O DNA recombinante é introduzido nas células receptoras. EM Engenharia genética essas células receptoras desempenham 2 funções. 1. Eles permitem pesquisar clones de DNA recombinante sintetizado no banco de genes. 2 Posteriormente, essas células receptoras podem ser utilizadas para obter produtos alvo.

O método de introdução do DNA recombinante é levado em consideração com base no tipo de vetor em que esse DNA recombinante foi obtido e nas células de quais organismos ele deve ser introduzido pela transformação de uma célula ou protoplasto, ou pelo método de eletroporação. Se o DNA recombinante for obtido de fagos, ele pode ser introduzido no DNA isolado - isto é transvecção. Você pode introduzir partículas fágicas intactas - isso é uma infecção (cosmídeos, fasmídeos).

Dr. caminhos troca genética– conjugação, transdução.

Em células vegetais – transformação de protoplastos vegetais, processamento de células ou tecidos vegetais com DNA recombinante; a injeção de DNA recombinante no núcleo é amplamente utilizada; uso de lipossomas. Os lipossomas são estruturas esféricas que possuem uma concha lipídica, dentro da qual existe DNA recombinante. Para introdução em células animais - infecções virais, método de eletroporação, microinjeção no núcleo. Se, após a introdução do DNA recombinante, todas as células do corpo o herdam, então se fala em obter um organismo transgênico.

Eletroporação - células ou protoplastos são expostos à corrente por um curto período de tempo alta voltagem(2.000-4.000 volts). Como resultado, são formados poros de aproximadamente 100 mm na membrana celular. 30 nm, que pode existir por 1-2 minutos e através do qual o DNA recombinante pode entrar na célula. Os poros então se fecham e o DNA permanece na célula. Este é um método universal.

Método balístico– são usados ​​principalmente em eucariotos. São utilizadas armas balísticas, nas quais são introduzidas partículas AK ou W, sobre as quais é pulverizado DNA recombinante. Então, com a ajuda de gases inertes em P, essas partículas são disparadas de uma arma para a cultura celular. De acordo com vários padrões, algumas das partículas entram no núcleo e o DNA recombinante é retido ali.

Procure clones com DNA recombinante.

Esta fase é difícil e imprevisível.

O método mais simples é procurar clones por fenótipo após a introdução de DNA recombinante(por exemplo, pigmentação). Pode-se utilizar testes de complementação, mas é necessário ter células mutantes que apresentem defeito na síntese do produto ativo.

Os métodos de hibridização requerem a presença de sondas específicas de DNA ou RNA marcadas. Mais frequentemente, eles são rotulados como P 32. Sondas m.b. sequências oligonucleotídicas curtas que correspondem à parte mais conservada do gene que está sendo pesquisado. Estas sequências conservadas podem incluir até 100 nucleotídeos para procariontes e até 1.000 para eucariotos.

Após a introdução do DNA recombinante, as colônias formadas no meio são transferidas para um filtro especial de nitrocelulose. Eles são submetidos à lise e subsequente desnaturação do DNA usando álcali. O DNA se liga firmemente ao filtro. O filtro é lavado e tratado com uma sonda marcada radioativamente, e o clone ao qual esta sonda se ligou é determinado.

Métodos imunoquímicos– após a introdução do DNA recombinante, os clones são lisados ​​e tratados com anticorpos para o produto correspondente. Esses anticorpos são marcados.

Chang Lu é professor assistente de engenharia química na Virginia Tech. (Foto: Virginia Tech)

Professor Associado, Departamento de Engenharia Química Universidade de Tecnologia Virgínia ( Virgínia Tecnologia) Chang Lu e sua equipe de pesquisa de engenheiros químicos descobriram como “melhorar significativamente” a entrega de material genético às células - ADN. Um artigo descrevendo seu trabalho foi publicado em uma importante revista de microfluídica. Laboratório em um chip, bem como em Natureza .

O objetivo final do Dr. Lu é aplicar o método que desenvolveram para criar células geneticamente modificadas para imunoterapia e tratamento do câncer. células-tronco e regeneração tecidual.

Um dos mais utilizados métodos físicos entregar genes às células é “incrivelmente ineficiente porque apenas uma pequena porção da superfície total da membrana é permeável”, disse o Dr.

O método ao qual Lu recorreu é chamado eletroporação, em homenagem ao fenômeno de aumento da permeabilidade celular conhecido há décadas como resultado da aplicação a elas campo elétrico, levando à formação de minúsculos poros em sua membrana.

Lu explica o mecanismo de ação do método de eletroporação que ele e seus colegas aperfeiçoaram desta forma: “Os métodos convencionais de eletroporação entregam DNA apenas através de uma porção muito limitada da superfície celular, determinada pelos fenômenos físicos que governam as interações entre o campo elétrico e a célula. Nosso método nos permite alcançar a entrega uniforme de DNA em toda a superfície celular, o que, até onde sabemos, foi demonstrado pela primeira vez. O resultado é um enorme aumento na transferência de material genético.”

A nova abordagem utiliza “efeitos hidrodinâmicos que só ocorrem quando os fluxos de fluidos se movem através de canais curvos. Sabe-se que nessas condições o fluxo forma vórtices. As células transportadas por esse fluxo giram e a maior parte de sua área superficial fica exposta ao campo elétrico.” A entrega de genes usando fluxos em canais curvos tem vantagens significativas sobre a eletroporação tradicionalmente usada em soluções estáticas e canais retos.

“O canal espiral dá um aumento duplo em relação a um canal reto e ainda maior em relação a uma solução estática”, explica o cientista.

Usando microscopia de fluorescência, os cientistas conseguiram “mapear” as áreas eletroporadas na superfície da célula e determinar a extensão da entrada de DNA nela.

