Detentores da patente RU 2574968:

A invenção refere-se à medicina, nomeadamente ao diagnóstico laboratorial, e pode ser utilizada para o diagnóstico da hemoglobinúria paroxística noturna. Para isso, a amostra de sangue em estudo é corada com anticorpos monoclonais CD235a (FITC)/CD59(PE)/CD71 (APC). A presença de um clone de HPN entre eritrócitos e reticulócitos é avaliada pela ausência da proteína protetora CD59 na membrana dos reticulócitos isolados pela porta CD235a - marcador pan-eritrocitário e CD71 - receptor de transferrina. Para avaliar o clone HPN entre reticulócitos na porta CD71+ pelo menos 20.000 eventos são coletados dependendo da porta CD71+ é construído um gráfico FSC(log) vs SSC(log) no qual os reticulócitos são isolados usando a porta CD71str adicional limpando assim a população de reticulócitos de detritos e dupletos usando o método de gating sequencial. Se houver 100% de reticulócitos positivos para CD59, avalia-se a ausência de um clone HPN e diagnostica-se a ausência de hemoglobinúria paroxística noturna. Se forem detectados reticulócitos CD59 negativos em um paciente com sintomas clínicos e o valor dos indicadores obtidos for superior a 1%, é dada uma conclusão diagnóstica sobre a presença de um clone de HPN e para confirmar o diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna, um estudo adicional é recomendado de acordo com o protocolo padronizado internacional. Se forem detectados reticulócitos negativos para CD59 e o valor dos indicadores obtidos for de 0,1-1%, a presença de um clone menor de HPN é julgada e recomenda-se redeterminar o clone de HPN após 6 meses para verificar se há um aumento em seu valor e o desenvolvimento de hemoglobinúria paroxística noturna, e se esse tamanho for confirmado, o clone é diagnosticado com uma forma subclínica de hemoglobinúria paroxística noturna sem sinais clínicos. O uso de controle multiparâmetro de células CD71+ torna possível excluir da análise detritos, dupletos e anticorpos monoclonais ligados de forma inespecífica. 1 doente.

A invenção refere-se ao campo da medicina, nomeadamente métodos de diagnóstico clínico e laboratorial, e pode ser utilizada para diagnóstico de triagem de hemoglobinúria paroxística noturna (HPN).

A hemoglobinúria paroxística noturna é uma doença rara.

A HPN ocorre devido a uma mutação no gene PIG-A. Como resultado, a síntese da âncora glicosilfosfatidilinositol (GPI), que fixa numerosas moléculas na membrana das células sanguíneas (incluindo CD24 nos granulócitos, CD14 nos monócitos, CD59 nos eritrócitos e seus precursores), que protegem as células sanguíneas dos efeitos da o sistema complemento é interrompido.

A membrana dos glóbulos vermelhos está mais exposta ao complexo de ataque à membrana e, na ausência da proteína protetora CD59, os glóbulos vermelhos sofrem hemólise.

A HPN é caracterizada por hemólise intravascular, anemia, hemoglobinúria, complicações trombóticas, disfagia, letargia, disfunção erétil, insuficiência renal crônica e hipertensão pulmonar.

Além disso, o clone HPN pode ocorrer na anemia aplástica, na anemia hemolítica autoimune e na síndrome mielodisplásica. A mediana de idade para ocorrência da HPN é de 30 a 35 anos. A incidência de hemoglobinúria paroxística noturna é de 1 a 10:1 milhão de pessoas. A taxa de mortalidade não tratada para hemoglobinúria paroxística noturna é de cerca de 35% dentro de 5 anos após o início da doença.

Atualmente, surgiram tecnologias celulares que permitiram desenvolver métodos modernos de tratamento desta doença.

Nesse sentido, surgiu a necessidade de criar métodos diagnósticos precisos, pois a eficácia e adequação do tratamento dependem da informatividade, objetividade e evidência das medidas diagnósticas, e da completude das informações recebidas, o que permite avaliar a presença de um clone da HPN e esclarecer o diagnóstico.

Existe um método conhecido para detectar HPN usando o método Hem para o diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna (Abdulkadyrov K.M., Clinical Hematology, Reference - St. Petersburg: Peter, 2006, p. 82), baseado na estimulação da inativação do sistema complemento como resultado da acidificação da amostra de sangue e aumento da sensibilidade a ela eritrócitos de pacientes com hemoglobinúria paroxística noturna. O resultado do teste Hem é avaliado visualmente.

O método consiste em adicionar ao soro sanguíneo do doador uma solução normal de HCl 0,2, que é comparável ao soro do paciente segundo o sistema de antígeno ABO, alterando seu pH sérico para 6,4 e causando assim a ativação do complemento (relação soro/ácido 9: 1) . Em seguida, dez volumes de soro de leite acidificado são misturados com um volume de suspensão a 50% de eritrócitos lavados. Em seguida, é realizada uma avaliação visual da suspensão resultante. Na hemoglobinúria paroxística noturna, ocorre hemólise dos glóbulos vermelhos e a suspensão torna-se avermelhada ou vermelha, enquanto os glóbulos vermelhos normais nas mesmas condições não são hemolisados.

No entanto, a técnica não tem sensibilidade suficiente para determinar clones menores de HPN: o tamanho mínimo do clone detectável é de 4,2-5%. O método de Hem não fornece informações sobre o tamanho do clone.

Tudo isso não permite estimar o clone da HPN em percentual, que, quando a doença é detectada durante a triagem, é o ponto de partida para posterior monitoramento e tratamento adequado.

Além disso, a técnica é muito trabalhosa e não atende aos requisitos diagnósticos modernos.

Também existe um método conhecido para diagnosticar hemoglobinúria paroxística noturna usando um teste de sacarose (“Problems of hematology and blood transfusion”, 1972, agosto, 17(8)55-7, “Avaliação do teste de sacarose para o diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna ”, Idelson L.I., Benisovich V.I., Savina L.S., Radzhivilovskaya E.G.).

O método baseia-se no aumento da sensibilidade dos eritrócitos de um paciente com hemoglobinúria paroxística noturna às proteínas do sistema complemento, neste caso devido à adição de sacarose.

Soro de doador fresco idêntico ao grupo sanguíneo do paciente é adicionado aos glóbulos vermelhos do paciente. Os glóbulos vermelhos são lavados três vezes em solução salina (NaCl 0,145 M), 100 μl de sangue citratado ou desfibrinado são adicionados a 900 ml de solução de sacarose e incubados por 30 minutos a 37°C ou 23°C. Os tubos são então centrifugados e o sobrenadante é avaliado quanto à hemólise visível. Caso ocorra hemólise, seu grau, expresso em porcentagem, é calculado a partir da concentração de hemoglobina sobrenadante, que é determinada pelo método da cianometemoglobina.

Amostras de sangue total são misturadas 9:1 com citrato de sódio a 3,2% ou solução de oxalato 0,1 M, e o sangue total é desfibrinado pela adição de uma esfera de vidro de 4 mm a 2 ml de sangue. Alíquotas de sangue total e plasma livre de plaquetas são misturadas em proporções variadas. Uma solução isotônica de sacarose é preparada dissolvendo 0,27 mol de um reagente especial de sacarose em 91 ml de NaH 2 PO 4 50 mM e 9 ml de NaHPO 4. Se necessário, o pH é ajustado para 6,1 com pequenas concentrações de NaOH. 1000 ml de água são despejados no volume final.

Os tubos são centrifugados e o sobrenadante é avaliado quanto à hemólise visível. A porcentagem de hemólise é um valor calculado, calculado a partir da concentração de hemoglobina sobrenadante, determinada pelo método da cianometemoglobina. Também são preparadas outras duas alíquotas - hemólise 100% e hemólise “zero” (sem hemácias) para avaliação da amostra.

A desvantagem desse método é a falta de sensibilidade e especificidade para o diagnóstico da doença: o tamanho mínimo detectável do clone - 4,2-5% não dá uma ideia precisa do tamanho do clone, embora possa estar presente no paciente sangue em valores mais baixos - menos de 4,2%. As desvantagens deste método também incluem a intensidade do trabalho.

Existe também um método conhecido para diagnosticar o clone HPN (Rosse WF. Variations in the red cells in paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. Br J Haematol 1973; 24:327-42. 12), incluindo medição e análise do grau de hemólise em diferentes concentrações de complemento. Este ensaio mostra que as células HPN são lisadas em concentrações mais baixas do que as células normais.

Este teste identifica populações de células com sensibilidade intermediária às proteínas do complemento (tipo II) entre glóbulos vermelhos normais (tipo I) e glóbulos vermelhos patológicos na hemoglobinúria paroxística noturna (tipo III). No entanto, o método é trabalhoso e difícil de padronizar. Ao usar o teste, pequenas populações de células anormais podem não ser detectadas.

Existe um método conhecido para isolar reticulócitos por CD71 para determinar o clone da HPN por citometria de fluxo entre reticulócitos e granulócitos (Tsagarakis NJ, Paterakis G. Asimple flow cytometric assay for rotina paroxysmal nocturnal hemoglobinuria testing based on immature reticulocytes and granulocytes. - ClinicalCytometry, 07.2012 .- C. 259-263) (http://onlinelibrary.wiley.coni/doi/10.1002/cyto.b.21030/full).

O sangue total do paciente é examinado e diluído em solução salina tamponada com fosfato 1:100. 50 μl de sangue diluído são adicionados a dois tubos e, em seguida, é realizada a coloração: no primeiro tubo, 10 μl de anticorpos monoclonais (mAbs) para CD71 e 20 μl de mAbs para CD59; 10 µl de IgGl de controle de isotipo são adicionados ao segundo tubo. Os resultados são avaliados usando histogramas de parâmetro único.

Além disso, o método também analisa granulócitos utilizando combinações de mAbs: 1) CD59-FITC /CD24-PE /CD45-PE-Cy5/; 2) CD66b-FITC/CD16-PE/CD45-PE-Cy5.

De acordo com este método, a sensibilidade de determinação do clone HPN entre granulócitos é de 1%, a sensibilidade de determinação do clone HPN entre reticulócitos é de 5%. No entanto, o método proposto foi testado em um pequeno número de pacientes com hemoglobinúria paroxística noturna (n=8) e com um clone de HPN inferior a 1% (quando avaliado em granulócitos e, consequentemente, inferior a 5% quando determinado em reticulócitos). ) (n=7). Além disso, a sensibilidade da determinação do clone em reticulócitos (5%) não permite a utilização da técnica para avaliação simultânea do clone entre granulócitos e reticulócitos. Ao mesmo tempo, entre as amostras de sangue de pacientes com suspeita de HPN não houve nenhuma com tamanho de clone de 1 a 24%, o que não dá um quadro completo da correlação de valores nessa faixa. Com esta abordagem, o gating de reticulócitos é difícil devido à ausência de um marcador pan-eritrocitário (CD235a) no painel, que é especialmente necessário para isolar uma população pura e eliminar detritos e dupletos. Além disso, para avaliar objetivamente um clone de HPN, devem ser avaliadas dezenas de milhares de células. Um teste utilizando o método proposto requer uma grande quantidade de anticorpos. O número total de eventos bloqueados (CD71) coletados (2.000 eventos) pode não ser suficiente para identificar um clone.

