Tanto a aceleração como a desaceleração da apoptose podem ter um impacto dramático no curso de vários processos patológicos no corpo. As substâncias envolvidas na regulação da apoptose são geralmente proteínas e sua síntese é controlada pelos genes correspondentes. Os mesmos genes que regulam o nível de apoptose podem ser encontrados em seres vivos em níveis muito diferentes da escala evolutiva. Os genes que estimulam a apoptose incluem os genes p53, Bax e bcl-xS. Por outro lado, foram descritos genes que sintetizam proteínas que inibem a apoptose (Bcl-2, Ced-9, BHRF1, MCL-1). Proteínas pró e antiapoptóticas são capazes de se combinar entre si, formando homo e heterodímeros. Por exemplo, ao combinar a proteína inibidora de apoptose Bcl-2 com a proteína ativadora de apoptose Bax, o resultado (inibição ou ativação da apoptose) será determinado por qual proteína predominará nesta combinação.

As proteínas mais marcantes e informativas que refletem os processos sintéticos em curso nas células e tecidos são as proteínas da família Bcl-2, que ocupam um lugar central no estudo da regulação do processo de apoptose. É aconselhável considerar o mecanismo de regulação deste processo do ponto de vista das relações estruturais e funcionais entre as proteínas desta família, que permitem combiná-las numa só família - as proteínas Bcl-2. As proteínas desta família Bcl-2 estão em constante equilíbrio dinâmico, formando homo e heterodímeros, o que acaba afetando o desenvolvimento da apoptose celular. Portanto, acredita-se que a proporção das formas ativas dessas proteínas determine o equilíbrio entre a vida e a morte da célula.

Sabe-se agora que as proteínas da família Bcl-2 são indutoras de apoptose (Bad, Bax, J3ik, Bid, Bak) ou inibidoras (Bcl-2, Bcl-X). A proteína da família Bcl-2 pertence à classe das proteínas G. A proteína de 26 kJ codificada pelo gene Bcl-2 contém um domínio transmembrana e está localizada na membrana mitocondrial, retículo endoplasmático perinuclear, membrana nuclear e cromossomos mitóticos.

Bcl-2 é um fator de sobrevivência celular, protegendo-a da morte programada, e apresenta propriedades oncogênicas, pois previne a apoptose. O gene Bcl-2 funciona como um regulador negativo da apoptose. Foi estabelecido que uma diminuição na concentração de Bcl-2 leva à morte celular por apoptose, enquanto sua superexpressão protege as células da morte.

A sequência de eventos que levam uma célula à apoptose como resultado da interação de proteínas da família do TNF com receptores específicos é a mais bem estudada. Um representante proeminente deste grupo de proteínas é o sistema Apo-1/Fas/FasL. Deve-se notar que este sistema não tem outras funções conhecidas além de induzir a apoptose celular.

Apo-1/Fas/CD-95 é um receptor cuja estrutura pertence à família de receptores TNF. A interação do Apo-1/Fas (receptor) com o FasL (ligante) ou com anticorpos monoclonais leva à apoptose celular. Apo-1/Fas é constitutivamente expressa na superfície de muitos tipos de células: timócitos, linhagens celulares linfoblastóides, linfócitos T e B ativados, bem como fibroblastos, hepatócitos, queratinócitos e células mieloides. A Apo-1/Fas humana consiste em 325 resíduos de aminoácidos e é uma proteína de membrana tipo I. Aqueles. em sua estrutura podem-se distinguir domínios extracelulares, transmembranares e citoplasmáticos. A homologia da sequência de aminoácidos entre os receptores da família do TNF é elevada. Aproximadamente 80 resíduos de aminoácidos formam o domínio de morte (DD), que se envolve em interações proteína-proteína com proteínas citoplasmáticas, gerando um sinal de morte. O gene Apo-1/Fas em humanos está localizado no braço longo do cromossomo 10 e consiste em 9 éxons.

FasL é uma citocina e pertence à família de citocinas TNF. FasL é expresso em linfócitos T ativados e células natural killer, bem como em células de Sertoli e células do parênquima da câmara anterior do olho, o que permite que essas células matem qualquer célula que expresse Fas, incluindo um linfócito T ativado. Este mecanismo determina o aparecimento de locais protegidos do sistema imunológico. O FasL existe em duas formas - insolúvel ou ligado à membrana e solúvel, clivado da célula pela metaloproteinase. A forma solúvel do sFasL humano mantém a sua atividade. Tal como outros ligandos de receptores da família TNF, o homotrímero sFasL liga-se a 3 moléculas de Apo-1/Fas.

Quando o ligante se liga ao receptor, ocorre a oligomerização de proteínas citoplasmáticas, como DD (domínio de morte), relacionado ao receptor, proteína adaptadora – FADD (domínio de morte associado a Fas), contendo DED – domínio efetor de morte e procaspase-8. Como resultado deste processo, a protease específica da apoptose, caspase-8, é ativada e desenvolvem-se processos característicos da apoptose. Mutações no gene fas ou no gene FasL levam ao desenvolvimento de doenças autoimunes.

Apo-1/Fas é uma proteína que contém uma única região transmembrana que se liga ao FasL para induzir apoptose nas células-alvo. Existe também uma forma solúvel e livre de transmembrana de Apo-1 (sApo-1/Fas) que está presente no soro e em outros fluidos corporais. De acordo com a literatura, esta forma secretora (sApo-1/Fas) pode proteger as células da apoptose induzida por Apo-1/ligante e é formada pela clivagem de um resíduo de aminoácido do domínio transmembranar.

Nos últimos anos, a identificação da apoptose é frequentemente realizada através da determinação da atividade das caspases, tanto iniciadoras quanto efetoras. A maior parte dos trabalhos realizados sobre o estudo da atividade das caspases considera a caspase-3, pois várias vias de morte apoptótica convergem para ele, e sua ativação indica a presença de apoptose. Porém, se o estudo incluir a determinação da atividade da caspase-8, então além de identificar a morte celular programada como tal, também é possível determinar a via de seu desencadeamento, pois a ativação da caspase-8 indica um mecanismo receptor (externo) para iniciar o processo. Esta é precisamente a grande vantagem deste método.

Até à data, mais de 60 métodos diferentes foram desenvolvidos para identificar e estudar células apoptóticas in vitro. A literatura descreve várias abordagens metodológicas para detecção intravital de células apoptóticas in vivo. Esses métodos baseiam-se na avaliação qualitativa ou quantitativa de eventos causados ​​​​por alterações na membrana externa das células, fragmentação seletiva do DNA nuclear, alterações na estrutura dos componentes intracelulares ou sua redistribuição, bem como diminuição do pH citoplasmático. Além disso, existem formas atípicas de apoptose, nas quais não há alterações apoptóticas marcadoras.

Por razões óbvias, é impossível estudar os mecanismos de apoptose de CGRs no GPAA em humanos in vivo. Como indicador indireto ao estudar o papel da apoptose na patogênese do GPAA, foram avaliados marcadores apoptóticos em linfócitos do sangue periférico, caracterizando a prontidão destes para a apoptose. Para determinar células apoptóticas, são utilizados: varredura a laser e citometria de fluxo, tomografia computadorizada por emissão de fóton único, ressonância magnética (MRI), espectroscopia de ressonância magnética, tomografia por emissão de pósitrons. Além disso, para identificar morte celular apoptótica, microscopia de luz e fluorescência usando métodos convencionais de fixação e coloração, métodos de microscopia eletrônica, detecção de degradação de DNA oligonucleossômico in situ, detecção imuno-histoquímica de proteínas - marcadores envolvidos na morte celular programada, ou DNA fragmentado, determinação de atividade caspase.