Foto do site Lab on a Chip

A entrega convencional de DNA usando dispositivos do tipo cubeta com uma suspensão celular estática ocorre apenas em uma faixa estreita da superfície celular. Se a eletroporação for realizada em células flutuando em um canal espiral ou curvo, as imagens serão significativamente diferentes, demonstrando uma distribuição uniforme da transferência de DNA por toda a superfície da célula.

Métodos para introdução direta de genes nas células

A introdução direta de um gene em uma célula é realizada de várias maneiras:

Transfecção

Microinjeção

Eletroporação

Método de minicélula

Embalagem em lipossomas

Canhão de elétrons

No transfecções O DNA é adsorvido em cristais de fosfato de cálcio (Graham Van der Eb, 1973). Partículas de precipitado de cálcio são formadas. Eles são absorvidos pela célula por fagocitose.

Para aumentar a eficiência da transformação, um transportador de DNA inespecífico é adicionado ao DNA específico que contém o gene para o qual será feita a seleção. Normalmente, o DNA é retirado do timo de bezerro ou esperma de salmão para essa finalidade. Parte do DNA se liga à membrana e não entra nas células. O DNA é aceito por 15 a 90% das células. Alguns dias após a administração, uma pequena proporção de células é capaz de expressar genes estranhos, mas depois o nível de expressão cai e 10 -3 - 10 -5 células sofrem uma transformação mais ou menos estável.

DEAE-dextrano, um polímero que adsorve DNA, também é utilizado para transfecção. O efeito de entrada celular e o tempo de expressão são elevados, mas a frequência de transformação estável é menor do que quando se utiliza precipitado de cálcio. A frequência da transfecção é aumentada pelo choque de glicerol (4 minutos numa solução de glicerol a 15% em tampão HEPES).

Qualquer gene pode ser introduzido nas células se for previamente ligado a um marcador selecionável clonado. No entanto, estudos adicionais mostraram que a ligação fora da célula não é necessária. As células que absorvem um gene seletivo também absorvem outro DNA presente no precipitado de cálcio. Assim, usando o método cotransformações, quase qualquer segmento de DNA clonado pode ser introduzido em células eucarióticas cultivadas se esse DNA for incluído junto com um marcador selecionável na mistura para formar um precipitado de cálcio.

Cromossomos ou fragmentos de cromossomos podem ser usados ​​para transfecção. As células doadoras são bloqueadas na fase de mitose. Os cromossomos mitóticos são liberados sob a influência do choque osmótico e da homogeneização. Eles são purificados por centrifugação diferencial. Os cromossomos são depositados na superfície das células cloreto de cálcio, e após algumas horas são tratados com um reagente que pode perfurar membranas (por exemplo, glicerol).

Para processar as células receptoras, são utilizadas preparações cromossômicas grosseiramente purificadas, uma vez que os cromossomos são menos destruídos. O número de cromossomos para processar 1 célula é limitado. É melhor usar no máximo 20 cromossomos por célula receptora, pois quando altas concentrações Eles aglutinam cromossomos em suspensão. A célula receptora contém fragmentos de cromossomos doadores que podem ser integrados ao genoma e replicar-se independentemente. Deleções são frequentemente observadas em fragmentos introduzidos.

Nem todas as células são capazes de transformar o DNA genômico com alta frequência. Os fibroblastos humanos incorporam eficientemente DNA plasmídico e quase não incorporam DNA genômico.

Microinjeção de DNA em células de mamíferos tornou-se possível com o advento de um dispositivo para fabricação de micropipetas com diâmetro de 0,1-0,5 mícrons e um micromanipulador (Fig. 45). Assim, plasmídeos contendo um fragmento do vírus do herpes com o gene da timidina quinase (TK) e o plasmídeo pBR322 foram injetados em células TK e foi demonstrado que o gene TK penetrou nos núcleos e se replicou normalmente neles. O método de introdução de DNA por microinjeção foi desenvolvido no início dos anos 70 por Anderson e Diakoumacos. Em princípio, com bons equipamentos, 500-1000 células podem ser injetadas em 1 hora, e nos melhores experimentos, integração e expressão estáveis ​​dos genes injetados são observadas em 50% das células. A vantagem do método descrito também é que ele permite a introdução de qualquer DNA em qualquer célula, e nenhuma pressão seletiva é necessária para manter o gene introduzido nas células.

Arroz. 45. Introdução de DNA por microinjeção

Eletroporação baseia-se no fato de que pulsos de alta tensão aumentam reversivelmente a permeabilidade das biomembranas. Células e fragmentos de DNA que precisam ser introduzidos nas células são adicionados ao meio de eletroporação (Fig. 46). Pulsos de alta tensão (tensão 200 - 350 V, duração do pulso 54 ms) passam pelo meio, levando à formação de poros (ruptura elétrica) no citoplasma. membrana de plasma, cujo tempo de vida e tamanho são suficientes para que macromoléculas como o DNA ambiente externo entram na célula como resultado de forças osmóticas. Ao mesmo tempo, o volume da célula aumenta.

A intensidade do campo elétrico e a duração de sua ação, a concentração de DNA transformador e células receptoras para cada sistema celular são selecionadas experimentalmente para atingir alta porcentagem absorção de DNA pelas células sobreviventes. É mostrado que em condições ideais Eletroporação, o número de transformantes pode chegar a 80% das células sobreviventes.

A eletroporação é física, não método bioquímico, e isso, aparentemente, determina seu uso generalizado. Numerosos estudos demonstraram que a eletroporação pode ser usada com sucesso para introduzir moléculas de DNA em diferentes tipos de células, como células animais cultivadas, protozoários, leveduras, bactérias e protoplastos vegetais. O efeito eletroporante de uma descarga de alta tensão em uma membrana lipídica de bicamada parece depender do seu raio de curvatura. Portanto pequeno células bacterianas absorvem efetivamente DNA a uma voltagem significativamente mais alta (10 kV/cm ou mais) do que animais grandes e células de plantas, absorvendo efetivamente DNA a uma intensidade de campo de 1-2 kV/cm.