Assim, o método conhecido foi testado em um pequeno número de pacientes com hemoglobinúria paroxística noturna e clone de HPN; células que se ligam inespecificamente aos mAbs CD71 provavelmente distorcerão os resultados da análise. Além disso, para esta análise são utilizados 6 tipos de anticorpos monoclonais, sendo 2 deles utilizados duas vezes, o que se reflete no alto custo do painel de mAb utilizado. O método foi testado em 8 pacientes com HPN, 7 deles apresentavam valor de clone abaixo do limite de sensibilidade (1% para granulócitos, 5% para reticulócitos). Este método não resolve o problema de identificação confiável de clones menores de HPN e não prova a alta sensibilidade do método.

Como análogo mais próximo, é conhecido um método de diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna por citometria de fluxo, proposto pela Associação Internacional de Citometria Clínica (ICCS). (Michael J. Borowitz, Fiona E. Craig, Joseph A. DiGiuseppe, Andrea J. Illingworth, Wendell Rosse, D. Robert Sutherland, Carl T. Wittwer, Stephen J. Richards. Diretrizes para o diagnóstico e monitoramento da hemoglobinúria paroxística noturna e relacionados por distúrbios da citometria de fluxo, online: 28 APR 2010.DOI:10.1002/cyto.b.20525).

O método envolve o estudo da presença de proteínas ligadas ao GPI em granulócitos, monócitos e eritrócitos. O estudo consiste em duas etapas: preparo da amostra e posterior análise em citômetro de fluxo.

Para analisar os glóbulos vermelhos, o sangue total é diluído com solução salina tamponada com fosfato na proporção de 1:100, 10 μl de sangue total são adicionados a 990 μl de solução salina tamponada com fosfato; Em seguida, 40 μl da suspensão celular resultante são adicionados ao tubo rotulado. Para corar eritrócitos, anticorpos monoclonais conjugados com fluorocromos CD59 marcados com CD235FITC e marcados com PE são adicionados à suspensão celular, respectivamente. Após incubação com anticorpos monoclonais durante 30 minutos no escuro, as amostras são lavadas para remover os anticorpos monoclonais não ligados. Para analisar eritrócitos, a lavagem é realizada duas vezes centrifugando a amostra em 4 ml de solução salina tamponada com fosfato a 1500 rpm por 5 minutos, em seguida, o sobrenadante é retirado, as células são ressuspensas e 500 μl de solução salina tamponada com fosfato são adicionados para posterior análise.

Para coletar e analisar glóbulos vermelhos em um citômetro de fluxo, os seguintes gráficos são gerados usando o software do dispositivo:

Gráfico-FS(log) vs (contra) SS(log), no qual a população de eritrócitos é isolada (é criada uma porta de hemácias) e detritos, plaquetas e agregados de eritrócitos são filtrados;

O gráfico CD235a(log) vs FS(log) reflete eventos da porta RBC para destacar mais claramente a população de eritrócitos, a população de eritrócitos positiva para o marcador CD235a e cria uma nova porta (CD235a+)

CD59(log) vs CD235a, (o histograma mostra eventos controlados por CD235a+). O histograma mostra o nível de expressão de CD59 nos glóbulos vermelhos. Células sem deficiência de CD59 - tipo I são eritrócitos normais, células com deficiência parcial de expressão de CD59 são clone de HPN tipo II, células que não expressam CD59, ou seja, eritrócitos com deficiência completa de CD59 são clone de HPN tipo III.

De acordo com o método, são coletados pelo menos 50.000 eventos citométricos.

Para se preparar para a análise de granulócitos e monócitos, adicione 100 μl de sangue periférico a dois tubos rotulados. Em seguida, para corar com anticorpos monoclonais marcados, uma combinação diferente de anticorpos monoclonais marcados é adicionada a cada tubo:

uma combinação de anticorpos monoclonais marcados para determinar o clone HPN entre granulócitos FLAER(AlexaFluor700)/CD15(PE)/CD24(PerCP)/CD45(PE-Cy7) (marcadores de controle: CD45 e CD15, marcadores relacionados a GPI FLAER e CD24) ;

uma combinação de anticorpos monoclonais marcados para determinar o clone HPN entre monócitos FLAER(AlexaFluor700)/CD14PE/CD64PerCP/CD45PE-Cy7, onde foram marcados marcadores: CD45 e CD64, marcadores relacionados ao GPI FLAER e CD14;

As amostras coradas são incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro, após o que 1 ml de solução de lise é adicionado à amostra para remover os glóbulos vermelhos. Após a incubação com a solução de lise, as amostras são centrifugadas durante 5 minutos a 1500 rpm, após a centrifugação o sobrenadante é drenado e os leucócitos do fundo do tubo são ressuspensos. Em seguida, as amostras são lavadas da solução de lise adicionando 2 ml de solução salina tamponada com fosfato à amostra e subsequente centrifugação durante 5 minutos a 1500 rpm. Após a centrifugação, o sobrenadante é descartado, as células são ressuspensas e 500 μl de solução salina tamponada com fosfato são adicionados para análise posterior.

Para analisar e coletar granulócitos e monócitos em um citômetro de fluxo, os seguintes gráficos são gerados usando o software do dispositivo:

No gráfico CD45(log) vs SS, as áreas de linfócitos CD45+LY (células da área de alta expressão de CD45, baixos valores de SS), monócitos CD45+MON (células da área de expressão média de CD45, maiores valores de SS) e granulócitos CD45+GRAN (células de áreas de baixa expressão de CD45, altos valores de SS).

Para analisar o clone HPN entre granulócitos, um gráfico de CD 15 (log) vs SS é traçado dependendo da porta (CD45+GRAN). Usando a porta CD15+, uma população de granulócitos é isolada sem detritos e células que não ligaram anticorpos monoclonais ao CD15;

Histograma FLAER(log) vs CD24(log) (construído dependendo da porta CD15+. Este gráfico traça a porta PNH GRAN, que captura a zona negativa para a expressão de CD24 e FLAER. A ausência desses marcadores nos granulócitos indica que as células pertencem ao clone HPN.

Para avaliar o clone HPN entre monócitos, um gráfico de -CD64(log) vs SS é traçado dependendo da porta CD45 MON. Neste gráfico, os eventos positivos para C064 estão limitados à porta CD64+MON. Dependendo da porta CD64+MON, um gráfico -FLAER(log) vs CD14(log) é traçado (dependendo da população selecionada de monócitos CD64+ - porta). Este gráfico representa a porta PNH MON, que captura a zona negativa para a expressão CD14 e FLAER. A ausência destes marcadores nos monócitos indica que as células pertencem ao clone HPN.

O valor do clone HPN é a porcentagem de células (granulócitos, monócitos, eritrócitos) entre as quais há ausência de proteínas âncoras ligadas ao GPI.

O estudo do clone da HPN segundo o protocolo internacional é o “padrão ouro” no diagnóstico da HPN. No entanto, a pesquisa é cara e demorada. Demora pelo menos 2,5 a 3 horas para preparar e realizar a análise de acordo com este método.

Por ser a HPN uma doença rara, segundo diversas fontes, afeta de 1 a 10 pessoas por 1 milhão de habitantes, a maioria dos pacientes encaminhados para diagnóstico do clone HPN não será HPN positiva. Portanto, não é aconselhável realizar uma análise trabalhosa e dispendiosa de acordo com o protocolo internacional para pacientes com ausência de HPN, mas basta apenas responder à questão se um clone de HPN está presente ou não. Com o custo dos anticorpos monoclonais marcados a partir de 500 USD. para um item, um conjunto completo de anticorpos e reagentes para diagnóstico de HPN de acordo com a abordagem internacional custará a partir de 5.000 USD. Dado o curto prazo de validade de alguns dos reagentes necessários, mesmo em uma cidade com população de 1 milhão de pessoas, de 10 a 100 pacientes por ano podem ser examinados com um kit, respectivamente, o custo de um estudo pode chegar a 500 USD.

O objetivo da invenção é criar um método preciso, sensível e baseado em evidências para diagnóstico laboratorial de hemoglobinúria paroxística noturna, que seja de fácil implementação, acessível e permita a triagem de hemoglobinúria paroxística noturna com custos mínimos de material.

A essência da invenção é que em um método para diagnóstico laboratorial de hemoglobinúria paroxística noturna, incluindo coloração do sangue total do paciente com anticorpos monoclonais em solução salina tamponada com fosfato, incubação, lavagem de células sanguíneas de anticorpos monoclonais não ligados por centrifugação, ressuspensão da amostra acabada , avaliação posterior do tamanho do clone ou sua ausência no programa do citômetro de fluxo para ausência ou presença de proteínas protetoras, para corar a amostra de sangue em estudo, uma combinação de três cores de anticorpos monoclonais CD235a (FITC)/CD59(PE)/ Utiliza-se CD71 (APC), que são adicionados ao tubo de ensaio com a amostra, a presença do clone HPN entre eritrócitos e reticulócitos é avaliada pela ausência da proteína protetora CD59 na membrana dos reticulócitos isolados pela porta CD235a - um marcador pan-eritrocitário e receptor de transferrina CD71; para avaliar o clone HPN entre reticulócitos na porta CD71+, pelo menos 20.000 eventos são coletados, dependendo da porta CD71+, um gráfico é traçado FSC(log) vs SSC(log), em quais reticulócitos são isolados usando uma porta CD71str adicional, purificando assim a população de reticulócitos de detritos e dupletos usando o método de gating sequencial, os valores indicadores obtidos são comparados com critérios normais, e na presença de 100% de reticulócitos CD59 positivos a ausência do clone HPN é avaliado e a ausência de hemoglobinúria paroxística noturna é diagnosticada. Se forem detectados reticulócitos CD59 negativos em um paciente com sintomas clínicos e o valor dos indicadores obtidos for superior a 1%, é dada uma conclusão diagnóstica sobre a presença de um clone de HPN e para confirmar o diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna, um estudo adicional é recomendado de acordo com o protocolo padronizado internacional, se os reticulócitos CD59 forem negativos e o valor for os indicadores obtidos de 0,1-1% julgar a presença de um clone menor de HPN e recomendar a redeterminação do clone de HPN após 6 meses para um aumento em seu valor e o desenvolvimento de hemoglobinúria paroxística noturna; após a confirmação do tamanho deste clone, é diagnosticada uma forma subclínica de hemoglobinúria paroxística noturna sem sinais clínicos.

A utilização da invenção permite obter o seguinte resultado técnico.

O método proposto para identificação do clone HPN apresenta alta confiabilidade, precisão e sensibilidade - 0,1%, comparável ao método padronizado internacionalmente, e é baseado em evidências.

Permite determinar a presença de clones de HPN tanto de tamanho significativo em pacientes com hemoglobinúria paroxística noturna verdadeira, quanto menores - de 0,01 a 1%, em pacientes com anemia aplástica e síndrome mielodisplásica.

O método é mais simples de implementar e não requer grandes custos de material em comparação com o método padronizado internacional.

A tecnologia de determinação do clone da HPN permite utilizar uma quantidade mínima (três) de anticorpos monoclonais na triagem da HPN (CD235a, CD71, CD59).

Para testar o sangue de um paciente, é utilizado apenas um tubo, o que também simplifica e agiliza a análise.

