também da proliferação de osteoclastos na presença do receptor de ativação do ligante do fator B nuclear.

Os inibidores do TNF-α tendem a atingir um efeito clínico durante as primeiras 12-24 semanas de terapia e, frequentemente, nos primeiros dias de tratamento. O efeito dura 12 meses ou mais. O efeito mais pronunciado dos medicamentos do grupo GEBD é detectado quando são prescritos precocemente, bem como em combinação com componentes da terapia padrão (em particular, metotrexato). A combinação de metotrexato com infliximabe é mais eficaz que a monoterapia com metotrexato.

Alguns pacientes apresentam ineficácia primária dos inibidores do TNF-α, que está associada ao aparecimento de anticorpos contra eles. Essa complicação pode ser evitada com a prescrição de outro GEBD com mecanismo de ação diferente.

A administração de anticorpos anticitocinas deve ser combinada com a identificação de doenças infecciosas latentes e apagadas, pois nas condições desta terapia aumenta o risco de exacerbação de doenças infecciosas virais e bacterianas latentes do trato respiratório (pneumonia) e do sistema urinário. É possível o desenvolvimento de uma infecção específica grave: tuberculose pulmonar (exigindo radiografia de tórax e reação de Mantoux), hepatite viral, leucoencefalopatia multifocal progressiva, lesões pustulosas da pele e tecidos moles. Existe risco aumentado de malignidade no caso do uso de medicamentos biologicamente ativos em doses superiores às prescritas pelo fabricante. Além disso, a terapia com certos medicamentos anticitocinas, segundo alguns dados, está associada à possibilidade de desenvolver linfoma. Outros efeitos indesejáveis ​​da terapia anticitocina incluem reações pós-infusão nas primeiras 2 horas: falta de ar, hipertensão leve e pirexia. Devido a possíveis complicações, está indicada preliminarmente a administração intravenosa de 100 mg de metilprednisolona. Com a administração subcutânea, podem ocorrer coceira, inchaço e hiperemia no local da injeção. Possível desenvolvimento de reações anafilactóides.

O uso limitado de medicamentos biologicamente ativos em reumatologia, bem como em outras áreas da medicina, está associado ao alto custo de um tratamento. No entanto, o uso de medicamentos biológicos geneticamente modificados, apesar de uma série de efeitos indesejáveis, é uma direção promissora no tratamento da artrite reumatóide em combinação com o tratamento padrão ou como monoterapia.

Link bibliográfico

A engenharia genética para a artrite reumatóide é uma nova ferramenta no tratamento de doenças de natureza autoimune, que visa restaurar as funções imunológicas do organismo.

A insidiosidade da doença reside no fato de ser causada por falhas nos processos imunológicos, extremamente difíceis de prever e tratar. Esta é a diferença entre a AR e outras doenças semelhantes - reumatismo, artrite reumática, traumática, infecciosa e outros tipos de artrite. Portanto, é necessário tratar esse tipo de doença influenciando os processos imunológicos do organismo.

A terapia com produtos biológicos ainda não ganhou a devida popularidade devido ao custo impressionante desse tipo de medicamento. No entanto, a engenharia genética moderna introduz constantemente novos desenvolvimentos e métodos de produção de medicamentos, a fim de disponibilizá-los a um círculo mais amplo de pessoas.

Falaremos sobre como tratar a artrite reumatoide com células-tronco – tipos de produtos biológicos, suas vantagens e características – neste artigo.

Breve revisão

Os produtos biológicos geneticamente modificados (GEBPs) são desenvolvidos com base em anticorpos de etiologia murina, humana, quimérica ou humanizada.

Estas são as chamadas imunoglobulinas - células imunológicas sintetizadas artificialmente. Uma vez no corpo humano, eles suprimem e destroem células virais, bactérias patogênicas e infecções. Portanto, os medicamentos monoclonais para a artrite reumatóide são uma forma eficaz de eliminar completamente a causa da doença e restaurar a alegria de viver do paciente.

Os medicamentos de engenharia genética usados ​​para a artrite reumatóide são produzidos na seguinte ordem:

• Aumentar artificialmente a imunidade de animais de laboratório.
• Eles estimulam a produção de agentes imunológicos que suprimem certos grupos genéticos.
• São isolados clones de células que estimulam o processo de cicatrização dos tecidos do corpo de forma independente.

Na produção de engenharia genética, para a obtenção de anticorpos monoclonais, pratica-se a utilização de bacteriófagos - vírus que suprimem o crescimento de certos microrganismos portadores de material genético.