A eletroporação é o método mais simples, eficaz e reprodutível de introdução de moléculas de DNA nas células. Porém, até recentemente, esse método era utilizado em um número limitado de laboratórios devido à falta de dispositivos seriais - eletroporadores. O surgimento e o aprimoramento de tais dispositivos nos próximos anos levarão a ampla aplicação esta abordagem em engenharia genética é a mais tipos diferentes células.

Arroz. 46. ​​​​Método de eletroporação

"Mini células" obtido bloqueando células doadoras na mitose com colcemida. Com o tratamento prolongado das células com colcemida, uma nova membrana nuclear é formada ao redor de cada cromossomo. O tratamento com citocalasina B e centrifugação leva à formação de minicélulas representando micronúcleos encapsulados na membrana citoplasmática.

As minicélulas resultantes são muito sensíveis a vários tipos influências, portanto, condições suaves especiais são selecionadas para fusão. O método é difícil, caprichoso, de baixa eficiência - 10 -6 - 10 -7.

Embalagem em lipossomas usado para proteger o material genético exógeno da ação destrutiva das enzimas de restrição.

Os lipossomas são conchas esféricas constituídas por fosfolipídios. Eles são obtidos agitando fortemente a mistura solução aquosa e lípidos, ou por sonicação de emulsões aquosas de fosfolípidos. Os lipossomas constituídos por fosfatidilserina e colesterol são mais adequados para a introdução de ADN em células animais e vegetais. Os sistemas de transferência de lipossomas apresentam baixa toxicidade para as células.

Método de balística biológica (biolística)é um dos métodos mais eficazes para transformar plantas atualmente, especialmente monocotiledôneas.

A essência do método é que o DNA vetorial contendo a construção genética necessária para a transformação é pulverizado em minúsculas partículas de tungstênio com um diâmetro de 0,6-1,2 mícrons. Partículas de tungstênio contendo DNA são aplicadas a um substrato de celofane e colocadas dentro de uma pistola biolística. O calo ou suspensão de células é aplicado em uma placa de Petri com meio ágar e colocado sob uma pistola biolística a uma distância de 10-15 cm.A pressão na pistola é reduzida para 0,1 atm usando uma bomba de vácuo. No momento em que a pressão é liberada, partículas de tungstênio são ejetadas do canhão biolístico com enorme velocidade e, rasgando paredes celulares, entre no citoplasma e no núcleo das células.

Normalmente, as células localizadas diretamente no centro morrem devido a grande quantidade e pressão das partículas de tungstênio, enquanto na zona de 0,6-1 cm do centro estão localizadas as células transformadas com mais sucesso. Em seguida, as células são cuidadosamente transferidas para o meio para posterior cultivo e regeneração.

Usando uma arma biolística, plantas monocotiledôneas como milho, arroz, trigo e cevada foram transformadas. Neste caso, foram obtidas plantas transformantes estáveis. Além do sucesso na obtenção de monocotiledôneas transgênicas, a transformação biolística é utilizada para transferência direta DNA em pólen embriogênico e produção rápida de plantas dihaplóides transgênicas, que são um passo importante no trabalho de melhoramento. Atualmente, a transformação de plantas de tabaco tem sido realizada utilizando este método e, após regeneração de plantas haplóides, foram obtidos transformantes estáveis.

Uma das opções mais promissoras para sistemas de entrega de genes em células são os poliplexos - complexos de DNA transportável e polímeros catiônicos de natureza diferente. Este artigo descreve as propriedades de poliplexos baseados em diversos tipos de polímeros catiônicos, seu transporte para os núcleos das células alvo, bem como uma das abordagens para tratamento Neoplasias malignas usando essas estruturas.

Introdução

A terapia genética é o tratamento de doenças hereditárias, oncológicas e outras, através da introdução do material genético necessário nas células do paciente, a fim de alterar especificamente os defeitos genéticos ou dar novas funções às células [Gorbunova et al., 1997]. Para entregar DNA ou RNA às células-alvo, são criados transportadores (vetores) para fornecer alto nível transfecções, ou seja, transferência de DNA ou RNA exógeno (estranho) para certos tipos células. Além disso, os vetores devem fornecer proteção Informação genética, porque Sob condições in vivo, o DNA estranho é instável devido à rápida degradação pelas nucleases séricas, enzimas que decompõem os ácidos nucleicos.

Tipos de transportadores de material genético

Na natureza, existem estruturas especializadas para entregar informações genéticas às células - os vírus. Portanto, passaram a ser utilizados como transportadores de genes. Ao mesmo tempo, o uso de vetores virais tem linha inteira restrições. Em primeiro lugar, esta é a pequena capacidade do material genético transferido e a especificidade celular inerente aos vírus. Em segundo lugar, esta é a possibilidade de os vírus retornarem ao tipo selvagem como resultado da recombinação durante a passagem do mesmo tipo de infecção. Em terceiro lugar, as proteínas das partículas virais são altamente imunogénicas, pelo que a sua administração repetida provoca uma resposta imunitária. Finalmente, a produção em massa de vetores virais ainda é bastante problemática e cara. Atualmente sendo desenvolvido ativamente várias opções transportadores não virais baseados em lipídios catiônicos e polímeros catiônicos. Essas moléculas catiônicas são capazes de formar espontaneamente nanocomplexos automontados com uma molécula de DNA carregada negativamente por meio de interações eletrostáticas. Complexos automontados que consistem em lipídios catiônicos e DNA são chamados lipoplexos; aqueles que consistem em polímeros catiônicos e DNA são chamados poliplexos.