O estudo da apoptose em preparações coradas por métodos padrão é amplamente utilizado devido à relativa simplicidade destes métodos. Os resultados obtidos pela contagem de células apoptóticas são expressos na forma do chamado índice apoptótico. Os critérios para morte celular programada podem incluir marginação e picnose da cromatina, alterações nos contornos nucleares, alterações nos contornos e fragmentação das células e o aparecimento de núcleos livres.

A microscopia de fluorescência é frequentemente usada como um método subjetivo para detectar a morte celular programada. São estudadas células vitalmente coradas em suspensão e preparações fixas. Ao trabalhar com células vivas, a marcação com anexina V é amplamente utilizada, o que permite detectar a fosfatidilserina que aparece durante a apoptose na parte externa da membrana plasmática.

Ao analisar células sob microscopia de fluorescência, são levadas em consideração as seguintes características: o tamanho do núcleo (redução), a natureza da distribuição da cromatina (condensação em aglomerados de formato irregular, compactação), corpos de cromatina (preservação do isolamento da membrana), a natureza da luminescência do DNA. O DNA apoptótico aparece condensado, verde-amarelado brilhante. Em células viáveis, a laranja de acridina produz fluorescência verde difusa.

Utilizando estudos imuno-histoquímicos, é determinada a presença de proteínas que formam uma cascata de processos bioquímicos que levam à apoptose. Este grupo de métodos geralmente inclui TUNEL e ELISA.

Muitos pesquisadores atribuem um papel de liderança à apoptose nas alterações estruturais da cabeça do nervo óptico (OND) causadas pela perda de CGRs. O papel da apoptose no desenvolvimento de doenças degenerativas é indiscutível. Existe material experimental convincente indicando a participação do processo apoptótico no mecanismo do NOM no GPAA. Porém, em geral, os estudos clínicos de fatores apoptóticos em pacientes com diferentes estágios de glaucoma são muito limitados, o que dificulta o estudo do seu papel na patogênese do NOM.

Markova A.A. 1Kashkina E.I. 1 Rubtsov V.S. 1 Lyakisheva R.V. 1

1 Universidade Médica do Estado de Saratov em homenagem. DENTRO E. Razumovsky, Saratov

A expressão de marcadores de apoptose e proliferação foi analisada em 61 pacientes com colite ulcerosa dependendo da duração, gravidade da doença e localização do processo inflamatório no cólon. O grupo de comparação consistiu em 15 pessoas praticamente saudáveis. Os pacientes foram examinados por métodos clínicos, laboratoriais, endoscópicos e morfológicos. Em amostras de biópsia da mucosa do cólon, foi determinada a expressão dos marcadores imuno-histoquímicos Ki-67, P53, BAX e CEA. O estudo revelou diminuição estatisticamente significativa da atividade proliferativa da mucosa do cólon em pacientes com colite ulcerosa em comparação com um grupo de indivíduos saudáveis, bem como diminuição dos processos de proliferação e aumento da expressão de marcadores de apoptose conforme a duração e gravidade das manifestações clínicas da doença aumentaram.

colite ulcerativa inespecífica

marcadores de apoptose e proliferação

1. Aruin L.I., Kapuller L.L., Isakov V.A. Diagnóstico morfológico de doenças do estômago e intestinos. – M.: Triada-X, 1998. – 496 p.

2. Gastroenterologia e hepatologia: diagnóstico e tratamento: guia para médicos/ed. A.V. Kalinina, A. F. Loginova, A.I. Khazanova. – 2ª ed., revisada. e adicional – M.: MEDpress-inform, 2011. – 864 p.: il.

3. Brown D. Gatter K. Anticorpo monoclonal Ki-67: seu uso em histopatologia // Histopatologia. – 1990. – Nº 17. –

4. Bruno S., Darynkiewich Z. Expressão dependente do ciclo celular e estabilidade da proteína nuclear detectada pelo anticorpo Ki-67 em células HL-60 // Cell. Vida profissional. – 1992. – Nº 25. –

5. Uma comparação de marcadores de proliferação (BrdUrd, Ki-67, PCNA) determinados em cada posição celular nas criptas da mucosa colônica humana normal / M. Bromley, D. Rew, A. Becciolini

e outros. //EUR. J. Histoquímica. – 1996. – Vol. 40. – P. 89–100.

6. Holt PR, Moss SF, Kapetanakis AM. O Ki-67 é um melhor marcador proliferativo no cólon do que o antígeno nuclear das células em proliferação? Câncer. Epidimiol // Biomarcadores. Anterior. – 1997. –

Nº 6. – P. 131–135.

7. McCormick D., Chong C., Hobbs C. et al. Detecção do antígeno Ki-67 em seção fixa e embebida em cera com o anticorpo monoclonal MIB-1 // Histopatologia. – 1993. –

Nº 22. – P. 355–360.

8. Reed J. C. Bcl-2 e regulação da morte celular programada // J. Cell. Biol. – 1994. – Vol. 124. – P. 1–6.

A colite ulcerativa (RCU) inespecífica é uma das doenças mais graves do trato gastrointestinal, levando à incapacidade e morte dos pacientes.

Nas últimas décadas, em vários países do mundo tem havido um aumento na incidência de CU, o que se deve em grande parte à melhoria do diagnóstico deste processo patológico.

Atualmente, o diagnóstico da UC utiliza uma abordagem integrada utilizando métodos de pesquisa radiológica, endoscópica e histológica. Uma das formas promissoras de avaliar o estado da mucosa do cólon é a imunohistoquímica com determinação de marcadores de proliferação e apoptose.

Dentre os métodos de pesquisa imuno-histoquímica, os marcadores de apoptose bcl e p53 são os mais utilizados. Sabe-se que as proteínas da família bcl são indutoras de apoptose (Bad, Bax, Bak, etc.) ou inibidoras de apoptose (Bcl-2, Bcl-XL, BOO, etc.). Deve notar-se que a proteína p53 é detectada em muitas células transformadas. Suas funções visam prevenir a transferência de informação genética danificada de uma geração de células para outra, inclusive por meio do início da apoptose. Um alto teor de p53 leva ao aumento da concentração de Bax na célula e à diminuição da concentração de bcl-2, o que promove a morte celular por apoptose.

Vários antígenos são usados ​​como marcadores de proliferação. O Antígeno Nuclear Celular em Proliferação (PCNA) está envolvido não apenas na proliferação celular, mas também no reparo do DNA após dano, o que torna esse antígeno condicionalmente específico para o ciclo celular, uma vez que o reparo do DNA pode ser realizado na fase de repouso. Outro antígeno associado de forma confiável às fases do ciclo celular é o Ki-67. A expressão desta proteína ocorre durante a fase pré-sintética, aumenta ao longo do ciclo celular e diminui acentuadamente durante a fase mitótica. Esta proteína, ao contrário do PCNA, não está envolvida na reparação do DNA. A expressão do Ki-67 permite identificar células em todas as fases do ciclo celular, exceto na fase de repouso.

O objetivo do estudo é analisar a expressão de marcadores de apoptose e proliferação em pacientes com colite ulcerativa dependendo da duração, gravidade da doença e localização do processo inflamatório.

Materiais e métodos de pesquisa

O grupo principal foi composto por 61 pacientes com RCU com idade entre 19 e 66 anos (27 mulheres e 34 homens), o grupo de comparação - 15 pessoas praticamente saudáveis. Os pacientes foram examinados por meio de métodos clínicos, laboratoriais, endoscópicos, morfológicos, além de exame imuno-histoquímico de biópsias da mucosa do cólon.

Os pacientes com RCU foram divididos em grupos de acordo com a gravidade das manifestações clínicas, duração da doença e localização do processo inflamatório.