Vantagens da terapia

Os anticorpos monoclonais para a artrite reumatóide ajudam a eliminar a causa raiz da doença. Além disso, a bioterapia gênica também pode aliviar outras doenças de etiologia autoimune, oncológica, pneumológica, dermatológica e normalizar o processo de adaptação do órgão transplantado.

O tratamento da artrite reumatóide com base em suplementos dietéticos geneticamente modificados ajuda a suprimir a atividade das células autoimunes que rejeitam e destroem o tecido cartilaginoso das articulações. Este efeito terapêutico inibe a progressão do processo destrutivo e a doença desaparece.

Os corpos monoclonais para a artrite reumatóide têm demonstrado grande eficácia como medicamentos básicos que atuam na causa raiz do desenvolvimento da doença - uma falha autoimune.

Segundo os médicos, os medicamentos à base de células estaminais ajudam a melhorar significativamente o estado da cartilagem e do tecido ósseo numa grande variedade de articulações: joelho, tornozelo, mão, etc.

Variedades

Os seguintes tipos de medicamentos podem ser usados ​​na terapia de engenharia genética para AR:

1. Produzido a partir de anticorpos de camundongo. Esses medicamentos (Infliximabe) são considerados medicamentos de 1ª geração, já estão significativamente desatualizados e raramente são usados.
2. Terapêutica humanizada, que é um híbrido de anticorpos de camundongo e células humanas com alto nível de interação.
3. Os produtos biológicos baseados em células imunológicas humanas são os mais eficazes e populares na medicina genética. Existem muitos nomes deles - Alemtuzumab, Ramucirumab, Elotuzumab, Trastuzumab, Blinatumomab.
4. Medicamentos biológicos para artrite reumatóide, constituídos por um quarto de anticorpos de camundongo (Remicade).

Tomando medicamentos

O tratamento biológico da AR é um processo longo. Os medicamentos de engenharia genética destinam-se à administração por infusão. Os medicamentos são administrados de forma gradual, regulando rigorosamente as dosagens e monitorando a reação do organismo.

Antes de prescrever um tratamento, os médicos encaminham o paciente para exames laboratoriais de fluido intra-articular. O medicamento específico, a dosagem e a duração do seu uso são selecionados com base nos resultados desta análise.

Efeitos colaterais

Considerando a força dos efeitos das ferramentas da biologia genética, ao utilizá-las, você deve definitivamente certificar-se de que não há contra-indicações. Basicamente, eles estão fortemente correlacionados com possíveis efeitos colaterais ao tomar medicamentos biológicos.

Os efeitos colaterais mais comuns incluem:

• Processos infecciosos, incluindo os graves como envenenamento do sangue e tuberculose.
• Doenças de etiologia oncológica.
• Doenças hematológicas: policitemia, anemia.
• Disfunção cardíaca grave.
• Novas doenças autoimunes.
• Manifestações alérgicas graves.

Conforme mencionado anteriormente, as contra-indicações para tomar GIPB são idênticas aos possíveis efeitos colaterais. Antes de iniciar a terapia, o paciente é submetido a uma série de exames para excluir a tuberculose latente. São eles, como radiografia, diaskintest, teste cutâneo de tuberculina, exame de sangue para teste de quantiferon.

Na maioria das vezes, recomenda-se que o GIPB seja tomado em combinação com os medicamentos básicos Metotrexato, Leflunomida e Sulfassalazina. Às vezes, os agentes da engenharia genética são prescritos como agentes monoterapêuticos. Porém, quando combinados com imunossupressores, observa-se um efeito terapêutico mais pronunciado, confirmado por estudos radiográficos.

Resumindo

As células de anticorpos monoclonais atuam sobre os patógenos autoimunes da artrite reumatóide, bloqueando sua atividade, evitando a propagação da doença.

No tratamento da AR, os medicamentos biologicamente ativos eliminam os complexos patogênicos do sangue, evitando assim o desenvolvimento de recidivas repetidas da doença.

O preço desses grupos de medicamentos, que é uma ordem de grandeza superior à média, deve-se à complexidade e à natureza multifásica de sua produção (10-20 mil rublos).

Segundo profissionais da área médica, o tratamento com medicamentos biológicos geneticamente modificados é muito mais eficaz em comparação com os métodos tradicionais de terapia antiartrítica: AINEs, glicocorticosteróides e tratamento fisioterapêutico.

Portanto, os medicamentos geneticamente modificados são considerados o melhor tratamento para a AR e outras doenças de difícil tratamento.