Polímeros catiônicos usados ​​para criar poliplexos

Um grande número de polímeros catiônicos ou policatiões foi proposto para fins de terapia genética e biotecnologia. Os policátions condensam o DNA em nanocomplexos compactos, proporcionando estabilidade ao DNA e proteção contra nucleases. Proteínas catiônicas, homopolímeros sintéticos de aminoácidos (polilisinas, poliargininas), polissacarídeo de quitosana, polietilenimina e dendrímeros podem servir como polímeros de ligação ao DNA. composição diferente e outros polímeros modificados. O grau de compactação do DNA é determinado pela carga total do complexo, que, por sua vez, depende da proporção da quantidade grupos positivos polímeros ao número de grupos fosfato negativos do DNA. Normalmente, na composição dos poliplexos, o policatião está presente em excesso, resultando na formação de complexos nanométricos (de várias dezenas a várias centenas de nm), que são solúveis em água e carregados positivamente (Fig. 1, 2 ). Caso contrário, os complexos serão instáveis.

Arroz. 1. Esquema de formação de poliplexos a partir de polímeros catiônicos e uma molécula circular de DNA (plasmídeo). Arroz. 2. Imagem de poliplexos em substrato obtido por transmissão microscópio eletrônico(divisão de escala 200 nm), .

Um dos primeiros policátions utilizados para entrega de genes foi a poli-L-lisina (PL, Fig. 3), que, devido à sua natureza peptídica, é biodegradável, o que o torna extremamente conveniente para uso in vivo. Muitas vezes para eliminar efeitos indesejados relacionado a alta densidade carga superficial, é utilizado um copolímero de PL com polietilenoglicol (PEG). Como resultado desta modificação, a carga superficial do complexo diminui, o que evita a adsorção inespecífica de proteínas séricas carregadas negativamente nos poliplexos e também reduz a citotoxicidade dos complexos.

A polietilenimina (PEI, Fig. 3) é considerada uma das opções mais promissoras de policatiões para a criação de poliplexos a partir dela. O PEI é sintetizado em duas formas: linear e ramificada. PEI tem grande quantia grupos amino e imino capazes de protonação, pelo que exibe propriedades tamponantes em condições fisiológicas. Os poliplexos baseados em PEI são caracterizados por transfecção e proteção mais eficientes contra a ação de nucleases em comparação com outros policátions, o que está associado a uma alta densidade de carga no PEI e a um dobramento de DNA mais compacto. A forte carga positiva leva à toxicidade do PEI, que, juntamente com a falta de degradação biológica do PEI, são fatores limitantes para o uso do PEI in vivo. Para reduzir a citotoxicidade, o PEI é modificado com polietilenoglicol, que apresenta baixa toxicidade e alta hidrofilicidade.

Arroz. 3. Polímeros catiônicos usados ​​para criar poliplexos, e.

Outro representante dos policatiões utilizados na entrega de informação genética são as poliamidoaminas (PAMAM, Fig. 3). Esses compostos são dendrímeros altamente ramificados. Graças à ramificação, os PAMAMs têm grande flexibilidade, compactam melhor o DNA e os poliplexos baseados neles são mais estáveis ​​​​do que todos os outros. Suas propriedades têm muito em comum com o PEI.

As quitosanas (Fig. 3) são polissacarídeos construídos a partir de D-glucosamina e N-acetil-D-glucosamina ligados por (1>4) ligações glicosídicas. Dependendo do peso molecular e do grau de desacetilação, as quitosanas formam complexos estáveis ​​de vários tamanhos com o DNA transferido. Polímeros de quitosana pequenos ou, inversamente, muito grandes levam a uma diminuição na expressão do gene transferido. A principal vantagem dos poliplexos à base de quitosana é a biodegradabilidade.

A eficiência de entrega dos poliplexos é influenciada por muitos fatores: peso molecular, grau de ramificação, polimerização e tipo de polímero, tamanho de partícula, força iônica da solução, cargas superficiais dos complexos, bem como condições experimentais. A abordagem ideal deve levar em consideração cada um desses fatores e sua influência nas propriedades do complexo, na absorção dos complexos pelas células-alvo e na toxicidade.

Existem várias abordagens para garantir a especificidade da ação dos poliplexos nas células-alvo. Um deles envolve a entrega direcionada de nanocomplexos a certos tipos de células. Esta abordagem está associada à adição de componentes (ligantes) a poliplexos, cujos receptores são grandes quantidades presente na superfície das células-alvo. Várias proteínas, açúcares, peptídeos, anticorpos, etc. são usados ​​como ligantes específicos. Outra estratégia é utilizar genes transportáveis ​​que estariam ativos apenas em determinadas células, enquanto a entrega dos complexos ocorre de forma inespecífica, ou seja, para quaisquer células.

Penetração de poliplexos em células alvo

O processo de entrega do material genético inclui duas etapas: extracelular (caminho do local da injeção até as células-alvo) e intracelular (interação com células-alvo, endocitose, saída dos endossomos, entrega ao núcleo). As vias de transporte intracelular de poliplexos são apresentadas na Figura 4.

A primeira barreira que o poliplex precisa superar em seu caminho até a célula-alvo é o sangue e a matriz extracelular. Por isso é necessário selecionar tais parâmetros físico-químicos do complexo para aumentar sua estabilidade, evitar interações inespecíficas e a possibilidade de resposta imune. Em primeiro lugar, o ADN num poliplexo deve ser protegido da acção de nucleases extracelulares. Em segundo lugar, proteínas séricas carregadas negativamente (albumina, fibrinogênio, imunoglobulinas, etc.), bem como proteínas da matriz extracelular (colágenos) são capazes de adsorver na superfície de nanocomplexos carregados, o que leva a uma mudança na carga superficial dos poliplexos , levando ao aumento do tamanho dos complexos e à sua agregação. Quando os poliplexos são introduzidos no corpo, eles se acumulam parcialmente nos tecidos e sofrem fagocitose. Por estas razões, a administração local de poliplexos (por exemplo, num tumor no cancro) é frequentemente utilizada com base na sua interacção não específica com células de tecido.