O tempo necessário para realizar um teste é de 40 a 50 minutos. A utilização de menos anticorpos sem a utilização de soluções de lise torna o ensaio aproximadamente 75% mais barato por ensaio. Ao mesmo tempo, a alta sensibilidade e a precisão do diagnóstico são mantidas.

Na maioria dos casos, o método evita custos adicionais associados à utilização de mais anticorpos, uma vez que, devido à rara ocorrência da doença, o resultado muitas vezes é negativo. A técnica é adequada para triagem de pacientes e está disponível para instituições médicas de diversos perfis, bem como para todas as categorias de cidadãos.

O resultado final da análise no método proposto é apresentado como percentual de eritrócitos e reticulócitos com defeito nas proteínas ligadas ao GPI, ou seja, um clone da HPN. A técnica permite determinar o risco aumentado de trombose com base na porcentagem de clone HPN identificado.

O método proposto é preferível em comparação com alguns outros métodos bem conhecidos - teste de Hem, teste de sacarose, medindo o grau de hemólise em várias concentrações de proteínas do sistema complemento.

O resultado técnico é alcançado devido à nova tecnologia desenvolvida pelos autores para determinação do clone HPN na hemoglobinúria paroxística noturna por citometria de fluxo, cujo algoritmo prevê a determinação desse clone em reticulócitos e eritrócitos (em contraste com a determinação padrão em neutrófilos, monócitos e eritrócitos). Neste caso, os autores utilizam pela primeira vez a combinação de anticorpos CD235a(FITC)/CD59 (PE)/CD71(APC). De acordo com o método proposto, no momento da análise dos dados, um procedimento adicional é utilizado para controle multiparâmetro de células CD71+ e exclusão de detritos, dupletos da análise e eliminação de anticorpos monoclonais ligados de forma inespecífica.

O ponto chave é realizar um estudo de reticulócitos, que, de acordo com a tecnologia desenvolvida pelos autores, são isolados com anticorpos anti-CD71 e examinados com uma combinação de três anticorpos monoclonais CD235a(FITC)/CD59(PE)/CD71(APC ) selecionados pelos autores. O clone HPN entre reticulócitos reflete o verdadeiro valor do clone HPN, os autores compararam os valores obtidos de clones HPN entre reticulócitos com os valores obtidos usando uma abordagem internacional padronizada para o diagnóstico de HPN. A correlação do volume de reticulócitos positivos para HPN com monócitos é de 0,95, com granulócitos - 0,93. A porcentagem de glóbulos vermelhos positivos para HPN de acordo com o método proposto é medida com maior sensibilidade em comparação com a abordagem padronizada internacional, porque Usando o método proposto, pelo menos 1.000.000 de glóbulos vermelhos são examinados e, de acordo com o ICCS, apenas 500.000.

Pela primeira vez, foi realizado um estudo do clone HPN em reticulócitos utilizando uma combinação de anticorpos monoclonais CD235a/CD71/CD59, o que permitiu estimar o tamanho deste clone com sensibilidade de 100%.

Como resultado, tornou-se possível rastrear a HPN utilizando três anticorpos monoclonais. O uso de uma etapa adicional de isolamento de reticulócitos e “corte” de células ligadas inespecificamente a anticorpos monoclonais (no gráfico FS vs SS, Fig.) fornece um resultado preciso, que permite confirmar o diagnóstico de HPN com base na triagem e realizar um tratamento adequado e eficaz.

O método é realizado da seguinte forma.

Para realizar o estudo, o sangue venoso do paciente é colocado em um tubo de ensaio com o anticoagulante K 2 EDTA. O tubo de ensaio é entregue ao laboratório pela sala de tratamento do centro de tratamento e prevenção (HCI).

Para analisar glóbulos vermelhos e reticulócitos, o sangue total é diluído em um tubo de poliestireno separado. Para diluir com solução salina tamponada com fosfato em uma proporção de 1:10, 50 μl de sangue total são adicionados a 450 μl de solução salina tamponada com fosfato e misturados completamente por 5 segundos em um vórtice, em seguida, 40 μl da suspensão celular resultante são adicionados. para um tubo rotulado.

Para corar a amostra, é utilizada uma combinação de três cores de anticorpos monoclonais - CD235a(FITC)/CD59(PE)/CD71(APC). A coloração é realizada adicionando 3 μl de anticorpos monoclonais marcados sequencialmente à amostra, após o que o tubo é agitado durante 5 segundos num vórtice. A seguir, incubar durante 15 minutos no escuro à temperatura ambiente.

Em seguida, as células sanguíneas são lavadas duas vezes em 4 ml de solução salina tamponada com fosfato em modo de centrifugação durante 5 minutos a uma frequência de 1500 rpm. Após cada centrifugação, recolher cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta para que as células permaneçam no fundo do tubo.

A amostra finalizada é ressuspensa por 5 segundos em vórtice e 750 μl de solução salina tamponada com fosfato são adicionados, após o que a amostra está pronta para análise em um citômetro de fluxo.

Em seguida, os resultados são avaliados e registrados por citometria de fluxo multicolor. A análise pode ser realizada em qualquer citômetro de fluxo equipado com detectores para pelo menos três canais fluorescentes.

As medições são realizadas num citómetro de fluxo BD FACSCanto™ II Becton-Dickinson (EUA).

A avaliação da presença ou ausência de um clone HPN em eritrócitos e reticulócitos, bem como o tamanho do clone HPN, é realizada em um citômetro de fluxo por meio de software especial.

Para avaliar o clone da HPN entre eritrócitos e reticulócitos, é construído um gráfico - FSC(log) vs SSC(log), utilizando uma restrição lógica, isola-se a área de eritrócitos, excluindo detritos e dupletos (Fig. 1a).

Uma porta CD235a + é então construída no gráfico FSC (log) vs CD235a (Fig. 1b), limitando assim as células positivas e excluindo eventos que se ligam inespecificamente ao CD235a (resíduos e células não pertencentes à população CD235a +).

Os eventos que entram na porta CD235a + são analisados ​​​​no gráfico CD71 vs FSC (log) (Fig. 1e), que destaca a população positiva para CD71.

Para avaliar objetivamente o clone HPN entre os reticulócitos na porta CD71+, são coletados pelo menos 20.000 eventos.

Dependendo da porta CD71+, um gráfico de FSC(log) vs SSC(log) é traçado (Fig. 1f), no qual os reticulócitos são isolados usando uma porta adicional CD71str e assim a população é finalmente limpa de detritos e dupletos usando o método de portas sequenciais.

A seguir, um gráfico de CD235a vs CD59 é traçado (Fig. 1g) dependendo da porta CD71str (reticulócitos selecionados). Este gráfico distingue duas regiões, Norm ° Ret e PNH ° Ret (Fig. 1g), estes são os limites dos reticulócitos normais e positivos para HPN, respectivamente. As estatísticas são mostradas em valores absolutos e % de gate (Figuras 1d e 1h).

Os protocolos de coleta de dados são estabelecidos uma vez e apenas pequenos ajustes são necessários posteriormente.

A porta CD235a+ é uma porta de parada no primeiro estágio de aquisição de dados, ou seja, ele coleta 1.000.000 de eventos. A porta CD235a + é aplicada ao gráfico CD235a vs CD59 (Fig. 1c). Se nas regiões HPN Tipo II e HPN Tipo III não houver mais de 10 eventos no total no gráfico CD235a vs CD59, a coleta de dados é interrompida e conclui-se que não há clone HPN.

Se o número total de eventos nessas regiões aumentar, o estudo continua.

O clone HPN entre os reticulócitos é a porcentagem de reticulócitos que não possuem a proteína protetora CD59.

Se houver 100% de reticulócitos positivos para CD59, avalia-se a ausência de um clone HPN e diagnostica-se a ausência de hemoglobinúria paroxística noturna.

Se forem detectados reticulócitos CD59 negativos em um paciente com sintomas clínicos e o valor dos indicadores obtidos for superior a 1%, é dada uma conclusão diagnóstica sobre a presença de um clone de HPN e para confirmar o diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna, um estudo adicional é recomendado de acordo com o protocolo padronizado internacional (Michael J. Borowitz, Fiona E. Craig, Joseph A. DiGiuseppe, Andrea J. Illingworth, Wendell Rosse, D. Robert Sutherland, Carl T. Wittwer, Stephen J. Richards. Diretrizes para o diagnóstico e monitoramento da hemoglobinúria paroxística noturna e distúrbios relacionados por citometria de fluxo).

Se não forem detectados reticulócitos CD59 negativos e os valores obtidos forem de 0,1-1%, avalia-se a presença de um clone menor de HPN. Neste caso, recomenda-se redeterminar o clone da HPN após 6 meses para verificar aumento do seu valor e desenvolvimento de hemoglobinúria paroxística noturna.

Ao confirmar o tamanho deste clone por citometria de fluxo, de acordo com o protocolo internacional, diagnostica-se uma forma subclínica de hemoglobinúria paroxística noturna sem sinais clínicos ou avalia-se um clone de HPN concomitante com AA e SMD ao fazer diagnósticos apropriados de acordo com as recomendações (International PNH Interest Grupo (I-PIG)).

O método foi aprovado em testes clínicos no Departamento de Diagnóstico Laboratorial Clínico da Academia Médica Russa de Educação de Pós-Graduação. Foram examinados 572 pacientes encaminhados de diversas unidades de saúde com diagnóstico preliminar ou suspeita de hemoglobinúria paroxística noturna (HPN), anemia aplástica (AA), síndrome mielodisplásica (SPM), anemia hemolítica autoimune (AIHA), com idades entre 12 e 82 anos.

Todos os pacientes foram diagnosticados pelo método proposto por citometria de fluxo multicolorido, bem como pela abordagem padronizada internacional.

Foi determinada a ausência da proteína protetora CD59 na membrana de reticulócitos isolados por CD235a (marcador pan-eritrocitário) e CD71 (receptor de transferrina) e adicionalmente purificados por gating sequencial de acordo com parâmetros de dispersão de luz FS/SS; uma alta correlação do volume foi comprovado o clone de HPN medido entre reticulócitos, de acordo com o método proposto com um clone de HPN entre granulócitos e monócitos, medido de acordo com uma abordagem padronizada internacionalmente.

Foram examinadas 572 pessoas com idade entre 15 e 64 anos, sendo 248 homens e 324 mulheres. Dos 572 examinados, o clone HPN foi detectado em 175 pacientes, valores variaram de 0,1% a 99,7% (mediana 41,6%). Entre eles estão 78 homens e 97 mulheres. Todos os pacientes foram submetidos a estudos paralelos do clone HPN de acordo com a abordagem padronizada internacional e utilizando o método proposto. A correlação entre o valor do clone HPN entre reticulócitos e granulócitos foi de 0,93, entre reticulócitos e monócitos 0,95, respectivamente. A sensibilidade do método foi de 98,9%, especificidade de 99,8% e precisão geral de 99,7%.

Basicamente, na anemia aplástica e na síndrome mielodisplásica, o clone da HPN é inferior a 1%. De acordo com as recomendações, clones deste tamanho devem ser examinados ao longo do tempo em intervalos de 1 vez a cada 6 meses. Com o aumento do tamanho do clone e dos sinais clínicos correspondentes, estamos falando em fazer o diagnóstico de HPN.