A atividade proliferativa das células foi determinada pelo indicador proliferativo Ki-67 utilizando a fórmula:

Onde X- o número de núcleos no campo de visão do microscópio. A contagem foi realizada em pelo menos 10 campos de visão.

A apoptose foi avaliada pela expressão das proteínas p53 e BAX no epitélio superficial e glandular do cólon. Para avaliar os processos regenerativos na mucosa do cólon na UC, foi determinada a expressão do antígeno embrionário do câncer (CEA).

Resultados da pesquisa e discussão

Um estudo imuno-histoquímico determinou a dependência da expressão desses marcadores da duração da RCU, da gravidade de suas manifestações clínicas e da prevalência do processo inflamatório no cólon.

Ao processar estatisticamente os dados obtidos após testes de igualdade de variâncias e normalidade de distribuição, comprovou-se que a amostra não correspondia à lei da distribuição normal, portanto foram utilizados critérios não paramétricos para comparação dos grupos. Para descrever as características quantitativas foram utilizadas mediana, quartis superior e inferior.

Assim, em indivíduos saudáveis, o IP Ki-67 foi 54 (46;67), o que indica alta atividade proliferativa das células do cólon (tabela).

Índice de proliferação Ki-67 de células epiteliais da mucosa do cólon (%) em pessoas saudáveis ​​e pacientes com colite ulcerativa, dependendo de sua duração, gravidade e localização

Notas:

• R 0 - significância das diferenças com o grupo controle;
• R 1 - significância das diferenças com duração da doença inferior a 1 ano;
• R 2 - significância das diferenças com curso leve da doença;
• R 3 - significância das diferenças com localização distal da doença.

A expressão de BAX em indivíduos saudáveis ​​esteve ausente em 80% dos casos e em 20% houve baixa expressão do marcador. A expressão de CEA foi observada em 50% dos casos e também foi baixa.

Todos os pacientes, dependendo da duração da doença, foram divididos em 3 grupos: 1º com RCU com duração de até 1 ano, 2º com duração de 1 a 5 anos e 3º - mais de 5 anos.

Conforme segue na tabela, o aumento do PI Ki-67 no grupo de pacientes com duração da doença de 1 a 5 anos em comparação ao grupo 1 ( R≤ 0,02), pode ser explicada pelo aumento da atividade proliferativa das células, refletindo processos reparadores na membrana mucosa do cólon. IP Ki-67 baixo no grupo de pacientes com colite ulcerativa com duração de até 1 ano, totalizando 31(25;36), pode indicar diminuição pronunciada dos processos proliferativos na mucosa intestinal no início da doença.

Ao estudar o indicador p53 em função da duração da doença, não foi revelado nenhum padrão de expressão desta proteína, porém, há diferença na expressão deste marcador entre o grupo de indivíduos saudáveis ​​e o grupo de pacientes com duração da doença de 1 ano a 5 anos ( R≤ 0,05) e mais de 5 anos ( R ≤ 0,03).

A expressão de BAX foi detectada tanto no epitélio superficial quanto no glandular do cólon. Verificou-se que a expressão deste marcador no epitélio superficial e no epitélio das glândulas é quase a mesma em cada caso individual. A expressão de BAX em pacientes com UC foi detectada em 100% dos casos; diferenças estatisticamente significativas na expressão do marcador foram identificadas entre o grupo de comparação e os pacientes com UC ( R ≤ 0,01).

Ao comparar a intensidade da expressão do CEA, observou-se um aumento significativo com o aumento da duração da doença. No grupo de comparação, a expressão do CEA se manifestou apenas em casos isolados ( R ≤ 0,003).

Dependendo da gravidade das manifestações clínicas da CU, também foram detectadas alterações no PI Ki-67 (ver tabela). Ki-67 PI diminuiu em pacientes com doença moderada ( R≤ 0,05) e forma grave ( R≤ 0,02) em comparação com pacientes com evolução leve, também houve diferença entre o grupo de indivíduos saudáveis ​​e pacientes com CU de qualquer gravidade ( R ≤ 0,004).

As alterações na expressão do marcador p53 dependeram da gravidade da exacerbação (12,5% para leve; 35,7% para gravidade moderada e 50% para grave). Diferenças estatisticamente significativas foram obtidas entre grupos de indivíduos saudáveis ​​e pacientes com formas moderadas e graves de CU ( R ≤ 0,03).

BAX e CEA foram expressos em 100% dos casos, porém não foi detectada dependência da intensidade de expressão desses marcadores com a gravidade das manifestações clínicas da CU. Foram estabelecidas diferenças na expressão dos marcadores entre o grupo de comparação e os pacientes com RCU, independentemente da gravidade das manifestações clínicas (p≤0,01).

Ao analisar a dependência do PI Ki-67 na localização do processo inflamatório, foi revelado um aumento significativo na expressão do marcador no grupo de pacientes com RCU em comparação com pessoas saudáveis ​​( R≤ 0,002), porém, em uma análise comparativa dentro do grupo principal, não foram obtidas diferenças estatisticamente significativas entre a expressão do marcador e as diferentes localizações do processo ( R ≥ 0,05).

A expressão de p53 não foi detectada em todos os pacientes. Em pacientes com colite distal, o resultado positivo foi obtido apenas em 20% dos casos, com colite esquerda em 18% dos pacientes. Com dano intestinal total, a expressão de p53 foi detectada em 100% dos casos ( R≤ 0,03 em comparação com colite distal). Deve-se notar que a expressão foi mais intensa em áreas com sinais de metaplasia epitelial.

A intensidade da expressão de BAX no grupo com colite total foi significativamente maior do que na colite distal ( R ≤ 0,03).

A expressão de CEA não dependeu da localização do processo inflamatório, mas foi significativamente maior em pacientes com CU em comparação ao grupo de comparação ( R ≤ 0,03).

Na colite ulcerativa inespecífica, a atividade proliferativa das células epiteliais da mucosa do cólon é significativamente menor e as taxas de apoptose são maiores do que na ausência de alterações inflamatórias.

O aumento na duração da colite ulcerativa inespecífica é acompanhado por baixa atividade proliferativa do epitélio da mucosa do cólon, o que pode prejudicar seu reparo.

Com o aumento da gravidade das manifestações clínicas da colite ulcerosa, não há apenas uma diminuição no grau de atividade proliferativa das células epiteliais do cólon, mas também um aumento nas taxas de ativação da apoptose.

Quando o processo inflamatório se espalha para as partes proximais do cólon, foi detectado um aumento nas taxas de apoptose.

Revisores:

Shvarts Yu.G., Doutor em Ciências Médicas, Professor, Chefe. Departamento de Terapia Docente, Saratov State Medical University em homenagem a V.I. Razumovsky" Ministério da Saúde e Desenvolvimento Social da Rússia, Saratov;

Fedorina T.A., Doutor em Ciências Médicas, Professor, Chefe. Departamento de Patologia Geral e Clínica: Anatomia Patológica, Fisiologia Patológica, Samara State Medical University, Ministério da Saúde e Desenvolvimento Social da Rússia, Samara.

A obra foi recebida pelo editor em 9 de dezembro de 2011.

Link bibliográfico

CAD (DNase ativada por caspase) em fragmentos de tamanho múltiplo de 180-200 nucleotídeos. Como resultado da apoptose, formam-se corpos apoptóticos - vesículas de membrana contendo organelas intactas e fragmentos de cromatina nuclear. Esses corpos são engolfados por células vizinhas ou macrófagos por meio de fagocitose. Como a matriz extracelular não é afetada pelas enzimas celulares, mesmo com um grande número de células apoptóticas, não é observada inflamação.