Arroz. 4. Vias intracelulares para transporte de poliplexos.

Os poliplexos são primeiro adsorvidos à membrana plasmática, absorvidos por endocitose, após o que devem deixar os endolisossomos e cruzar o envelope nuclear para entrar no núcleo. Existem também rotas alternativas de transporte que nem sempre levam à entrega dos complexos ao núcleo. Além disso, a expressão do gene transferido requer a dissociação do poliplexo num polímero catiónico e ADN livre.

A próxima etapa da entrega do material genético às células-alvo é a sua interação com a membrana plasmática e a absorção pela célula. Como observado acima, a ligação de poliplexos às células na ausência de um ligante ocorre de forma inespecífica, como resultado da interação eletrostática com a membrana plasmática carregada negativamente. Na maioria dos casos, esses poliplexos são absorvidos por endocitose adsortiva inespecífica. Ao incorporar um ligante no complexo, a captação pode ser alcançada através de endocitose mediada por receptor dependente de clatrina. Outras vias de captação dependem do tipo de célula e incluem fagocitose e endocitose dependente de caveolina. Uma estratégia para melhorar a distribuição celular de poliplexos envolve a utilização de péptidos de entrada viral, tais como o péptido TAT, primeiro isolado do vírus HIV-1. O uso dessas sequências garante que as construções entrem na célula e os poliplexos sejam entregues Núcleo celular.

Um dos mais etapas importantes A rota de transporte dos poliplexos é a sua saída dos endossomos. Como se sabe, os endossomos são um sistema de tubos e vesículas necessários para a classificação das macromoléculas absorvidas. Os endossomos de classificação estão localizados mais próximos da membrana plasmática. Devido ao trabalho bombas de prótons seu pH diminui (cerca de 6,5 na classificação de endossomos). O transporte adicional pode ocorrer ao longo do caminho de reciclagem com a liberação de moléculas absorvidas no espaço extramembranar, ou ao longo do caminho lítico, quando ocorre mais acidificação do ambiente nos endossomos tardios e as macromoléculas entram nos lisossomos. Nos lisossomos, o conteúdo é acidificado até pH 5 e as moléculas absorvidas são degradadas por enzimas hidrolíticas que são ativadas em pH baixo. Os produtos de degradação são removidos da célula por exocitose ou transferidos para o citoplasma, onde são utilizados como material de construção.

Acredita-se que os poliplexos à base de PEI, devido às suas propriedades, sejam capazes de sair dos endossomas devido ao chamado “efeito esponja de prótons”. Esta hipótese baseia-se no fato de que os polímeros catiônicos, devido à presença de aminas secundárias e terciárias não protonadas, criam um efeito tampão, como resultado do qual a H±ATPase, que bombeia prótons para os endossomos, passa a atuar mais ativamente. Nesse caso, os ânions cloro se acumulam no interior dos endossomos. Como resultado, devido aumento acentuado pressão osmótica ocorrem inchaço e lise, permitindo que os poliplexos entrem intactos no citosol. Outro mecanismo de saída dos endossomos foi proposto para poliplexos, que envolve a desestabilização da membrana endossomal devido à alta densidade de carga superficial dos nanocomplexos. Complexos à base de PL e quitosana não causam o efeito “esponja de prótons” e são menos capazes de desestabilizar a membrana do endossomo, o que leva a uma eficiência de transfecção muito menor.

Tendo deixado os lisossomos, os poliplexos encontram-se no espaço perinuclear, após o qual o complexo se dissocia em um policátion livre e em DNA. Acredita-se que isso ocorra devido à competição por grupos catiônicos entre os grupos fosfato do DNA e compostos de baixo peso molecular e ânions do citoplasma. Em alguns casos, a dissociação do complexo aparentemente ocorre no núcleo. A principal barreira para o caminho do DNA plasmidial até o núcleo da célula é o duplo envelope nuclear. Para entregar macromoléculas ao núcleo, eles incluem uma sequência de localização nuclear (NLS), que, em combinação com α e β-importinas, será reconhecida pelo complexo de poros nucleares (NPC) e penetrará ativamente no núcleo. Apenas pequenas moléculas podem passar através do NPC por difusão passiva (<40 кД, ~10 нм). Так как освободившаяся после распаковывания комплекса свободная плазмидная ДНК не имеет последовательности ядерной локализации, то в ядро будет проходить очень незначительная часть плазмид (не более 0,1–0,001%). Кроме того, установлено, что около 50% инъецированной ДНК деградирует в цитозоле уже через 1–2 часа после введения . Но т.к. клетки опухолей, против которых и направлена генная терапия, отличаются активной пролиферацией, то ДНК без труда проникает в ядра дочерних клеток во время митотического цикла, когда ядерная оболочка демонтирована.

Mecanismos de ação dos genes terapêuticos

Depois que o plasmídeo entra no núcleo, começa a expressão do gene terapêutico. Para conferir especificidade à ação dos poliplexos, o gene terapêutico no plasmídeo é colocado sob o controle de um promotor (a região do gene na qual a RNA polimerase pousa antes da transcrição), que é ativo apenas em tecidos tumorais. Os exemplos incluem o promotor do gene da proteína antiapoptótica survivina ou o gene da enzima telomerase. O gene da timidina quinase do vírus herpes simplex (HSVtk), que tem a capacidade de fosforilar os compostos anti-herpes aciclovir e ganciclovir, pode ser usado como gene terapêutico. Esses compostos são injetados no tumor após algum tempo. Em seguida, as quinases celulares (enzimas fosforilantes) convertem o aciclovir ou ganciclovir fosforilado em trifosfatos, que podem ser incluídos no DNA recém-sintetizado durante a duplicação durante a divisão celular e encerrar sua síntese. Como resultado, as células em cujos núcleos o gene da timidina quinase entrou são destruídas na presença dessas substâncias. Nesse caso, são as células em divisão que morrem, e não as em repouso, que não sintetizam DNA e não incluem ganciclovir ou aciclovir. Este mecanismo de ação de um gene terapêutico pode ser usado para terapia genética de tumores cancerígenos cujas células se dividem rapidamente.