Exemplo. O paciente M., 34 anos, estava sob supervisão de um hematologista. Após sofrer de infecção viral respiratória aguda, foram observados aumento de fraqueza, icterícia e urina escura.

O paciente foi internado no setor de uma unidade de saúde com queixas de fraqueza e urina escura.

Um exame de rotina foi realizado no ambulatório da unidade de saúde. Um exame objetivo revelou icterícia da pele e membranas mucosas visíveis. O paciente foi internado no serviço de hematologia com queixas de fraqueza geral, mal-estar, falta de ar, taquicardia, urina escura e diminuição da quantidade de hemoglobina e hemácias.

Um tubo de ensaio com uma amostra de sangue periférico estabilizado com K2EDTA foi enviado ao Departamento de Diagnóstico Laboratorial Clínico da Academia Médica Russa de Educação de Pós-Graduação ao centro de referência para o estudo da HPN para identificação do clone da HPN por citometria de fluxo. A análise do clone HPN entre granulócitos, monócitos e eritrócitos foi feita de acordo com o protocolo internacional, e o estudo do clone HPN foi realizado pelo método proposto em eritrócitos e reticulócitos.

Paralelamente, foi realizado um estudo do clone HPN de acordo com o protocolo internacional e de acordo com a metodologia proposta (repetição da frase anterior!). De acordo com o protocolo internacional, a amostra foi corada para identificar o clone HPN entre granulócitos, monócitos e eritrócitos, e de acordo com o método proposto pelos autores para identificar o clone HPN entre eritrócitos e reticulócitos. De acordo com o método proposto, a amostra foi corada com anticorpos monoclonais para CD235a(FITC)/CD59(PE)/CD71(APC), adicionando-os alternadamente a 40 μl de sangue total diluído 1:10.

Após incubação durante 15 minutos no escuro, as células foram lavadas duas vezes em 4 ml de solução salina tamponada com fosfato por centrifugação durante 5 minutos a 1500 rpm.

Após cada centrifugação, o sobrenadante foi recolhido, deixando as células no fundo do tubo.

A amostra preparada foi ressuspensa em vórtice por 5 segundos e 750 μl de PBS foram adicionados.

Para estudar eritrócitos e reticulócitos, a área de eritrócitos excluindo detritos e dupletos foi destacada no gráfico FSC(log) vs SSC(log).

Em seguida, o gráfico FSC(log) vs CD235a destacou células positivas para CD235a, excluindo detritos e células não pertencentes à população CD235a+ que ligaram de forma inespecífica anticorpos monoclonais a CD235a. Os eventos incluídos na porta CD235a+ foram analisados ​​no gráfico CD71 vs FSC(log), onde a população positiva para CD71 foi identificada.

Para uma avaliação objetiva do clone HPN entre os reticulócitos na porta CD71+, foram coletados pelo menos 20.000 eventos.

Dependendo da porta CD71+, um gráfico de FSC(log) vs SSC(log) foi traçado. Então, neste gráfico, usando uma porta adicional CD71str, foi isolada uma população de reticulócitos, que foi assim limpa de detritos e dupletos usando o método de gating sequencial.

Em seguida, no gráfico CD235a vs CD59, dependendo da porta CD71str (reticulócitos isolados), os reticulócitos foram avaliados quanto à presença da proteína CD59 ligada a GPI nas membranas de reticulócitos, respectivamente, células positivas para HPN e negativas para HPN. Os dados estatísticos foram refletidos em valores absolutos e% do portão.

Quando os reticulócitos foram isolados por CD71 e subsequentemente eliminados os detritos, a população de células CD59 ascendeu a 97,6%. Assim, utilizando o método proposto, foi detectado um clone HPN.

O estudo segundo o protocolo internacional para detecção de HPN confirmou que o clone HPN está presente em granulócitos, monócitos e eritrócitos na quantidade de 99,2%, 97,6% e 71,0%, respectivamente, o que indica a reprodutibilidade dos resultados do proposto e métodos padrão. Este exame serviu de base para o diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna.

Ensaios clínicos demonstraram que o método proposto possui alta confiabilidade, precisão e sensibilidade (0,1% clone HPN), permite determinar a presença tanto de valores elevados de clones em pacientes com hemoglobinúria paroxística noturna, quanto de valores menores (de 0,1 %) em pacientes com anemia aplástica, síndrome mielodisplásica. O método proposto é fácil de implementar, não requer grandes custos de material e um teste leva de 40 a 50 minutos.

A técnica é adequada para triagem de pacientes e está disponível para instituições médicas de diversos perfis, bem como para todas as categorias de cidadãos.

Um método para diagnóstico laboratorial de hemoglobinúria paroxística noturna, incluindo coloração do sangue total do paciente com anticorpos monoclonais em solução salina tamponada com fosfato, incubação, lavagem de células sanguíneas de anticorpos monoclonais não ligados por centrifugação, ressuspensão da amostra finalizada, avaliação subsequente do tamanho do clone ou sua ausência no programa do citômetro de fluxo de acordo com a ausência ou presença de proteínas protetoras, caracterizado por para corar a amostra de sangue em estudo, uma combinação tricolor de anticorpos monoclonais CD235a (FITC)/CD59(PE)/CD71 (APC), que são adicionados ao tubo de ensaio com a amostra, a presença do clone HPN entre eritrócitos e reticulócitos é avaliada com base na ausência da proteína protetora CD59 na membrana dos reticulócitos isolados pela porta CD235a - uma panela -marcador eritrocitário e receptor de transferrina CD71-, para avaliar o clone HPN entre reticulócitos na porta CD71+, são coletados pelo menos 20.000 eventos, dependendo da porta CD71+, é construído um gráfico FSC(log) vs SSC(log), no qual os reticulócitos são isolados usando uma porta adicional CD71str, purificando assim a população de reticulócitos de detritos e dupletos usando o método de gating sequencial, os valores indicadores obtidos são comparados com critérios normais, e na presença de 100% de reticulócitos CD59 positivos, a ausência da HPN é julgado -clonar e diagnosticar a ausência da doença hemoglobinúria paroxística noturna; se forem detectados reticulócitos CD59 negativos em um paciente com sintomas clínicos e o valor dos indicadores obtidos for superior a 1%, é dada uma conclusão diagnóstica sobre a presença do clone HPN e para confirmar o diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna, recomenda-se um estudo adicional de acordo com o protocolo padronizado internacional, se forem detectados reticulócitos CD59 negativos e o valor dos indicadores obtidos for 0,1-1%, a presença de um um clone menor de HPN é julgado e uma redeterminação do clone de HPN é recomendada após 6 meses para um aumento em seu valor e o desenvolvimento de hemoglobinúria paroxística noturna, se este tamanho for confirmado o clone é diagnosticado com uma forma subclínica de hemoglobinúria paroxística noturna sem sinais clínicos.

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A invenção refere-se ao campo da medicina, nomeadamente da imunologia, e pode ser utilizada para avaliar a reação de transformação blástica de linfócitos. Para tanto, a brucelina é utilizada para ativação específica de linfócitos. A detecção de formas blásticas de linfócitos é realizada por meio de anticorpos monoclonais para CD34, seguida de contagem de células por citometria de fluxo. A utilização deste método permite a contagem de linfócitos ativados por brucelina em RBTL utilizando anticorpos monoclonais CD34 em pacientes com brucelose e doadores saudáveis. 1 mesa

A invenção refere-se à medicina, nomeadamente à imunologia, e pode ser utilizada para determinar anticorpos para HLA-G alogénico no soro sanguíneo. Para fazer isso, use um teste de correspondência cruzada entre as células mononucleares do doador e o soro do receptor. As subpopulações de células mononucleares são analisadas utilizando citometria de fluxo para a ligação de anticorpos monoclonais HLA-G e o grau de expressão de HLA-G é avaliado em células mononucleares de dadores experimentais e de controlo. Nesse caso, são significativas as subpopulações CD3-HLA-G+ e CD3+HLA-G+, a partir das quais o coeficiente de supressão (SC) no cenário experimental em relação ao controle é calculado pela fórmula: SR HLA-G = (H L A − G O P − H L A − G K O N T) H L A − G K O N T × 100, onde HLA-Gop é o número relativo total de subpopulações que expressam HLA-G: (CD3-HLA-G++CD3+HLA-G+) no ambiente experimental, % ; HLA-Gcont - o número relativo total de subpopulações que expressam HLA-G: (CD3-HLA-G++CD3+HLA-G+) na configuração de controle, %. Nesse caso, a presença de sensibilização ao HLA-G alogênico é diagnosticada com valor KPHLA-G negativo. A utilização desse método permite detectar a sensibilização alogênica ao HLA-G por citometria de fluxo, determinando as subpopulações CD3-HLA-G+ e CD3+HLA-G+. 3 pr., 3 il., 2 abas.

A invenção refere-se ao campo da medicina, nomeadamente à obstetrícia e à ginecologia, e pode ser utilizada para prever a recorrência de uma ameaça de aborto espontâneo. Para fazer isso, um estudo imunológico do sangue venoso periférico é realizado entre 7 e 12 semanas de gestação em mulheres com ameaça de aborto espontâneo. Após o tratamento para ameaças de aborto espontâneo, é determinado o conteúdo relativo de CD45RA-CD62L- na população de linfócitos CD8+. Quando seu valor é superior a 23,9%, prevê-se a ocorrência de ameaça de aborto espontâneo no segundo trimestre em mulheres com histórico de aborto espontâneo de repetição. A utilização deste método permite prever a recorrência de uma ameaça de aborto espontâneo no segundo trimestre de gestação, o que permitirá escolher as táticas corretas para o manejo da gestante e reduzir a incidência dessa complicação. 1 aba., 4 avenida.

A invenção refere-se à medicina, nomeadamente à transfusiologia, e pode ser utilizada para monitorizar a eficácia da irradiação do sangue do doador. O método inclui o estadiamento da reação de transformação blástica das células sanguíneas com o mitógeno fitohemaglutinina e a consideração dos resultados da reação através da determinação do índice de estimulação de linfócitos. A reação é realizada em relação ao sangue do doador irradiado, os resultados são registrados em citofluorímetro de fluxo utilizando anticorpos monoclonais marcados com diferentes fluorocromos, gating de linfócitos ativados com expressão reduzida do marcador leucocitário comum CD45 e determinação da porcentagem de T duplo-negativo -linfócitos com o imunofenótipo CD3+ entre eles CD4-CD8-, enquanto uma amostra não irradiada do mesmo sangue é retirada como controle. Depois disso, a eficácia da irradiação é determinada pela proporção do conteúdo de linfócitos T duplo-negativos com o imunofenótipo CD3+CD4-CD8- no sangue testado irradiado e no mesmo sangue controle não irradiado como Eob=Sdntlo-Sdntlk, onde Eob é a eficácia da irradiação, Cdntlo é a porcentagem de conteúdo duplicado de linfócitos T negativos com o imunofenótipo CD3+CD4-CD8- no experimento (no sangue irradiado testado), Cdntlk é a porcentagem de T- duplo negativo linfócitos com imunofenótipo CD3+CD4-CD8- no controle (em amostra não irradiada do mesmo sangue). Se a diferença com o controle for superior a 50%, conclui-se sobre a inferioridade funcional dos linfócitos T no sangue irradiado e a segurança imunológica deste hemoderivado para o receptor. A utilização deste método permite determinar a eficácia da irradiação do sangue do doador por meio da citometria de fluxo.