O processo de apoptose é necessário para a regulação fisiológica do número de células do corpo, para a destruição de células velhas, para a formação de linfócitos não reativos aos seus antígenos (autoantígenos), para a queda das folhas das plantas no outono, para o efeito citotóxico de linfócitos T assassinos, para o desenvolvimento embrionário do corpo ( desaparecimento das membranas da pele entre os dedos em embriões de aves) e outros.

A interrupção da apoptose celular normal leva à proliferação celular descontrolada e ao aparecimento de um tumor.

1. O significado da apoptose

A apoptose é parte integrante da vida da maioria dos organismos multicelulares. Desempenha um papel particularmente importante nos processos de desenvolvimento. Por exemplo, os membros dos tetrápodes são formados em forma de pá, e a formação dos dedos ocorre devido à morte das células entre eles. As células que não são mais necessárias também estão sujeitas à apoptose, portanto a cauda dos girinos é particularmente destruída durante a metamorfose. No tecido nervoso dos vertebrados durante o desenvolvimento embrionário, mais da metade dos neurônios morrem por apoptose imediatamente após a formação.

A apoptose também faz parte do sistema de controle da “qualidade” das células, pois permite destruir aquelas que estão mal localizadas, danificadas, não funcionais ou potencialmente perigosas para o organismo. Um exemplo são os linfócitos B, que morrem se não transportarem receptores específicos de antígeno úteis ou se forem autorreativos. A maioria dos linfócitos ativados durante a infecção também morre por apoptose depois de superada.

Nos organismos adultos, a regulação simultânea da proliferação celular e da apoptose permite manter o tamanho de todo o indivíduo e de seus órgãos individuais. Por exemplo, após a administração do medicamento fenobarbital, que estimula a proliferação de hepatócitos, o fígado dos ratos aumenta de tamanho. Porém, imediatamente após cessar a ação dessa substância, todas as células em excesso sofrem apoptose, fazendo com que o fígado volte ao tamanho normal.

A apoptose também ocorre quando uma célula “sente” uma grande quantidade de dano interno que não consegue reparar. Por exemplo, em caso de danos no ADN, uma célula pode transformar-se numa célula cancerosa; para evitar que isso aconteça, em condições normais, ela “comete suicídio”. Um grande número de células infectadas com vírus também morre por apoptose.

2. Marcadores de células apoptóticas

Marcadores de apoptose

Detecção de fragmentação de DNA em células apoptóticas usando o método TUNEL.Uma amostra de tecido de fígado de camundongo, o núcleo de uma célula apoptótica é de cor marrom, microscopia óptica.

Detecção de fragmentação de DNA em células apoptóticas utilizando eletroforese em gel de agarose. Esquerda: ADN isolado de células apoptóticas - é visível uma “escada de ADN”; meio: marcadores; caso: amostra de DNA controle de células não tratadas. Linhagem celular H4IIE (hepatoma de rato), indutor de apoptose - paraquat, visualização utilizando brometo de etídio.

Superior: detecção de condensação e fragmentação da cromatina por coloração com corante fluorescente (Hoechst 34580). Meio: detecção da translocação de fosfatidilserina para a camada externa do plasmalema por coloração com Anexina V. Parte inferior: Micrografia de campo claro de células apoptóticas. Linhagem celular - Jurkat, indutor de apoptose - TRAIL, confocal e microscopia óptica de luz.

As células que morrem por apoptose podem ser reconhecidas por uma série de características morfológicas. Eles se tornam menores e mais densos (picnose), arredondados e perdem pseudópodes, o citoesqueleto neles é destruído, a membrana nuclear se desintegra, a cromatina se condensa e se fragmenta. Um grande número de vesículas aparece na superfície das células; se as células forem grandes o suficiente, elas se desintegram em fragmentos cercados por membranas - corpos apoptóticos.

Nas células apoptóticas, além das morfológicas, também ocorre um grande número de alterações bioquímicas. Partes do DNA são cortadas por nucleases especiais nas regiões ligantes entre os nucleossomos em fragmentos de igual comprimento. Portanto, ao separar todo o DNA de uma célula apoptótica por eletroforese, pode-se observar uma “escada” característica. Outro método para detectar a fragmentação do DNA é marcar suas extremidades livres usando o método TUNEL ( T desoxinucleotidil transferase terminal d você PT n eca e e eu abeling ) .

A membrana plasmática das células apoptóticas também sofre alterações. Em condições normais, o fosfolipídio fosfatidilserina carregado negativamente está contido apenas em sua camada interna (devolvida ao citosol), mas durante a apoptose ele “salta” para a camada externa. Esta molécula serve como um sinal "coma-me" para os fagócitos próximos. O envolvimento de células apoptóticas induzido pela fosfatidilserina, ao contrário de outros tipos de fagocitose, não resulta na liberação de mediadores inflamatórios. A alteração descrita no plasmalema é a base de outro método para identificar células que morrem por apoptose - coloração com anexina V, que se liga especificamente à fosfatidilserina.

3. Caspase - mediadores da apoptose

Os sistemas celulares que medeiam a apoptose são semelhantes em todos os animais, com a família das proteínas caspases ocupando um lugar central. Caspases são proteases que possuem um resíduo de cisteína no centro ativo e cortam seus substratos em um resíduo específico de ácido aspártico (daí o nome: c de cisteína E asp de ácido aspártico). As caspases são sintetizadas na célula como procaspases inativas, que podem se tornar substratos para outras caspases já ativadas, que as cortam em um ou dois locais no resíduo de aspartato. Dois fragmentos formados - um maior e um menor - são conectados entre si, formando um dímero, que se associa ao mesmo dimmer. O tetrâmero formado desta forma é uma protease ativa, que pode cortar proteínas do substrato. Além das regiões correspondentes às subunidades maiores e menores, as procaspases às vezes também contêm prodomínios inibitórios, que são degradados após a clivagem.

Como resultado da clivagem e ativação de algumas caspases por outras, forma-se uma cascata protealítica, que aumenta significativamente o sinal e torna a apoptose um processo irreversível a partir de certo ponto. Essas procaspases que iniciam esta cascata são chamadas de iniciadoras e seus substratos são chamados de efetores. Uma vez ativadas, as caspases efetoras podem clivar outras procaspases efetoras ou proteínas alvo. Os alvos das caspases efetoras que são destruídas durante a apoptose incluem, em particular, proteínas da lâmina nuclear, cuja quebra leva à desintegração desta estrutura. A proteína também se degrada e, em condições normais, inibe as endonucleases CAD, resultando na fragmentação do DNA. As caspases e as proteínas de adesão do citoesqueleto e intercelular são clivadas, fazendo com que as células apoptóticas se arredondem e se separem das células vizinhas, tornando-se assim alvos mais fáceis para os fagócitos.

O conjunto de caspases necessárias para sofrer apoptose depende do tipo de tecido e da via pela qual a morte celular é ativada. Por exemplo, em camundongos, quando o gene que codifica o efetor caspase-3 é “desligado”, a apoptose não ocorre no cérebro, mas ocorre normalmente em outros tecidos.

Os genes da procaspase estão ativos em células saudáveis ​​e, portanto, as proteínas estão constantemente presentes para que a apoptose ocorra; apenas a sua ativação é necessária para desencadear o suicídio celular. As procaspases iniciadoras incluem um prodomínio longo contendo um CARD ( domínio de recrutamento caspase , domínio de recrutamento Caspase). O CARD permite que as procaspases iniciadoras se liguem às proteínas adaptadoras para formar complexos de ativação quando a célula recebe um sinal que estimula a apoptose. Nos complexos de ativação, várias moléculas de procaspase ficam próximas umas das outras, o que é suficiente para que entrem no estado ativo, após o qual se cortam.

As duas vias de sinalização mais bem estudadas para ativação da cascata de caspases em células de mamíferos são chamadas extrínseca e intrínseca (mitocondrial), cada uma das quais utiliza suas próprias procaspases iniciadoras.