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Durymanov Mikhail, estudante da Faculdade de Biologia da Universidade Estadual de Moscou

O artigo é premiado no popular concurso científico da conferência Lomonosov 2009 (Faculdade de Biologia, seções “Nanobiotecnologia”, “Bioengenharia”, “Biofísica”.

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Atualmente, são conhecidos cerca de 40 métodos diferentes de entrega de DNA recombinante nas células, resolvendo o problema de atravessar a membrana plasmática de diferentes maneiras. Ainda não existe uma classificação unificada de métodos para entrega de DNA recombinante nas células. Cada autor da revisão classifica à sua maneira, talvez porque para muitos métodos encontrados empiricamente o mecanismo de superação da membrana ainda não esteja claro, por exemplo, para transformação. Há também incerteza em relação à terminologia, o que não é surpreendente num novo campo da ciência e da prática em rápido desenvolvimento.

Cada método de entrega de DNA estranho nas células tem suas próprias características, vantagens e desvantagens em termos de sobrevivência celular, eficiência de administração, versatilidade e possibilidades de implementação técnica. A escolha do método depende do tipo de células hospedeiras e do tipo de vetor utilizado, bem como da preferência pessoal e das capacidades do experimentador. Alguns dos métodos mais conhecidos de entrega de DNA às células alvo são discutidos em detalhes abaixo.

A transformação no seu sentido mais geral é o processo de introdução de DNA livre em uma célula. Num sentido mais restrito, o termo é aplicado principalmente a bactérias, denotando o processo de absorção de DNA recombinante por células competentes, induzido por uma transição de fase de temperatura da membrana celular. E. coli é o organismo mais comum quando se trabalha com DNA recombinante e, para garantir a introdução de DNA plasmídico nas células, as células são incubadas com uma solução gelada de CaCl2 e DNA e depois submetidas a choque térmico a 42°C por ~1 min .

Aparentemente, como resultado desse tratamento, ocorre destruição local da parede celular. Eficiência de transformação, que é definida como o número de transformantes por 1 μg de DNA adicionado,
neste caso é aproximadamente 10.000 - 10.000.000. A eficiência deste método é baixa, aproximadamente menos de 0,1% das células são transformadas, mas esta desvantagem é compensada pela utilização de esquemas de seleção que permitem identificar rapidamente os clones desejados.

As células que podem absorver DNA estranho são chamadas de competentes. A proporção dessas células na população costuma ser muito pequena, mas pode ser aumentada por meio de meio nutriente especial, condições de cultura e indutores químicos de competência (selecionados, via de regra, empiricamente). Uma etapa frequentemente utilizada na preparação de células competentes é a produção de esferoplastos - células parcial ou completamente (protoplastos) sem uma parede celular externa rígida.

Por exemplo, esta é a única forma de transformar eficazmente muitas bactérias gram-positivas dos géneros Bacillus, Listeria, Streptommyces, etc. Alguns métodos de transformação de leveduras também incluem as fases de remoção enzimática da parede celular da levedura utilizando glucosidases. Para organismos que são resistentes a indutores químicos de competência ou que não possuem competência natural, são utilizados outros sistemas de entrega de DNA.

Conjugação. Existem plasmídeos bacterianos (plasmídeos conjugativos) que têm a capacidade de criar contatos intercelulares, através dos quais passam de uma célula para outra. A formação de contatos entre as células doadoras e receptoras é garantida pelas propriedades conjugativas dos plasmídeos, e a própria transferência de DNA é garantida pelas propriedades de mobilização. Neste caso, o plasmídeo conjugativo pode transportar consigo um vetor plasmídico regular localizado na mesma célula.

Desta forma, é possível transformar células receptoras que são difíceis de transformar por outros meios. Por exemplo, foi demonstrada a transferência de mobilização do vetor transportador pAT187 com uma ampla gama de hospedeiros de E. coli para várias bactérias gram-positivas (gênero Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus, etc.), embora com eficiência muito menor do que para transferência entre diferentes cepas de E. coli.

Além disso, foi recentemente demonstrada a possibilidade de transferência conjugativa de ADN de células bacterianas para células animais cultivadas. Durante o processo de conjugação, apenas uma fita do plasmídeo doador é transferida, na qual a segunda fita é então sintetizada. Isto resulta no plasmídeo transferido conjugativamente não ser atacado pelas enzimas de restrição do hospedeiro. A eficácia deste método para bactérias é comparável à da transformação.

Infecção viral. Para introduzir vetores baseados em vírus, é amplamente utilizada a via infecciosa natural de infecção da célula hospedeira, que depende do tipo de vírus.

Métodos de perfuração. Um dos métodos populares para a introdução de ácidos nucleicos em células-alvo é a eletroporação - a criação temporária de poros em uma membrana lipídica de bicamada sob a breve influência de um campo elétrico. É um método físico universal de transformação, cuja técnica foi desenvolvida para quase todos os tipos de células.

Ao trabalhar com E. coli, a suspensão celular preparada (~50 μl) e o DNA são colocados entre os eletrodos e um único pulso de corrente com duração de ~4,5 ms a uma voltagem de 1,8 kV é aplicado, a distância entre os eletrodos é de 1 mm. Após tal tratamento, a eficiência de transformação aumenta para 109-1011 para plasmídeos pequenos (~3-6 kb) e para 106 para plasmídeos grandes (~135 kb). Condições semelhantes são usadas para introduzir o vetor BAC em E. coli.