A invenção refere-se à medicina, nomeadamente à obstetrícia e à ginecologia, e permite prever a ameaça de aborto espontâneo tardio em mulheres grávidas. Para fazer isso, às 5-12 semanas de gestação, é determinado o número relativo de monócitos gestacionais CD178+ no sangue venoso periférico. Quando seu valor é igual a 37,7% ou menos na porta monocítica, prevê-se uma ameaça de aborto espontâneo tardio em mulheres com ameaça de aborto precoce e histórico de aborto recorrente. A utilização deste método permite escolher as táticas corretas de manejo da gravidez, realizar um conjunto de medidas terapêuticas e preventivas e reduzir o risco de complicações e resultados adversos da gravidez em um grupo de mulheres com alto risco de aborto espontâneo. 3 avenida, 1 aba.

A invenção refere-se à medicina, nomeadamente à obstetrícia, e diz respeito à escolha de táticas para o manejo de mulheres grávidas com insuficiência placentária e síndrome de restrição de crescimento fetal (FGR). Para tanto, em pacientes com insuficiência fetoplacentária e FGR, a atividade da superóxido dismutase, o conteúdo do fator de crescimento placentário, endoglina e melatonina são determinados no soro sanguíneo pelo método de imunoensaio enzimático. Com base nesses indicadores, o coeficiente prognóstico P é calculado pela fórmula: P = (0,0001*COD+0,0255*Mel+0,1636*CD105+(-0,0487*PGF)-8,5389, onde COD é superóxido dismutase, pg/ ml, Mel - melatonina, pg/ml, CD 105 - endoglin, pg/ml, PGF - fator de crescimento placentário, pg/ml. Com um valor P de 0,64 ou mais, um alto risco de desenvolver uma condição crítica do feto no período pré-natal é previsto, o que requer a conclusão da gravidez por cesariana de emergência no interesse do feto. O método fornece maior precisão na previsão da condição crítica do feto no período pré-natal, o que permite a seleção oportuna de táticas adequadas para o manejo do paciente. 2 ave.

A invenção refere-se à área da medicina, nomeadamente à otorrinolaringologia, e pode ser utilizada para diagnóstico diferencial expresso de amigdalites virais e bacterianas agudas em adultos. Para fazer isso, o sangue periférico é coletado e o conteúdo relativo de subpopulações de granulócitos neutrófilos que expressam simultaneamente CD16 e CD11b na membrana superficial é determinado. A presença de uma subpopulação CD16brightCD11bdimNG% de 80 a 99,9% com alta densidade de expressão de CD16 e baixa densidade de expressão de CD11b é aceita como normal. Se uma subpopulação de CD16brightCD11bbrightNG ou CD16dimCD11bbrightNG for detectada em uma quantidade de 40% ou mais, uma infecção viral aguda ou uma infecção bacteriana aguda será determinada, respectivamente. A utilização deste método permite garantir a precisão do diagnóstico diferencial de amigdalites virais e bacterianas agudas em adultos. 3 avenida, 1 guia.

O grupo de invenções refere-se à medicina, nomeadamente ao diagnóstico laboratorial, e pode ser utilizado para a identificação simultânea de representantes de grupos taxonómicos convencionais de microrganismos patogénicos para humanos e animais. Caracteriza-se pela utilização de pelo menos cinco tiras imunocromatográficas alojadas em um único corpo. Ao mesmo tempo, no primeiro e segundo canais do corpo do dispositivo existem testes de tira para identificação de toxinas, no terceiro canal - um teste de tira para identificação de formas vegetativas de bactérias, no quarto - formas de esporos de bactérias, e no quinto - um teste de tira para identificar um meio nutriente para o cultivo de vírus e riquétsias. O teste é realizado colocando o corpo dos testes de tira imunocromatográfica em um saco Zeflen com isolamento térmico, composto por duas camadas de Zeflen, com uma junta isolante de calor feita de material isolante térmico poroso entre elas, e o corpo dos testes de tira imunocromatográfica o interior da bolsa é aquecido com uma fonte de calor constante, e a abertura da bolsa é fechada com uma pinça mecânica e Considere este momento como o início do teste. Também é proposto um dispositivo para análise imunocromatográfica. O conjunto de invenções permite aumentar a produtividade da análise imunocromatográfica, ampliar a faixa de temperatura da análise imunocromatográfica de menos 20 para mais 50°C, reduzir o tempo de obtenção dos resultados para 10 minutos em relação à análise à temperatura ambiente (20 minutos) , desde que a mesma sensibilidade seja alcançada, e aumente a sensibilidade da análise em comparação com a análise realizada à temperatura ambiente. 2 n. e 7 salário fly, 5 il., 4 mesas, 8 pr.

A invenção refere-se à medicina, nomeadamente ao diagnóstico laboratorial, e pode ser utilizada para o diagnóstico da hemoglobinúria paroxística noturna. Para isso, a amostra de sangue em estudo é corada com anticorpos monoclonais CD235a CD59CD71. A presença de um clone de HPN entre eritrócitos e reticulócitos é avaliada pela ausência da proteína protetora CD59 na membrana dos reticulócitos isolados pela porta CD235a - marcador pan-eritrocitário e CD71 - receptor de transferrina. Para avaliar o clone HPN entre reticulócitos na porta CD71+, são coletados pelo menos 20.000 eventos, dependendo da porta CD71+, é construído um gráfico FSC vs SSC, no qual os reticulócitos são isolados usando a porta adicional CD71str, eliminando assim a população de reticulócitos de detritos e dupletos usando o método de gating sequencial. Se houver 100 reticulócitos positivos para CD59, avalia-se a ausência de um clone HPN e diagnostica-se a ausência de hemoglobinúria paroxística noturna. Se forem detectados reticulócitos CD59 negativos em um paciente com sintomas clínicos e o valor dos indicadores obtidos for superior a 1, é dada uma conclusão diagnóstica sobre a presença de um clone de HPN e para confirmar o diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna, um estudo adicional é recomendado de acordo com o protocolo padronizado internacional. Se forem detectados reticulócitos CD59 negativos e o valor dos indicadores obtidos for 0,1-1, avalia-se a presença de um clone menor de HPN e recomenda-se redeterminar o clone de HPN após 6 meses para verificar se há um aumento em seu valor e o desenvolvimento de hemoglobinúria paroxística noturna, e se o tamanho deste clone for confirmado É diagnosticada uma forma subclínica de hemoglobinúria paroxística noturna sem sinais clínicos. O uso de controle multiparâmetro de células CD71+ torna possível excluir da análise detritos, dupletos e anticorpos monoclonais ligados de forma inespecífica. 1 doente.

Os materiais são apresentados no livro didático RUDN

Anemia. Clínica, diagnóstico e tratamento / Stuklov N.I., Alpidovsky V.K., Ogurtsov P.P. – M.: Agência de Informação Médica LLC, 2013. – 264 p.

Copiar e reproduzir materiais sem indicação dos autores é proibido e punível por lei.

A hemoglobinúria paroxística noturna (HPN) é uma anemia hemolítica clonal adquirida associada a um defeito na membrana das células sanguíneas, portanto a doença é considerada no grupo das membranopatias e é a única membranopatia adquirida entre as doenças desse grupo. A mutação que leva ao defeito da membrana na HPN ocorre ao nível da célula-tronco pluripotente, e a causa da mutação permanece obscura.

A HPN ocorre com frequência de 1:500.000 da população. Pessoas de todas as faixas etárias ficam doentes, mas com mais frequência – entre 30 e 40 anos. Homens e mulheres adoecem com a mesma frequência.

Etiologia e patogênese

Mutação genética pontual PIGA no cromossomo 22 ou no cromossomo X de uma célula-tronco pluripotente (PSC) leva à interrupção da formação de ácido fosfatidilinolínico e proteínas na superfície das células sanguíneas CD 55 e CD 59, formando um sistema nas células normais que bloqueia o efeito prejudicial na membrana do complemento ativado devido à formação de uma cascata CD 5b –9 – um complexo que afeta proteoliticamente a membrana celular.

Assim, a ausência de fatores na superfície das células sanguíneas que interfiram na função do complemento leva à lise de eritrócitos, neutrófilos e plaquetas defeituosos.

Na HPN, existem dois clones no sangue dos pacientes: normal e patológico, e o quadro clínico e a gravidade da doença dependem em grande parte da proporção desses clones.

Clínica

A ação proteolítica do complemento ativado leva à destruição intravascular dos glóbulos vermelhos defeituosos, que se manifesta hemoglobinúria. A ativação do complemento ocorre à noite durante o sono, devido a uma mudança no pH para o lado ácido.

Clinicamente, a hemólise durante o sono se manifesta pela liberação de urina preta durante a diurese matinal, queixas de mal-estar, tontura e aparecimento de amarelecimento da esclera. Além disso, a hemólise pode ser provocada por doenças infecciosas e certos medicamentos.

Além dos sintomas anêmicos associados à hemólise, a HPN desempenha um papel importante na clínica. complicações trombóticas, causada pela liberação de tromboplastina e uma série de enzimas ativas de células destruídas.

Muitas vezes, uma das primeiras queixas do paciente é dor abdominal, simulando diversas patologias abdominais agudas. A dor abdominal está associada à trombose de pequenas artérias mesentéricas.

Tromboflebiteocorre em 12% dos pacientes com HPN e pode ocorrer de diferentes maneiras. Em uma das opções, o estado dos pacientes fora das crises é bastante satisfatório, o conteúdo Hb – cerca de 80 – 90 g/l. Em outros pacientes, ocorrem crises hemolíticas graves, uma após a outra, levando à anemia grave. Muitas vezes são acompanhados de complicações trombóticas.

Dados laboratoriais

Durante uma crise hemolítica, pode ser observada uma diminuição acentuada nos níveis de hemoglobina para 20 g/l ou menos, e uma diminuição paralela no número de glóbulos vermelhos. Durante o período de remissão, o conteúdo Hb e os eritrócitos aumentam, porém, em casos raros, atinge o limite inferior do normal.Ao contrário da maioria das membranopatias, um defeito na membrana eritrocitária na HPN não é acompanhado por alterações características na forma dos eritrócitos patológicos. A anemia, na maioria dos casos, é de natureza normocítica e normocrômica. No entanto, com perda significativa de ferro na urina (como resultado de hemoglobinúria e hemossiderinúria), desenvolve-se hipocromia dos eritrócitos. O conteúdo de reticulócitos está aumentado, mas em muito menor grau do que nas membranopatias congênitas com intensidade semelhante de hemólise. Hemoglobinas anormais e diminuição da atividade enzimática (exceto acetilcolinesterase) não foram detectadas em eritrócitos na HPN. A resistência osmótica dos eritrócitos não é alterada. Quando eritrócitos de pacientes com HPN são incubados em condições estéreis, observa-se auto-hemólise maior que o normal, que, no entanto, não diminui com a adição de glicose.

O número de leucócitos na maioria dos casos é reduzido devido à neutropenia. Às vezes há um desvio para a esquerda no leucograma.