4. Caminhos para ativar a apoptose

4.1. Caminho externo

A célula pode receber um sinal que induz a apoptose vindo do exterior, por exemplo, de linfócitos citotóxicos. Neste caso, o chamado caminho externo é ativado ( via extrínseca), Começando pelos receptores de morte. Os receptores de morte são proteínas transmembrana que pertencem à família de receptores do fator de necrose tumoral (TNF), como o próprio receptor de TNF e o receptor de morte Fas. Eles formam homotrímeros, nos quais cada monômero possui um domínio extracelular de ligação ao ligante, um domínio transmembrana e um domínio de morte citoplasmática, e atrai e ativa procaspases através de proteínas adaptadoras.

Os ligantes do receptor de morte também são homotrímeros. Eles estão relacionados entre si e pertencem à família de moléculas sinalizadoras do fator de necrose tumoral. Por exemplo, os linfócitos citotóxicos transportam ligantes Fas na sua superfície, que podem se ligar aos receptores de morte Fas no plasmalema das células alvo. Neste caso, os domínios intracelulares destes receptores estão ligados a uma proteína adaptadora ( FADD, domínio de morte associado ao Fas ), E estes, por sua vez, atraem procaspases iniciadoras 8 e/ou 10. Como resultado dessa série de eventos, forma-se um complexo de sinalização indutor de morte - DISC ( complexo de sinalização indutor de morte ). Uma vez ativadas neste complexo, as caspases iniciadoras interrompem as procaspases efetoras e desencadeiam a cascata apoptótica.

Muitas células sintetizam moléculas que, até certo ponto, as protegem da ativação da via externa de apoptose. Um exemplo dessa proteção seria a expressão dos chamados receptores chamariz ( receptores chamariz), Possuindo domínios de ligação ao ligante extracelular, mas não domínios de morte citoplasmática e, portanto, não pode desencadear apoptose e competir com receptores de morte convencionais por ligantes. As células também podem produzir proteínas que bloqueiam a via apoptótica extrínseca, como o FLIP, que é semelhante em estrutura às procaspases 8 e 10, mas não possui atividade proteolítica. Inibe a ligação das procaspases iniciadoras ao complexo DISC.

4.2. Caminho interno

Apoptossomo

A apoptose também pode ser desencadeada dentro da célula, por exemplo, por lesão, dano ao DNA, falta de oxigênio, nutrientes ou sinais de sobrevivência extracelular. Nos vertebrados, esta via de sinalização é chamada intrínseca ( via intrínseca) Ou mitocondrial, o evento chave nele é a liberação de certas moléculas do espaço intermembrana da mitocôndria. Antes dessas moléculas de zocrem existe o citcromo c, que na maioria dos casos vai para o transportador de elétrons das mitocôndrias, a proteína do citoplasma tem outra função - chega à proteína adaptadora Apaf ( fator de ativação de protease apoptótica-l ), fazendo com que ele se oligomerize em uma estrutura de sete membros em forma de roda chamada apoptossoma. O apoptossomo recruta e ativa a procaspase-9 iniciadora, que pode então ativar a procaspase iniciadora.

Em algumas células, a via de apoptose extrínseca deve ativar a via de apoptose intrínseca para efetivamente matar a célula. A via intrínseca é estritamente regulada pelas proteínas da família Bcl-2.

4.2.1. Regulação da via intrínseca pelas proteínas da família Bcl-2

A família Bcl-2 inclui proteínas evolutivamente conservadas, cuja principal função é a regulação da liberação do citocromo c e outras moléculas do espaço intermembranar das mitocôndrias. Entre eles estão moléculas pró-apoptóticas e anti-apoptóticas que podem interagir entre si em diversas combinações, suprimindo-se mutuamente, o equilíbrio entre suas atividades e determinando o destino da célula.

Cerca de 20 proteínas desta família são agora conhecidas, todas contendo pelo menos um dos quatro domínios de homologia Bcl2 alfa-helicoidal, chamados BH1-4 ( homologia bcl2). As proteínas antiapoptóticas da família Bcl2 contêm todos os quatro domínios, incluindo o próprio Bcl-2, bem como Bcl-X L, Bcl-w, Mcl-1 e A1. As proteínas proapoptóticas são divididas em dois grupos, sendo que os membros do primeiro contêm três domínios BH (BH1-3), em particular Bak, Bax e Bok (este último é expresso apenas em tecidos dos órgãos reprodutivos). O mais numeroso entre a família Bcl-2 é o segundo grupo de proteínas pró-apoptóticas que contém apenas o domínio BH3 (somente BH3), incluindo Bim, Bid, Bad, Bik/Nbk, Bmf, Nix/BNIP3, Hrk, Noxa, Puma.

Em condições normais (isto é, quando a célula não está em apoptose), proteínas anti-apoptóticas como Bcl-2 e Bcl-X L ligam-se às proteínas pró-apoptóticas BH123 (Bax e Bak) e impedem-nas de polimerizar na parte mitocondrial externa. membrana para formar poros. Como resultado da ação de um determinado estímulo apoptótico, proteínas pró-apoptóticas contendo apenas o domínio BH3 são ativadas ou começam a ser sintetizadas na célula. Eles, por sua vez, inibem proteínas antiapoptóticas, eliminando o efeito inibitório sobre Bak e Bax, ou interagem diretamente com estes últimos e promovem sua oligomerização e formação de poros. Devido à permeabilização da membrana externa, o citocromo c, assim como outros mediadores de apoptose, como o AIF, entram no citosol. fator indutor de apoptose ).

Por exemplo, quando há falta de sinais de sobrevivência na célula, a expressão da proteína BH3 Bim é ativada através da mediação da MAP quinase JNK, que desencadeia a via intrínseca de apoptose. Em caso de dano ao DNA, acumula-se o supressor tumoral p53, que estimula a transcrição dos genes que codificam as proteínas BH3 Puma e Noxa, que também medeiam a apoptose. Outra proteína BH3, Bid, fornece uma conexão entre as vias externa e interna da apoptose. Após a ativação dos receptores de morte e, consequentemente, da caspase-8, esta última corta o Bid para formar uma forma truncada tBid (Bid truncada), que se move para a mitocôndria, onde suprime Bcl-2.

Apoptoseé uma forma de morte celular programável e geneticamente mediada, na qual sinais externos ou internos dão um impulso à célula para formar ou ativar enzimas que a levam à autodestruição. Morfologicamente, a apoptose é caracterizada por encolhimento celular, condensação e fragmentação do núcleo, destruição do citoesqueleto e protrusão bolhosa da membrana celular. Uma característica da apoptose é que uma célula moribunda mantém a integridade de sua membrana até que o processo seja concluído, e só então a destruição de sua membrana é um sinal para os fagócitos próximos absorverem os fragmentos restantes e completarem o processo de degradação celular. As células apoptóticas que não sofrem fagocitose imediata tornam-se pequenos fragmentos ligados à membrana chamados “corpos apoptóticos”. Uma característica importante da apoptose é que a remoção das células mortas ocorre sem o desenvolvimento de inflamação.

A apoptose desempenha um papel importante nos processos fisiológicos: organogênese, desenvolvimento embrionário, regulação da composição e número de populações celulares nos tecidos de um organismo adulto, diversas alterações hormonais no corpo. O papel da apoptose também é importante em vários processos patológicos. Foi mais completamente estudado no crescimento tumoral.

O processo de apoptose pode ser dividido em duas fases:

· formação e condução de sinais apoptóticos – fase de tomada de decisão;

· desmantelamento de estruturas celulares – fase efetora.