O efeito eletroporante de uma descarga de alta tensão em uma membrana lipídica de bicamada parece depender do seu raio de curvatura. Portanto, as células bacterianas pequenas absorvem efetivamente o DNA com uma intensidade de campo muito maior (12-18 kV/cm) do que as células grandes de animais e plantas, que absorvem efetivamente o DNA com uma intensidade de campo de 1-2 kV/cm. A eletroporação é o método mais simples, eficaz e reprodutível de introdução de moléculas de DNA nas células, o que, no entanto, requer um dispositivo eletroporador especial.

Outros métodos de perfuração para entrega de DNA nas células: ultrassonicação de células, raspagem de células do substrato na presença de material exógeno, centrifugação de células em meio com DNA em combinação com eletroporação, perfuração osmótica da membrana plasmática, quebra celular com laser microfeixe, uso da toxina formadora de poros estreptolisina-O.

Transfecção. Inicialmente, este termo significava a introdução de ADN viral nas células; agora o seu significado expandiu-se para significar a introdução de qualquer ADN estranho em células eucarióticas. O termo “transformação”, que se refere ao processo de introdução de DNA em uma célula para procariontes e leveduras, revelou-se inconveniente de usar, pois em relação às células animais a transformação é a transformação de células normais em cancerosas. Num sentido estrito, a transfecção refere-se principalmente à introdução de DNA em células eucarióticas utilizando vários reagentes químicos.

Um dos primeiros métodos desenvolvidos para transfecção eficiente foi a incubação de DNA com DEAE-dextrano. A eficiência resultante foi comparável à transformação bacteriana e atingiu 106 transfectantes por μg de DNA.

O mecanismo de ação do DEAE-dextrano não foi totalmente estabelecido, mas sabe-se que ele se liga ao DNA e à membrana celular, estimulando a pinocitose (Fig. 2.8), embora não seja absorvido pelas células. As desvantagens do método incluem a toxicidade do DEAE-dextrano para alguns tipos de células, a dependência da eficácia da qualidade do fármaco e a frequência muito baixa de obtenção de transfectantes estáveis.

Arroz. 2.8. Esquema de introdução de DNA como parte de vários complexos na célula por endocitose: fagocitose e pinocitose (a). Representação esquemática de uma partícula de um policátion não lipídico em um dendrofórmio com DNA ligado, cuja carga negativa é compensada por um polímero catiônico (b)

A eficiência da transfecção foi aumentada 10-100 vezes pela incubação de células com ADN precipitado com fosfato de cálcio. Partículas densas de precipitado de DNA de cálcio são absorvidas pela célula por fagocitose (Fig. 2.8), mas apenas uma pequena parte das moléculas penetradas atinge o núcleo e é integrada ao DNA cromossômico. O método do fosfato de cálcio é mais eficaz e mais barato, mas provoca a quebra das moléculas de ADN, o que converte as moléculas circulares numa forma linear, por vezes não infecciosa no caso de transfecção viral. Além disso, as condições para a transfecção com fosfato de cálcio devem ser selecionadas individualmente para cada célula alvo.

Durante a procura de outros reagentes de transfecção, descobriu-se que as moléculas de polímero que transportam uma carga catiónica em excesso podem aumentar significativamente a eficiência da transfecção. Os cátions poliméricos formam complexos estáveis ​​​​com cargas neutralizadas com ácidos nucléicos, que podem transportar DNA e RNA para dentro da célula com alta eficiência, protegendo-os da ação das endonucleases no caminho para o núcleo (Fig. 2.9).

Arroz. 2. 9. Esquema de transporte de DNA para o núcleo da célula como parte de um complexo policatião-DNA ligado a um ligante específico por endocitose mediada por ligante

Cátions poliméricos não lipídicos sintéticos em conformações lineares ou ramificadas (forma dendrítica) podem condensar DNA e RNA em partículas relativamente pequenas, que então se ligam à membrana celular e entram na célula por endocitose inespecífica. Atualmente, para a transfecção do grupo dos policátions não lipídicos, utilizam-se principalmente polietilenonimina, poliamidoaminas e dendrímeros a partir deles, proteínas catiônicas como polilisina, protamina e histonas, além de diversos produtos comerciais, como o PAMAM.

A revolução foi a introdução na prática do primeiro lipídio catiônico de baixa toxicidade DOTMA (1,2-dioleil-3-N,N,N-trimetilaminopropano), sintetizado por Feigner (1987) et al. A eficiência de transfecção utilizando o lipídeo catiônico (Fig. 2.10) foi aproximadamente 100 vezes maior do que qualquer outro reagente químico, com alta proporção de células transgênicas estáveis.

Arroz. 2. 10. Estrutura do complexo com DNA (a) e estrutura geral do polímero lipídico catiônico (b). Polímeros lipídicos catiônicos (lineares e ramificados), semelhantes em estrutura e propriedades aos fosfolipídios da membrana celular, formam complexos com DNA na forma de lipossomas catiônicos multicamadas (a) simplesmente misturando os reagentes. Tais complexos entram na célula por endocitose ou fusão com a membrana celular através da parte lipídica

Ao mesmo tempo, um novo termo “lipofecção” foi introduzido na prática, enfatizando a alta eficiência da transformação genética das células, aproximando os complexos lipídico-cátion das partículas virais infecciosas.

Com base neste sucesso, foram desenvolvidas numerosas variações destes compostos (lipofectina, lipofectamina, cellfectina, etc.).

Paralelamente, foram desenvolvidos veículos de entrega baseados em lipossomas fosfolipídicos preenchidos com DNA ou RNA.

Pequenas esferas de membranas artificiais podem fundir-se com as membranas plasmáticas das células ou ser absorvidas por endocitose, liberando o conteúdo na célula. A baixa eficiência da transfecção de lipossomas foi aumentada pela introdução de fosfolipídios na estrutura dos lipossomas, por exemplo, cardiolipina e fosfatidiletanolamina, que, juntamente com as membranas de bicamada, também formam estruturas micelares invertidas, conhecidas como fases cúbicas e hexagonais, capazes de iniciar a membrana fusão.