A contagem de plaquetas também costuma ser baixa. As funções plaquetárias não são prejudicadas.

Ao examinar a medula óssea, são detectadas hiperplasia eritróide e sinais de deficiência de hematopoiese da medula óssea na forma de amadurecimento prejudicado de glóbulos vermelhos e elementos granulocíticos, bem como uma diminuição no número de megacariócitos, muitas vezes com ligação prejudicada de plaquetas sanguíneas. Em alguns pacientes com HPN, juntamente com sinais de dishematopoiese, é detectada hipoplasia da medula óssea, característica da anemia aplástica.

Nos casos em que eritrócitos HPN sensíveis ao complemento e sintomas de hemólise intravascular são detectados em pacientes com aplasia hematopoiética previamente estabelecida, é diagnosticada a síndrome HPN, que se desenvolveu no contexto de anemia aplástica.

No entanto, deve-se lembrar dos raros casos de HPN, que terminam em anemia aplástica devido à depleção da hematopoiese da medula óssea por crises hemolíticas graves e outros efeitos adversos (infecções, certos medicamentos, etc.).

Um importante sinal laboratorial de HPN é a hemoglobinúria. O conteúdo de hemoglobina livre no plasma devido à destruição intravascular de eritrócitos na HPN, dependendo da gravidade da hemólise, varia de 11 a 280 mg% (com norma de até 4 mg%).

O conteúdo de bilirrubina geralmente está ligeiramente aumentado, principalmente devido à fração não conjugada. O nível de ferro sérico na HPN depende da fase da doença: durante as crises hemolíticas, devido à liberação de ferro da hemoglobina no plasma, observa-se ferritinemia, e durante um período de silêncio, devido à perda de ferro na urina, hipoferritinemia é observada. A deficiência de ferro na HPN, em contraste com a anemia ferropriva, é acompanhada por uma diminuição simultânea na capacidade total e latente de ligação do ferro, aparentemente devido a uma violação da síntese de transferrina no fígado.

O exame de urina revela hemoglobinúria na maioria dos pacientes com HPN. Com a HPN, a hemoglobina aparece na urina em sua concentração plasmática relativamente baixa, o que está associado a uma diminuição no conteúdo de haptoglobina plasmática. Durante a excreção da hemoglobina pelos rins, parte dela é reabsorvida e depositada no epitélio tubular na forma de hemossiderina, que é então excretada na urina. Curiosamente, a hemossiderinúria na HPN pode ser detectada com mais frequência do que a hemoglobinúria, uma vez que também se desenvolve fora de uma crise hemolítica.

DiagnósticoA doença está associada à identificação de quadro clínico característico, sinais laboratoriais de hemólise intravascular (hemoglobinemia (cor vermelha do soro sanguíneo após centrifugação), diminuição da haptoglobina no sangue, leve bilirrubinemia indireta, aumento de LDH, hemoglobinúria, hemossiderinúria). O diagnóstico da HPN baseia-se na detecção de eritrócitos sensíveis ao complemento característicos desta doença. Para isso são usados Teste de ácido hema e mais sensível teste de sacarose.

Ao realizar o teste de Hem, os glóbulos vermelhos testados são incubados em soro normal acidificado a pH 6,4. Nestas condições, apenas os eritrócitos sensíveis ao complemento são lisados. Deve-se lembrar que com baixo teor de hemácias HPN no sangue do paciente e com baixa atividade do complemento no soro, o teste de Hem pode dar resultados negativos.

Mais sensível é o teste de sacarose, no qual os glóbulos vermelhos testados e uma pequena quantidade de soro normal são colocados em uma solução isotônica de sacarose. Sob condições de voltagem reduzida em um ambiente de sacarose, ocorre uma fixação mais ativa do complemento na superfície dos eritrócitos e a lise dos eritrócitos HPN sensíveis ao complemento.

A evidência da presença de um clone HPN é a detecção na membrana celular de sinais característicos de danos ao gene PIG A. Os métodos modernos de citometria de fluxo permitem determinar a presença de eritrócitos com deficiência total ou parcial de moléculas CD59 em membrana, porém, os eritrócitos patológicos nem sempre podem ser detectados, dada a presença de sua hemólise pronunciada. O mais confiável é o estudo dos granulócitos monócitos, uma vez que as células nucleadas são menos suscetíveis à ação do complemento.

Tratamento

Devido à falta de ideias claras sobre a patogénese da HPN, o tratamento desta doença é atualmente sintomático.

Para combater a anemia, são utilizadas transfusões de sangue de reposição, cuja frequência depende da gravidade da hemólise e da atividade compensatória da medula óssea. Deve-se lembrar que a transfusão de sangue total fresco para pacientes com HPN é frequentemente acompanhada de aumento da hemólise. A razão para esta reação não é clara. Pacientes com HPN toleram melhor transfusões de sangue total ou hemácias com longos períodos de armazenamento (mais de 7 a 8 dias) e transfusões de hemácias lavadas 3 a 5 vezes, liberadas de leucócitos e plaquetas. A utilização de hemácias lavadas é o melhor método transfusional no tratamento da HPN. Quando ocorre uma reação às hemácias lavadas devido ao desenvolvimento de isossensibilização, é necessária a seleção individual do doador de acordo com a reação indireta de Coombs (Fig. 12).

Um lugar importante no tratamento da HPN é ocupado por suplementos de ferro e hormônios androgênicos. A terapia com suplementos de ferro é recomendada para pacientes com HPN quando são detectadas hipocromia eritrocitária e diminuição dos níveis séricos de ferro durante o curso tranquilo da doença. Os suplementos de ferro devem ser usados ​​com cuidado (em pequenas doses e apenas mas ), pois é conhecida sua capacidade de provocar crises hemolíticas graves em alguns pacientes com HPN.

O uso de andrógenos na HPN baseia-se no efeito estimulante desses hormônios na eritropoiese. A administração de Nerabol ou seus análogos na dose de 30–40 mg/dia promove uma recuperação mais rápida dos níveis de hemoglobina após um episódio hemolítico e, assim, reduz significativamente a necessidade de transfusões de sangue. O uso de andrógenos é especialmente eficaz na HPN com hipoplasia hematopoiética.

As táticas de tratamento das complicações trombóticas dependem da localização da trombose, da sua duração e do estado do sistema de coagulação. Nos casos em que esta complicação ameaça a vida do paciente, é necessária a utilização de terapia trombolítica e anticoagulante complexa (fibrinolisina ou uroquinase, ácido nicotínico, heparina e anticoagulantes indiretos) de acordo com as regras terapêuticas gerais e em dosagens suficientes.

Como há relatos de aumento de hemólise após administração de heparina, esse anticoagulante deve ser utilizado com muita cautela.

A esplenectomia para HPN não está indicada, pois o pós-operatório costuma ser complicado por trombose dos vasos mesentéricos. O risco da cirurgia é aceitável apenas na presença de sintomas graves de hiperesplenismo: leucopenia profunda, complicada por infecções frequentes e/ou trombocitopenia, acompanhada de síndrome hemorrágica grave.

Foi desenvolvido um medicamento de moderna tecnologia genética Eculizumab (Soliris, SOLIRIS®), registrado pelo FDA (Food and Drug Administration) para o tratamento de crianças e adultos que sofrem de HPN. Eculizumabe é um anticorpo monoclonal humanizado glicosilado - imunoglobulina kappa (IgG2/4k) que se liga à proteína C5 do complemento humano e inibe a ativação da lise celular mediada pelo complemento. O anticorpo consiste em regiões constantes de imunoglobulina humana e regiões determinadas complementares de imunoglobulina de camundongo incorporadas nas regiões variáveis ​​das cadeias leves e pesadas do anticorpo humano. Eculizumabe contém duas cadeias pesadas de 448 aminoácidos cada e duas cadeias leves de 214 aminoácidos cada. O peso molecular é 147.870 Da. O eculizumabe é produzido em linhagem celular de mieloma murino cultivada NS0 e purificado usando cromatografia de afinidade e troca iônica. O processo de produção da substância também inclui processos de inativação e remoção específica de vírus.

O eculizumabe suprime a atividade terminal do complemento humano, possuindo alta afinidade pelo seu componente C5. Como consequência, a clivagem do componente C5 em C5a e C5b e a formação do complexo terminal do complemento C5b-9 são completamente bloqueadas. Assim, o eculizumabe restaura a regulação da atividade do complemento no sangue e previne a hemólise intravascular em pacientes com HPN. Por outro lado, a deficiência terminal de complemento é acompanhada por um aumento na incidência de infecções por microrganismos encapsulados, principalmente infecção meningocócica. Ao mesmo tempo, o eculizumabe mantém o conteúdo de produtos de ativação precoce do complemento necessários para a opsonização de microrganismos e a remoção de complexos imunes. A prescrição de Soliris aos pacientes é acompanhada por uma diminuição rápida e estável na atividade terminal do complemento. Na maioria dos pacientes com HPN, uma concentração plasmática de eculizumabe de cerca de 35 μg/ml é suficiente para inibir completamente a hemólise intravascular induzida pela ativação terminal do complemento.

Graças aos novos resultados clínicos únicos e à abertura de oportunidades terapêuticas para os médicos preservarem a vida e a saúde plenas dos pacientes, o Eculizumab foi registado de forma acelerada, sem a realização de uma terceira fase de ensaios clínicos - isto irá salvar muitas vidas, tanto crianças como adultos.

Neste sentido, após o registo nos EUA, o Comité Europeu de Medicamentos emitiu um parecer positivo sobre o registo acelerado do Eculizumab na Europa, o que também é esperado num futuro próximo.

Considerando o alto custo do eculizumabe, a impossibilidade de seu uso para influenciar a causa da doença e o fato de que deve ser usado por toda a vida, uma estratégia de reserva é mais aplicável a ele, destinada especificamente a pacientes com elevado número de células HPN ou para pacientes com tendência à formação de trombos, independentemente do tamanho do clone PNG.

Atualmente, o único tratamento radical para a HPN é o transplante alogênico de medula óssea.

Curso e prognóstico

O prognóstico depende da gravidade da doença de base, piorando em pacientes dependentes de transfusões sanguíneas, com trombose grave. Em 10% dos pacientes observam-se remissões espontâneas da doença, em outros ela se transforma em anemia aplástica, SMD, e em 5% - em leucemia aguda. Em média, a esperança de vida é de 10 a 15 anos.

A HPN é uma doença crônica e atualmente completamente incurável. A gravidade da HPN e o prognóstico dependem em grande parte do tamanho da população de eritrócitos sensíveis ao complemento, da capacidade compensatória da medula óssea e da ocorrência de complicações, especialmente trombose venosa. A ideia de um prognóstico grave para HPN mudou recentemente devido à introdução da terapia sintomática ativa.

Tem aumentado o número de pacientes que estão em estado de compensação clínica e hematológica há muito tempo e levam um estilo de vida normal neste momento. A incidência de trombose grave e com risco de vida diminuiu. Em alguns pacientes, ao longo do tempo, ocorre uma atenuação da doença com diminuição da proporção de eritrócitos sensíveis ao complemento. Em casos raros, é descrito o desaparecimento completo dos glóbulos vermelhos patológicos, o que indica a possibilidade fundamental de cura da doença.