A implementação de mecanismos de apoptose está associada à ativação de enzimas celulares endógenas - cisteína proteases (caspases). As caspases estão em estado inativo nas células (procaspases). A ativação ocorre através de sua clivagem proteolítica e posterior dimerização com formação de subunidades ativas. Os alvos das caspases são proteínas responsáveis ​​por diversas funções vitais da célula. Atualmente foram descritos 14 tipos de caspases, que de acordo com suas características funcionais podem ser divididas em 3 grupos:

ativadores de citocinas (caspases 1, 4, 5, 13)

caspases - indutores de ativação de caspases efetoras (caspases 2, 8, 9, 10)

· caspases efetoras - executoras de apoptose (3, 6, 7)

Um dos receptores celulares de membrana responsáveis ​​pelos mecanismos de apoptose é uma proteína chamada receptor Fas (CD95/APO1). O ligante para o receptor Fas é a proteína ligante Fas (Fas-L), que pertence à família dos fatores necróticos tumorais e pode se apresentar na forma de proteína de membrana ou na forma solúvel. A ligação do receptor Fas ao ligante Fas leva à ativação de mecanismos de apoptose com ativação de indutores de caspases. Com a subsequente ativação das caspases efetoras, inicia-se uma cadeia de reações proteolíticas, cujo objetivo é o “desmantelamento” apoptótico da célula: fragmentação do DNA, clivagem direta das proteínas estruturais da célula, desregulação da síntese protéica. Assim, a participação das caspases efetoras na apoptose leva à ruptura da célula apoptótica com as células vizinhas, à reorganização do citoesqueleto, à diminuição das capacidades de reparo e replicação do DNA, à ruptura da membrana nuclear e à destruição do DNA, à liberação de sinais que marcam a célula para apoptose e desmembramento da célula em corpos apoptóticos. Não é por acaso que as caspases efetoras são chamadas de “caspases executoras”.

Os métodos para estudar a apoptose são bastante diversos. Inicialmente, a forma mais comum de determinar a apoptose era a eletroforese da fração de DNA extraída, que permite identificar a discrição do DNA de baixo peso molecular por mol. massa (como resultado da degradação do DNA internucleossômico). Nos estudos morfológicos, o método TUNEL é utilizado para detectar quebras de DNA, que se baseia na formação de inserções de oligonucleotídeos marcados nos locais de quebras de DNA, cuja formação é catalisada pela enzima TdT.

Atualmente, métodos baseados em citometria de fluxo são cada vez mais utilizados para registrar a apoptose de linfócitos. Este grupo inclui um método baseado na detecção da perda de parte do DNA pelas células (células hipodiplóides) por meio de um corante fluorescente - iodeto de propídio, descrito a seguir. Outros métodos baseados em citometria de fluxo também são usados ​​para determinar a apoptose. A apoptose de linfócitos pode ser detectada em estágios iniciais usando anexina V marcada com fluorocromo, que se liga à fosfatidilserina que aparece na membrana das células em apoptose. Uma ideia aproximada da “propensão” dos linfócitos para desenvolver apoptose pode ser obtida determinando a expressão do receptor Fas (CD95) em sua superfície e nas mitocôndrias do protoncogene bcl-2.

O significado clínico da avaliação da apoptose durante o exame clínico e imunológico dos pacientes é indiscutível, uma vez que seu comprometimento está associado a diversas doenças. O enfraquecimento da apoptose se deve à formação de doenças autoimunes (devido à interrupção do processo de seleção de clones autoespecíficos de linfócitos). Portanto, o registro do enfraquecimento da apoptose pode servir como fonte de informações sobre os mecanismos patogenéticos de doenças autoimunes como lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatóide, bem como síndrome linfoproliferativa autoimune, que se baseia em mutações de genes que determinam receptores de sinais apoptóticos . A apoptose prejudicada é um mecanismo importante no desenvolvimento de processos malignos. Nas células tumorais, é frequentemente detectada uma mutação no gene p53, que codifica uma proteína que detecta um sinal sobre a presença de quebras de DNA não reparadas e mutações cromossômicas, levando ao desenvolvimento de apoptose. Como resultado, as células geneticamente defeituosas não são descartadas e se tornam uma fonte de formação de tumores.

Em várias outras doenças, pelo contrário, observa-se um aumento da apoptose. Isso ocorre em processos infecciosos (a apoptose maciça de células T é frequentemente causada por superantígenos microbianos), sepse e várias doenças virais, incluindo AIDS. A apoptose é potencializada em diversas doenças do sangue e imunodeficiências primárias, quando é causada pela produção insuficiente de fatores de sobrevivência celular, cujo papel é desempenhado pelas citocinas. Assim, em uma das formas de imunodeficiência combinada grave associada a uma mutação do gene da IL-7 ou da cadeia γ comum dos receptores de citocinas, ocorre morte de precursores linfóides devido à deficiência de IL-7.

No entanto, o mais geralmente significativo é a avaliação da “apoptose ativada”, que os linfócitos sofrem quando são estimulados por mitógenos. O fato é que a apoptose, junto com a proliferação, é uma forma de resposta dos linfócitos aos estímulos de ativação. Nos estágios iniciais de diferenciação predomina a resposta apoptótica e seu resultado é a formação de tolerância ao antígeno indutor. Os linfócitos maduros respondem à estimulação predominantemente por proliferação (que serve como estágio inicial e pré-requisito para o desenvolvimento de uma resposta imune), mas permanece uma certa probabilidade de sua entrada na apoptose de ativação. Uma vez que a apoptose actua como um processo alternativo à proliferação, a sua proporção pode servir como uma medida da eficácia da resposta celular aos sinais de activação. Quanto maior for a contribuição da apoptose para a resposta dos linfócitos ao mitogénio, menos eficaz será a defesa imunitária específica do antigénio. Assim, a determinação da apoptose durante a ativação de linfócitos por mitógenos é a mais informativa, sujeita a uma avaliação paralela da resposta proliferativa das células ao mesmo estímulo.

Durante o processo de apoptose, uma complexa cadeia de reações ocorre em uma célula em nível molecular, levando a alterações nos processos metabólicos e nas características fenotípicas das células. Essas alterações podem ser determinadas por métodos bioquímicos, microscópicos ou citométricos e são utilizadas como marcadores de apoptose.

Um dos primeiros marcadores de apoptose é o aparecimento na membrana citoplasmática da célula. receptores de anexina. Nas células apoptóticas, o fosfolipídio fosfatildiserina (PD) é reorientado e localizado na superfície da membrana celular. A localização do PS na superfície da membrana é observada a partir de
estágio inicial da apoptose antes da degradação celular completa. Recombinante-
qualquer proteína anexina V (35-36 kDa), que tem alta afinidade
resistência ao PS na presença de íons Ca +2. Entrando em contato com o FS na superfície
células ty, a anexina V, conjugada a um fluorocromo, serve
marcador de apoptose. A anexina V é geralmente usada em combinação com
iodeto de propídio (PI), que permite reconhecimento simultâneo
células intactas (ambos anexina V e PI negativo), células
estão em apoptose “precoce” (anexina V positiva,
negativo para PI), e células em apoptose tardia ou
em necrose (positiva tanto para anexina V quanto para PI).

CD95 Fas, ou APO-1, é uma glicoproteína transmembrana (45 kDa) que é membro da família de receptores do fator de necrose tumoral (TNF-α). O antígeno CD95 é expresso em quantidades significativas em timócitos, linfócitos CD4+, CD8+ do sangue periférico e, em menor extensão, em linfócitos B e células NK. Este antígeno também é expresso em granulócitos e monócitos, mas sua expressão não é encontrada em plaquetas e eritrócitos. O receptor CD95 também é observado em células de tecidos normais e tumores. A ligação do CD95 pelo ligante Fas (Fas-L, CD95L) induz apoptose nas células que o expressam. Os anticorpos monoclonais para CD95 permitem identificar uma população de células prontas para apoptose utilizando citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência.