O método lipossômico é bastante caprichoso e requer seleção cuidadosa de todas as condições para uma transfecção eficaz de células específicas. Além disso, o procedimento de encapsulamento, geralmente sonicação, muitas vezes danifica grandes moléculas de DNA.

Uma nova etapa no desenvolvimento de reagentes de transfecção foi o desenvolvimento de uma entrega mais eficaz e direcionada de ácidos nucleicos a células alvo específicas, através da introdução de vários ligantes na estrutura de reagentes de transfecção sintéticos e lipossomas para ligação a proteínas receptoras de membrana. A presença de tais grupos-alvo (ligantes), reconhecidos pelos receptores celulares, permite o uso de mecanismos de endocitose mediados por ligantes (ver Fig. 2.9).

Proteínas e peptídeos reconhecidos por receptores são usados ​​como tais ligantes; oligossacarídeos, uma vez que na superfície de muitas células animais existem lectinas - proteínas receptoras que as ligam especificamente; polissacarídeos. Os processos de interação com células desses complexos reagentes de transfecção de DNA (RNA) direcionados são semelhantes à penetração de partículas virais na célula.

Atualmente, as empresas de biotecnologia oferecem uma ampla gama de diferentes reagentes de transfecção - desde os mais simples e baratos até os mais recentes desenvolvimentos, especializados para diferentes tipos e tarefas celulares. A criação de novos reagentes de transfecção ainda mais eficazes também está em andamento.

Microinjeção - a membrana celular é perfurada com uma microagulha e uma solução contendo DNA é injetada no citoplasma da célula ou diretamente no núcleo se o núcleo for grande o suficiente (por exemplo, o núcleo de um ovo). A microinjeção de DNA em células de mamíferos tornou-se possível com o advento de um dispositivo para produção de micropipetas com diâmetro de 0,1-0,5 μm e um micromanipulador. O método é muito eficaz; a proporção de células com integração estável e expressão de genes injetados pode chegar a 50%. A vantagem do método descrito também é que ele permite a introdução de qualquer DNA em qualquer célula e nenhuma pressão seletiva é necessária para manter o gene introduzido nas células.

A transfecção balística, biobalística ou biolística (bombardeamento de micropartículas), baseia-se no bombardeio de células com microesferas de cerca de 1-2 mícrons de tamanho revestidas com DNA. São utilizadas micropartículas de ouro, tungstênio (às vezes fitotóxicas), silicone e diversas nanoesferas sintéticas. Micropartículas revestidas com DNA passam através das camadas celulares e transferem a construção genética diretamente para organelas e núcleos celulares. A “arma genética” ou “arma genética” criada para esse fim, que foi desenvolvida por J. Sanford em 1987 para introduzir DNA em grãos de cereais, é semelhante em design às armas de ar comprimido (Fig. 2.11).

Arroz. 2.11. Introdução de DNA recombinante em folhas de plantas usando uma “arma genética” reutilizável da Bio-Rad (a) e seu esquema geral (b). Um pulso de hélio ejeta micropartículas revestidas com DNA ou RNA da cápsula da amostra. As micropartículas que transportam DNA são aceleradas e focadas para penetração máxima nas células, movendo-se ao longo do canal de aceleração e ao longo do cano da arma, enquanto na saída ampla o fluxo de hélio diverge difusamente para os lados. O filtro espaçador mantém a distância ideal de envolvimento do alvo enquanto maximiza a remoção de hélio para minimizar efeitos prejudiciais nas superfícies celulares

A profundidade de penetração das micropartículas é, via de regra, pequena - até 1 mm, porém, sob condições especiais de queima, as micropartículas podem penetrar no tecido a uma profundidade de 4-5 mm e transferir genes, por exemplo, para as fibras dos músculos estriados. . A transfecção balística é muito eficaz mesmo quando paredes celulares espessas (leveduras, plantas) são um obstáculo para muitos outros métodos de entrega e é usada incluindo tecidos, órgãos e até organismos inteiros. Atualmente amplamente utilizado em terapia genética para produção de animais e plantas transgênicas.

Esta variedade de ferramentas e métodos de transfecção deve-se a diferentes tarefas, a uma vasta gama de células-alvo utilizadas e tipos de ácidos nucleicos entregues às células, bem como às necessidades da sociedade em obter meios cada vez mais eficazes de entrega de informação genética às células, tecidos e organismos inteiros. É dada especial atenção ao desenvolvimento de reagentes e métodos de transfecção em conexão com as surpreendentes perspectivas da terapia genética humana, que requer meios de entrega de genes direcionados, altamente eficazes e seguros.

Introdução estável e transitória de DNA estranho na célula. Após a introdução do DNA recombinante em uma célula eucariótica, apenas uma pequena parte dele acaba no núcleo, uma vez que a membrana nuclear é uma barreira difícil ao DNA estranho. No núcleo, o DNA recombinante pode ser integrado ao cromossomo ou existir por algum tempo em estado extracromossômico.

Assim, é feita uma distinção entre transfecção estável, quando o DNA recombinante é integrado nos cromossomos das células receptoras e se torna sua parte integrante, bem como transfecção temporária ou transitória, na qual existem moléculas de DNA recombinante e são transcritas nos núcleos em um estado extracromossômico por um curto período de tempo. A herança estável do DNA estranho introduzido é a principal condição para a obtenção de organismos transgênicos para fins econômicos.

Portanto, é dada especial atenção ao desenvolvimento de métodos para introdução de DNA em células que conduzam à produção de uma proporção maior de transformantes estáveis. Além disso, uma grande percentagem de transformantes estáveis ​​também permite abandonar genes selectivos e marcadores, que são lastro na criação de organismos transgénicos.

NO. Voinov, T.G. Volova