A hemoglobinúria paroxística noturna é uma patologia adquirida grave do grupo das anemias hemolíticas. A doença de Marchiafava-Miceli ou doença de Strübing-Marchiafava, outros nomes para esta patologia, provoca a destruição dos glóbulos vermelhos. A doença é muito rara, por 500 mil habitantes pode ocorrer 1 pessoa com esta patologia.

Para não se preocupar com o desenvolvimento de possíveis complicações e consequências da patologia, você deve saber o que representa o diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna, os sintomas e o tratamento da patologia.

Causas da hemoglobinúria

Conforme mencionado acima, a hemoglobinúria paroxística noturna é uma doença muito rara, além disso, a patologia é mais frequentemente encontrada em pessoas com idade entre 20 e 40 anos. Casos de desenvolvimento da doença na velhice ou em crianças também são conhecidos pela prática médica, mas sua participação é insignificante.

A causa da hemoglobinúria paroxística noturna (HPN) é considerada uma reação mutacional do gene das células-tronco (PIG-A), que é um componente do cromossomo X na medula óssea, em resposta à influência de fatores de influência não identificados. Algumas fontes afirmam que as razões que causam a mutação genética são desconhecidas.

Outros argumentam que a hemoglobinúria pode se desenvolver no contexto de doenças infecciosas, pneumonia, lesões, intoxicações, hipotermia e queimaduras, e até mesmo estresse físico grave.

Mas ainda não foi estabelecida uma opinião unânime sobre a etiologia da patologia.

Foi revelada uma ligação clara entre o desenvolvimento do diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna como sintoma de patologias concomitantes. Estudos médicos comprovaram que a HPN se desenvolve como consequência de anemia aplástica e outras patologias do sistema vascular em 30% dos casos.

Um argumento bem conhecido é que mesmo uma célula mutada pode levar ao desenvolvimento de uma forma grave da condição patológica. Durante a formação dos glóbulos vermelhos, que ocorre na medula óssea, as células-tronco se dividem, amadurecem e são liberadas na corrente sanguínea. Um gene modificado é dividido em outro par, e esses em outro par, etc. Ou seja, uma célula se auto-replica, enchendo gradualmente o sangue com glóbulos vermelhos danificados.

A essência do dano aos glóbulos vermelhos é uma membrana proteica incompleta ou ausente, que serve para proteger as células do sistema imunológico. Ao menor defeito na célula, a imunidade do corpo a destrói, resultando em um diagnóstico como hemólise – destruição intravascular dos glóbulos vermelhos, que se caracteriza pela liberação de hemoglobina pura no sangue.

O mesmo processo ocorre na anemia hemolítica crônica, portanto a hemoglobinúria paroxística noturna é seu análogo ou, como os médicos costumam afirmar, sua forma aguda adquirida. A principal e única diferença entre essas patologias é o princípio do seu desenvolvimento.

A anemia hemolítica é uma patologia congênita, a hemoglobinúria é adquirida. A deficiência dos glóbulos vermelhos também pode se estender a outros elementos sólidos do fluido vascular: leucócitos e plaquetas.

Sintomas de hemoglobinúria noturna

Os sintomas da doença de Marchiafava-Micheli dependem da classificação causal da patologia. Como foi constatado, a doença pode ser independente, disso se distingue a forma idiopática da HPN. Devido ao desenvolvimento da patologia no contexto da anemia aplástica, a hemoglobinúria paroxística noturna assume a forma de uma síndrome. A forma mais rara é considerada a forma idiomática da HPN, que ocorre no contexto da hipoplasia hematopoiética.

É impossível identificar sintomas distintos para qualquer forma da doença, pois ela é muito variável. O curso da doença pode ser externamente assintomático, neste caso a patologia só pode ser identificada através do diagnóstico laboratorial. Outros pacientes apresentam síndrome anêmica grave.

De modo geral, é possível definir uma pequena generalização de todas as possíveis manifestações da hemoglobúria noturna, destacando assim o quadro sintomático principal.

• O processo de hemólise (destruição dos glóbulos vermelhos e da hemoglobina) ocorre principalmente à noite (hemoglobinúria noturna), portanto, ao urinar pela manhã, a cor da urina adquire uma tonalidade marrom escura. Durante o dia e à noite este sinal não é observado.
• Devido à diminuição quantitativa dos glóbulos vermelhos, observa-se síndrome anêmica. Suas manifestações estão diretamente relacionadas à falta de oxigênio em órgãos e tecidos. Portanto, o paciente pode sentir dores de cabeça, tontura, manchas pretas diante dos olhos, fraqueza geral, fadiga, crises de angina e taquicardia.

• Se ocorrerem doenças infecciosas concomitantes, sangramento, atividade física, etc., pode ocorrer uma crise hemolítica, que se manifesta por um salto acentuado na quantidade de hemoglobina no fluido vascular, bem como mal-estar intenso, febre, dor óssea, icterícia de a pele e esplenomegalia moderada podem aparecer (baço aumentado).
• A hemoglobinúria é acompanhada por uma violação da concentração de óxido nítrico no plasma, que, tanto no contexto de crises como em casos graves de patologia, causa disfunção erétil nos homens.
• Devido a um defeito nas plaquetas (células sanguíneas responsáveis ​​pela coagulação do sangue), podem ocorrer coágulos sanguíneos, que são mais frequentemente observados nas veias. O mesmo processo pode ser desencadeado por uma substância liberada quando as células sanguíneas sólidas são destruídas. Causa aumento da coagulabilidade do fluido vascular, o que determina a tendência à formação de trombos. Tais violações podem levar à morte.

Os sintomas mais distintos da hemoglobinúria paroxística noturna podem ser obtidos através do diagnóstico laboratorial. Os estudos mostrarão o nível de hemoglobina no sangue, o estado das células, a presença de trombopenia e leucopenia, o nível de ferro e outros oligoelementos, etc. Um diagnóstico completo e preciso da hemoglobinúria leva muito tempo, pois este a doença pode ser cuidadosamente escondida sob o disfarce de outras patologias.

Portanto, a maneira mais racional de detectar oportunamente a doença de Marchiafava-Miceli é o exame preventivo regular.

Tratamento da hemoglobinúria paroxística noturna

O período de detecção da hemoglobinúria paroxística noturna determina os métodos de tratamento necessários e estabelece o prognóstico do desfecho da patologia, que na maioria dos casos é desfavorável. Isso ocorre pela falta de uma causa específica de desenvolvimento e pela impossibilidade de eliminá-la. Portanto, não existe um método de tratamento específico para HPN.

Todas as medidas terapêuticas visam eliminar as manifestações sintomáticas. A única maneira eficaz de se livrar completamente das células mutadas é transplantar a medula óssea vermelha (o local onde as células sanguíneas são formadas).

Com o desenvolvimento de uma crise hemolítica, forma aguda de hemólise, são prescritas ao paciente múltiplas transfusões de hemácias. Pode haver 5 ou mais dessas transfusões. O número de procedimentos e sua frequência são determinados por testes repetidos e realizados durante a próxima multiplicação de glóbulos vermelhos defeituosos.

Em casos raros, o baço é removido. Os sinais que levam à esplenectomia incluem um aumento acentuado do órgão e o desenvolvimento de um infarto.

As restantes medidas terapêuticas consistem na toma de diversos tipos de medicamentos que aliviam o curso da patologia. Os principais medicamentos são preparações de hormônios esteróides, citostáticos, além de preparações de ferro e ácido fólico.

Nerobol

O medicamento mais prescrito pelos médicos para combater as manifestações sintomáticas da hemoglobinúria paroxística noturna é o medicamento Nerobol. Este é um medicamento hormonal do grupo dos esteróides anabolizantes. A ação da droga é direcionada:

• estimular a síntese de proteínas no corpo do paciente, que faltam na membrana defeituosa dos glóbulos vermelhos;
• tem um efeito benéfico no metabolismo do nitrogênio;
• retarda a excreção de potássio, enxofre e fósforo, necessários para a síntese normal de proteínas;
• provoca aumento da fixação de cálcio nos ossos.

Depois de tomar este medicamento, o paciente experimenta um aumento do apetite, um aumento intensivo da massa muscular, uma calcificação óssea acelerada e um estado geral do corpo muito melhor.

O uso do medicamento começa com 10 g, aumentando gradativamente até 30 g em 1 a 2 doses ao dia. Para crianças, a dose do medicamento é de 1 comprimido em dias alternados, nas formas graves diariamente. O curso da terapia com Nerobol é de 2 a 3 meses.

Após interromper o uso do medicamento, muitos pacientes apresentam aumento da hemólise.

O uso do Nerobol pode ser realizado estritamente conforme prescrição do médico assistente.

Heparina

A heparina é um anticoagulante direto - um meio de inibir a coagulação sanguínea. Na hemoglobinúria paroxística noturna, é prescrito para prevenir coágulos sanguíneos, que complicam o curso da doença.

A dosagem e a frequência de administração são totalmente individualizadas, dependendo da complexidade da patologia e do risco de coágulos sanguíneos nos vasos.

Ao final do tratamento com heparina, o médico prescreve anticoagulantes indiretos para manter um nível normal de coagulação.

Eculizumabe é um medicamento que consiste em anticorpos monocanais humanizados. O princípio de ação da droga é interromper a hemólise intravascular e neutralizar diretamente o complemento sanguíneo. Como resultado, a destruição natural dos glóbulos vermelhos defeituosos pelo sistema imunológico do corpo é interrompida.

Este medicamento é o medicamento mais caro do mundo. Seu mecanismo de ação e o desenvolvimento das possíveis consequências do uso não foram suficientemente estudados.

Suplementos de ferro e ácido fólico

Se houver distúrbios no funcionamento da medula óssea vermelha, ocorre deficiência de ferro e ácido fólico, necessários para a hematopoiese normal. A terapia terapêutica para HPN inclui a tomada de preparações desses microelementos para compensar perdas patológicas.

A dosagem e a forma de tomar o medicamento são determinadas pelo médico assistente. Os mais prescritos são Sorbifer, Tardiferron, Ferretab, Fenyuls, etc. Esses medicamentos contêm um complexo de microelementos necessários para a criação normal de partículas sólidas de sangue na medula óssea vermelha.

Suporte ao Fígado

A terapia intensificada na luta contra a hemoglobinúria paroxística noturna tem um forte efeito no fígado. Na ausência de terapia de suporte para o fígado, ele pode simplesmente falhar. Portanto, é importante tomar medicamentos hepatoprotetores. Estes podem ser os seguintes medicamentos:

• Maxar;
• Heptral;
• Karsil.

Além disso, existem vários produtos que ajudam a restaurar as células do fígado. Estes incluem abóbora, damascos secos, algas, azeite, laticínios e muito mais. O principal é, em momentos de fraqueza hepática, não agravar com junk food.

Depois de identificar a doença, os médicos fazem previsões imprecisas. As estatísticas dizem que após o diagnóstico, o paciente pode viver com terapia de manutenção por cerca de 5 anos.