CD95L (Fas-L)– chamado ligante Fas, é uma proteína de membrana (40 kDa). Existe também uma forma solúvel de CD95L (sFas-L), que é uma proteína (26 kDa) da família de receptores (TNF-α). Este antígeno é expresso por linfócitos E citotóxicos e células NK e também foi detectado em muitas células tumorais. A ligação do Fas-L ao receptor CD95 induz o processo de apoptose nas células-alvo. Os anticorpos monoclonais para CD95L permitem identificar uma população de células prontas para apoptose utilizando citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência.

Bcl-2– uma proteína (26 kDa), cuja superexpressão bloqueia a apoptose. Bcl-2 é uma proteína intracelular localizada nas mitocôndrias, portanto, para detectá-la por meio de anticorpos monoclonais, é necessária a permeabilização preliminar da membrana celular.

Fim do trabalho -

Este tópico pertence à seção:

Métodos para avaliar o estado imunológico - um livro didático para estudantes de faculdades de medicina, pediatria e médico-profilática

Agência Federal de Saúde e Desenvolvimento Social da Universidade Médica do Estado de Kursk.. Departamento de Imunologia Clínica e Alergologia..

Se precisar de material adicional sobre este tema, ou não encontrou o que procurava, recomendamos utilizar a busca em nosso banco de dados de obras:

O que faremos com o material recebido:

Se este material foi útil para você, você pode salvá-lo em sua página nas redes sociais:

Todos os tópicos nesta seção:

Estado imunológico e métodos para avaliá-lo
O estado imunológico (SI) é um conjunto de parâmetros laboratoriais que caracterizam a atividade quantitativa e funcional das células do sistema imunológico. Os indicadores de IP são altamente

Objetos e métodos de pesquisa imunológica
Objetos de estudo Métodos de estudo Características fenotípicas de células imunocompetentes Citofluorometria de fluxo IMM

Linfócitos
Como parte das células do sistema imunológico, os verdadeiros imunócitos são todas variantes dos linfócitos. Outros tipos de leucócitos (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monócitos), macrófagos, plaquetas, mastócitos

Células MFS
Monócitos do sangue periférico e macrófagos teciduais são derivados de células-tronco pluripotentes. Uma vez na corrente sanguínea, os monócitos se depositam nos tecidos dentro de 2 a 3 dias, onde se transformam em tecido

Sistema antimicrobiano dependente de oxigênio
mecanismos dependentes de oxigênio de glicose bactericida + NADP + → Pentose fosfato + NADPH Citocromo b245 NADP + O2 ͛

Células mediadoras
Granulócitos são leucócitos polimorfonucleares que circulam no sangue e surgem, como células monócitos-macrófagos, de uma célula-tronco mieloide na medula óssea. Existem três tipos de grana

Métodos de imunofenotipagem de linfócitos
Ao estudar os linfócitos, avalia-se seu número no sangue periférico e sua atividade funcional. A determinação do número de células é realizada levando em consideração os antígenos de diferenciação em e

Isolamento da fração de células mononucleares
O método para isolar células mononucleares baseia-se nas diferentes flutuabilidades de diferentes células sanguíneas. A utilização de um gradiente de determinada densidade permite separar células mononucleares (linfócitos, monócitos, células sanguíneas)

Citometria de fluxo
O método de citometria de fluxo baseia-se na medição das propriedades ópticas das células. As células são introduzidas individualmente no fluxo laminar em uma célula de fluxo de quartzo, onde passam através da luz focada

Método de imunofluorescência indireta
A imunofluorescência indireta é um método baseado na utilização de anticorpos monoclonais marcados com fluorocromo, avaliando os resultados levando em consideração a luminescência específica das células durante a microscopia luminescente

Método imunocitoquímico
Os métodos imunocitoquímicos baseiam-se no uso de enzimas como peroxidase e fosfatase alcalina. Atualmente, o método mais utilizado é o PA (peroxidase-antiperoxidase), st.

Métodos para estudar a atividade funcional dos linfócitos
A atividade funcional dos linfócitos é avaliada pelos seguintes efeitos: capacidade de reconhecimento de antígenos, ativação, proliferação e diferenciação celular. Capacidade de reconhecimento de linfócitos

Reação de transformação de explosão de linfócitos
O contato de um linfócito com um antígeno estranho ou mitógeno inespecífico é acompanhado por ativação e reação de transformação blástica (BTLR), ou seja, proliferação celular com a transição de pequenos linfócitos para blastos

Cultura mista de linfócitos
O co-cultivo de linfócitos possuindo moléculas MHC-II de diferentes haplótipos provoca a sua transformação e proliferação blástica. As células que respondem pertencem aos linfócitos T e são estimuladas por substâncias estranhas.

Proteínas do plasma sanguíneo
Mais de duzentas proteínas estão presentes no plasma humano, a maioria das quais foi isolada e descrita estrutural e funcionalmente. As proteínas plasmáticas são predominantemente representadas por glicoproteínas. Com eletrofo

Globulinas
A α1-antitripsina é uma α1-globulina responsável por mais de 80% da atividade antiprotease sérica e é o principal componente da banda α. Em refrigerante de soro de leite

Globulinas
A haptoglobina tem meia-vida de 2 a 4 dias. O conteúdo normal de haptoglobina no soro é de 0,3 - 2,0 g/l. Seu principal significado funcional é ligar a hemoglobina livre no soro

Métodos de eletroforese de proteínas
A eletroforese é amplamente utilizada para a determinação semiquantitativa de proteínas séricas e para a detecção de paraproteínas. A eletroforese é realizada com soro e não com plasma, portanto

Imunoglobulinas
As imunoglobulinas (Ig) são proteínas específicas produzidas pelo sistema imunológico como resultado de uma reação a antígenos estranhos e se acumulam no soro sanguíneo e em outros fluidos biológicos.

Imunoglobulinas humanas
Propriedade IgM IgG IgA IgD IgE Forma molecular Pentámero

Métodos para determinação de imunoglobulinas
Para a determinação quantitativa do conteúdo de Ig de diversas classes no soro sanguíneo e outros fluidos biológicos, têm sido amplamente utilizadas diversas opções para estadiamento da reação de precipitação em um gel.

Paraproteínas
Paraproteínas são imunoglobulinas ou fragmentos destas produzidas por células plasmáticas derivadas de uma linha celular específica de linfócitos B (monoclone). As paraproteínas muitas vezes falham

Crioglobulinas
As crioglobulinas são proteínas plasmáticas patológicas (10-80 mg/ml), que têm a propriedade de se transformar em estado gelatinoso em temperaturas abaixo de 37°C. A maioria das crioglobulinas são complexos policlonais

Métodos para determinar complexos imunes
A ligação da Ig a um antígeno é um processo fisiológico que leva à formação de imunocomplexos (CI) que visam eliminar o antígeno do organismo. No entanto, sob certas condições

Determinação de autoanticorpos no diagnóstico de doenças sistêmicas do tecido conjuntivo
De acordo com conceitos modernos, autoimunidade refere-se a condições nas quais anticorpos ou linfócitos sensibilizados aparecem no corpo contra antígenos normais de seus próprios tecidos.

Principais marcadores sorológicos de doenças autoimunes
Antígeno Nome original Estrutura molecular Função Valor de diagnóstico

Determinação de ANA em reação de imunofluorescência indireta
Num teste típico, o soro do paciente é incubado com substratos antigênicos (tecido de fígado ou rim animal, cultura de células Hep-2) para ligar especificamente as substâncias presentes.

Imunofluorescência indireta
Caráter da luminescência Especificidade do antígeno Significado clínico dsDNA periférico ou marginal, l

Determinação de ANA e ENA por ELISA de fase sólida
Sistema de teste para ELISA ANA (UBI MAGIWELL) - para análise de triagem de anticorpos antinucleares fornece determinação semiquantitativa de uma ampla gama de anticorpos para o complexo sorvido nos poços

Doenças autoimunes
Tipo de patologia Resultados de pesquisas imunológicas. Tipo de anticorpos e sua frequência (%)

Sistema de citocinas
As citocinas são uma classe de mediadores peptídicos solúveis do sistema imunológico necessários para o seu desenvolvimento, funcionamento e interação com outros sistemas do corpo. Eles definem

Interleucinas
A IL-1 é um mediador imunorregulador liberado durante reações inflamatórias, lesões teciduais e infecções (citocina pró-inflamatória). IL-1 estimula proliferação e diferenciação

Interferons
O interferon (IFN) foi descoberto como uma proteína com atividade antiviral. O efeito antiviral do IFN se deve à sua capacidade de prevenir a replicação intracelular do vírus na fase

Fatores de necrose tumoral
O fator de necrose tumoral (TNF) é o principal mediador produzido pelo organismo em resposta a bactérias gram-negativas. A substância ativa das bactérias gram-negativas é o LPS, um componente do sistema celular.

Fatores estimuladores de colônias
Várias citocinas produzidas durante o desenvolvimento da resposta imune têm um efeito estimulante na diferenciação dos precursores da medula óssea. Essas citocinas são chamadas de citocinas estimuladoras de colônias.

Fatores de crescimento
O fator de crescimento transformador (TGFβ) é uma família de peptídeos relacionados com múltiplos efeitos nos processos gerais que regulam o crescimento e a morfogênese. TGFβ - principal citocina

Métodos para determinar citocinas
A determinação do conteúdo de citocinas em vários fluidos biológicos é de grande importância na avaliação da atividade funcional de células imunocompetentes e na regulação da resposta imune. Em palavras separadas

Sistema complemento
O sistema complemento é um complexo de proteínas do soro sanguíneo capazes de se auto-organizar e mediar reações de imunidade humoral e fagocitose. Atualmente sabe-se que

Métodos para determinar a atividade do complemento
A atividade total (título) do complemento é determinada na reação de hemólise utilizando eritrócitos de ovelha. O complemento contido no soro teste causa hemólise em ovelhas sensibilizadas

Título de complemento a 50% HE
Hemólise,% K Hemólise,% K Hemólise,% K Hemólise,% K

Determinação de componentes do complemento
Para a determinação dos componentes do complemento utiliza-se o ELISA e o método turbidimétrico, cuja implementação está descrita nas instruções anexas aos sistemas de testes de diagnóstico. Na prática clínica

Componentes do complemento
Componente complemento Manifestações clínicas Deficiência de C1 Geralmente não causa distúrbios clinicamente significativos, pois come

Métodos para estudar a atividade fagocítica de granulócitos
A característica mais importante da função dos granulócitos é a avaliação de sua atividade fagocítica. Sua diminuição pode ser resultado de uma deficiência de fatores opsonizantes séricos (anticorpos, complemento

Teste NST
O teste nitroblue tetrazólio (teste NBT) é usado para identificar os chamados granulócitos e monócitos ativados. A ativação dos fagócitos é baseada em um aumento acentuado nas reações oxidativas

Metodologia de Pesquisa
Reagentes e materiais necessários: KN 42 OPO 44 0, Na 42 OPO 44 0, NaCI, glicose, nitroblue tetrazólio, heparina, álcool metílico, solução aquosa de verde metileno a 1% (no caso

Determinação de mieloperoxidase
A mieloperoxidase oxida vários substratos (benzidina, ortofenildiamina) na presença de peróxido de hidrogênio, que é acompanhada por uma reação colorida. A mieloperoxidase é uma enzima contida em grânulos de fago

Quimiluminescência
A luminescência espontânea que ocorre durante reações químicas devido à energia das substâncias reagentes é chamada quimioluminescência (CL). É inerente a todos os tecidos e células de um organismo vivo, desde que contenham

Determinação do conteúdo de IgE
Entre os métodos imunológicos para avaliar parâmetros inespecíficos do estado imunológico na maioria das doenças atópicas, a determinação da quantidade de IgE total é de maior importância. No entanto, eu concordo

Teste de degranulação de basófilos
Em pacientes alérgicos, uma porção significativa de IgE liga-se a vários leucócitos através dos seus receptores Fc. A presença de células portadoras de anticorpos indica a sua sensibilização ao alérgeno correspondente. B

Teste de estimulação de antígeno celular basófilo - CAST
No caso de reações alérgicas mediadas por IgE, o mecanismo desencadeante começa com a ligação do alérgeno a moléculas específicas de IgE na superfície de basófilos ou mastócitos. E

Reação de inibição da migração de leucócitos
A reação é realizada para identificar linfócitos sensibilizados ao alérgeno suspeito. Linfócitos sensibilizados, ao interagirem com um alérgeno específico, liberam mediadores (FPML

Tarefa nº 1
Paciente de 23 anos queixa-se de furúnculos recorrentes localizados na face e nas pernas. Observa resfriados frequentes (até 7 a 8 vezes por ano), erupções herpéticas nos lábios.

Problema nº 2
O paciente N., 22 anos, procurou um imunologista com queixas de infecções virais respiratórias agudas recorrentes (até 7 vezes ao ano), muitas vezes acompanhadas de exacerbação de bronquite obstrutiva crônica. Conduzido antibacteriano

Problema nº 3
O paciente T., 27 anos, consultou repetidamente um médico sobre infecções virais respiratórias agudas recorrentes, traqueobronquite, fraqueza e mal-estar. Pela anamnese constatou-se que durante o ano ele sofreu de ARVI seis vezes, duas vezes

Problema nº 4
Paciente K, 45 anos. Diagnóstico: lúpus eritematoso sistêmico. Um estudo imunológico revelou: Leucócitos - 5,5 x 109/l Linfócitos -37%, abs. 2,03x109

Problema nº 5
Criança, 5 anos, pertence ao grupo de crianças com doenças frequentes e de longa duração, recidivas de ARVI uma vez por mês, focos de infecção crônica (sinusite crônica, adenoidite), linfonodos cervicais aumentados

Durante o exame imunológico
Testes de primeiro nível Contagem total de glóbulos brancos. Leucofórmula Linfócitos T Linfócitos B

Análise geral de sangue
Unidades norma SI Hemoglobina M F 130,0-160,0 120,0-140,0 g/l

Principais marcadores CD das células do sistema imunológico
Marcador CD População celular % de células CD2 Células T e NK

Subpopulação de linfócitos em crianças
linfócitos 4-5 dias - 3 meses 4-8 meses 1-2 anos 2-5 anos mais de 5 anos todos

Nível de imunoglobulinas no soro sanguíneo de adultos
IgM IgG IgA IgE 1,3 – 1,7 g/l 12 – 14 g/l 2,1 – 2,9 g/l

Painel MAST de alergia (teste de alergoabsorção múltipla) para identificar imunoglobulinas específicas para alérgenos de vários grupos
Painel Ig E para alimentos Painel Ig E estendido russo Painel Ig E para alimentos Painel Ig E universal russo

Glossário de termos
Avidez é a força de ligação de um antígeno a um anticorpo, que é determinada pela afinidade e valência dos anticorpos. Aglutinação - agregação para

Lista de abreviaturas e símbolos
AG – antígeno AOK – célula formadora de anticorpo APC – célula apresentadora de antígeno AT – anticorpo VLS – vaso linfático eferente VVC – infectado por vírus