Devido à origem desconhecida da doença e à incerteza sobre as causas do seu desenvolvimento, a hemoglobinúria paroxística noturna não pode ser evitada.

conclusões

A doença de Marchiafava-Miceli ou hemoglobinúria paroxística noturna é uma doença grave que, mesmo com cuidados intensivos, é fatal. A única recuperação possível é o transplante de medula óssea vermelha, onde se formam as células sanguíneas. Além disso, a patologia acarreta o desenvolvimento de doenças concomitantes, não menos perigosas para o estado do paciente.

Portanto, os médicos declaram por unanimidade que o melhor método para prevenir qualquer patologia é submeter-se regularmente a um exame médico completo. É possível que se a doença estiver apenas em fase de formação, ela possa ser removida permanentemente. Com doenças tão graves, a questão principal é o tempo. Você deve cuidar de você e do seu corpo.

RCHR (Centro Republicano para o Desenvolvimento da Saúde do Ministério da Saúde da República do Cazaquistão)
Versão: Protocolos clínicos do Ministério da Saúde da República do Cazaquistão - 2015

Hemoglobinúria paroxística noturna [marchiafava-micheli] (D59.5)

Oncohematologia

informações gerais

Pequena descrição

Recomendado
Conselho de profissional
RSE no RVC "Centro Republicano"
desenvolvimento da saúde"
Ministério da Saúde
e desenvolvimento social
República do Cazaquistão
datado de 9 de julho de 2015
Protocolo nº 6

Classificação

Classificação clínica:

Existem 3 formas principais de HPN.
1. Forma clássica caracterizada por sinais clínicos e laboratoriais de hemólise intravascular sem sinais de outras doenças associadas à insuficiência da medula óssea (anemia aplástica (AA), síndrome mielodisplásica (SMD), mielofibrose idiopática).
2. HPN diagnosticada em pacientes com AA (AA/PNG), MDS (MDS/PNG) e extremamente raramente com mielofibrose (mielofibrose idiopática/HPN), quando nessas doenças há sinais clínicos e/ou laboratoriais de hemólise intravascular, sendo determinado um clone de células com fenótipo HPN no sangue periférico.
3. Forma subclínica doenças ( AA/sPNH, MDS/sPNH, mielofibrose idiopática/sPNH), diagnosticado em pacientes sem sinais clínicos e laboratoriais de hemólise, mas na presença de um clone menor de células com fenótipo HPN (geralmente<1 %). Следует отметить, что субклиническое течение ПНГ может отмечаться и при большем размере клона.

O isolamento da forma subclínica da HPN não tem significado clínico independente, mas é necessário para garantir o monitoramento desses pacientes devido à probabilidade de aumento do tamanho do clone e progressão da hemólise, que pode dominar entre as manifestações clínicas e requer tratamento adequado terapia.
Tendo em conta que a forma subclínica da HPN na AA e/ou SMD não tem significado clínico independente.

Formato PNG clássico.
Pacientes com HPN clássica geralmente apresentam hemólise intravascular grave com aumento dos níveis séricos de lactato desidrogenase (LDH), reticulocitose e diminuição dos níveis de haptoglobina. Com esta variante da HPN não existem sinais morfológicos definitivos de outras patologias da medula óssea (AA, SMD, mielofibrose) e as anomalias do cariótipo não são características

HPN no contexto de síndromes de insuficiência da medula óssea (AA/PNH, MDS/PNH).
Em pacientes com AA/PNH e SMD/PNH, são diagnosticados sinais clínicos e laboratoriais de hemólise intravascular. Em diferentes estágios do desenvolvimento da doença, podem prevalecer sintomas de insuficiência medular óssea ou hemólise intravascular e, em alguns casos, há uma combinação de ambos. Apesar de em pacientes com clone pequeno de HPN a doença geralmente ocorrer com sintomas mínimos e apenas serem observados sinais laboratoriais de hemólise intravascular, é necessário monitoramento (duas vezes ao ano). Isso se deve ao fato de que, com o tempo, é possível a expansão do clone com desenvolvimento de hemólise grave e alto risco de complicações trombóticas.

Forma subclínica de HPN (AA/sPNH, MDS/sPNH).
Pacientes com HPN subclínica não apresentam sinais clínicos ou laboratoriais de hemólise. Pequenas populações de células deficientes em GPIAP só podem ser detectadas utilizando citometria de fluxo altamente sensível. A forma subclínica da HPN pode ser diagnosticada no contexto de doenças caracterizadas por comprometimento da função da medula óssea, principalmente AA e SMD.É muito importante monitorar cuidadosamente esses pacientes para identificar sinais de hemólise e expansão clonal, pois 15-17% dos pacientes com AA/PNH subclínica têm Com o tempo, a forma hemolítica de AA/PNH se desenvolve.

Diagnóstico

Lista de medidas diagnósticas básicas e adicionais:
Exames diagnósticos básicos (obrigatórios) realizados em regime ambulatorial:
· exame de sangue geral (contagem de reticulócitos em esfregaço);
· imunofenotipagem de sangue periférico para determinação da porcentagem de eritrócitos HPN dos tipos I, II e III por citometria de fluxo;
· exame bioquímico de sangue (bilirrubina total, bilirrubina direta, LDH);
· Teste de Coombs;
· mielograma.

Exames diagnósticos adicionais realizados em regime ambulatorial:



· determinação da concentração de ácido fólico e vitamina B12;
· coagulograma;
exame citogenético padrão da medula óssea;
· análise geral de urina
· ELISA para marcadores de hepatites virais;
· ELISA para marcadores de HIV;
· ELISA para marcadores de vírus do grupo herpes;
· HLA – digitação;
· ECG;
· Ultrassonografia dos órgãos abdominais (fígado, baço, pâncreas, vesícula biliar, gânglios linfáticos, rins, nas mulheres - pelve;

A lista mínima de exames que devem ser realizados no encaminhamento para internação planejada:
· exame de sangue geral (contagem de leucemia, plaquetas e reticulócitos em esfregaço);
· mielograma;
· tipo sanguíneo e fator Rh
· exame bioquímico de sangue (proteína total, albumina, bilirrubina total, bilirrubina direta, creatinina, ureia, ALaT, ASaT, GGTP, glicose, LDH, proteína C reativa, fosfatase alcalina);
· Teste de Coombs;
· Ultrassonografia dos órgãos abdominais e baço;
· Ultrassonografia dos órgãos pélvicos - para mulheres.

Exames diagnósticos básicos (obrigatórios) realizados em nível hospitalar:

Exame de sangue geral (contagem de leucemia, plaquetas e reticulócitos em esfregaço);
- imunofenotipagem de sangue periférico para determinação da porcentagem de eritrócitos HPN dos tipos I, II e III por citometria de fluxo;
- exame bioquímico de sangue (bilirrubina total, bilirrubina direta, LDH);
- Teste de Coombs
- mielograma.
- exame citogenético padrão da medula óssea;
- ELISA para marcadores de hepatites virais;
- ELISA para marcadores de HIV;
- ELISA para marcadores de vírus do grupo herpes;
· Radiografia dos órgãos torácicos.
Exames diagnósticos complementares realizados em nível hospitalar:
· determinação do nível de haptoglobina.
· tipo sanguíneo e fator Rh;
· exame bioquímico de sangue (proteína total, albumina, bilirrubina total, bilirrubina direta, creatinina, ureia, ALaT, ACaT, glicose, LDH, GGTP, proteína C reativa, fosfatase alcalina);
· metabolismo do ferro (determinação do nível de ferro sérico, capacidade total de ligação do ferro sérico e nível de ferritina);
· Determinação da concentração de ácido fólico e vitamina B12;
· coagulograma;
· HLA – digitação;
· análise geral de urina;
· determinação do nível de hemossiderina na urina;
· Teste de Reberg-Tareev (determinação da taxa de filtração glomerular);
· ECG;
· Ultrassonografia dos órgãos abdominais (fígado, baço, pâncreas, vesícula biliar, gânglios linfáticos, rins, nas mulheres - pelve;
Radiografia dos órgãos torácicos;
· Ultrassonografia Doppler de artérias e veias;
· ecocardiografia;
· FGDS (dilatação das veias do esôfago);
monitoramento diário da pressão arterial;
· Monitoramento de ECG 24 horas.

Medidas diagnósticas realizadas na fase de atendimento médico de emergência:
· coleta de queixas e histórico médico;
· exame físico.

Critérios diagnósticos para diagnóstico:

Reclamações e anamnese:
- fraqueza;
- fadiga rápida;


- aumento do sangramento.

Anamnese: você deve prestar atenção a:
- fraqueza a longo prazo;
- fadiga rápida;
- doenças infecciosas frequentes;
- ataques agudos de dor na região lombar;
- escurecimento da urina, principalmente à noite e pela manhã;
- Síndrome de Budd-Chiari (trombose da veia hepática);
- trombose de várias localizações;
- aumento do sangramento;
- aparecimento de erupções cutâneas hemorrágicas na pele e nas mucosas;
- registro em dispensário para AA ou MDS.

Exame físico[ 8 ]:
- uma combinação de palidez e amarelecimento da pele;
- erupções cutâneas hemorrágicas - petéquias, equimoses de várias localizações;
- falta de ar;
- taquicardia;
- aumento do fígado;
- baço aumentado.

Pesquisa laboratorial:
Se houver suspeita de HPN, a citometria de fluxo permite fazer um diagnóstico preciso. A citometria de fluxo é o método mais sensível e informativo.
· Análise geral de sangue: A contagem de reticulócitos geralmente está elevada e os esfregaços de sangue periférico mostram glóbulos vermelhos morfologicamente não diferentes do normal. Devido à hemólise, os normoblastos estão frequentemente presentes no sangue e é observada policromatofilia. Como resultado de perdas significativas de ferro na urina, os pacientes com HPN têm grande probabilidade de desenvolver deficiência de ferro, e então os glóbulos vermelhos adquirem a aparência característica da IDA - hipocrômica com tendência à microcitose. muitas vezes é reduzido. Também pode ser observada pancitopenia de gravidade variável. No entanto, ao contrário da anemia aplástica, a reticulocitose geralmente ocorre juntamente com a citopenia.
· Química do sangue: A quantidade de bilirrubina, hemoglobina livre e metemoglobina no soro sanguíneo aumenta. Existem sinais de hemólise intravascular, ou seja, diminuição ou ausência de haptoglobina, aumento de LDH, aumento do nível de hemoglobina livre e ferro na urina. Níveis baixos de haptoglobina são consistentemente observados na hemólise intravascular, mas também ocorrem em casos de hemólise extravascular, especialmente hemólise crônica. Como a haptoglobina também é um reagente de fase aguda, sua diminuição ou ausência acentuada é mais informativa.
· Na urina: Hematúria e proteinúria podem ser detectadas. Sinais constantes de importância diagnóstica são a hemossiderinúria e a detecção de detritos sanguíneos na urina.
· Estudo morfológico: A hiperplasia eritróide é detectada na medula óssea. A hipoplasia da medula óssea e um conteúdo reduzido de siderócitos e sideroblastos são frequentemente detectados.
· Imunofenotipagem: Um sinal precoce e confiável do fenótipo HPN é a expressão de proteínas relacionadas ao GPI: a expressão de CD14 e CD48 é determinada em monócitos, CD16 e CD66b - em granulócitos, CD48 e CD52 - em linfócitos, CD55 e CD59 - em eritrócitos, CD55, CD58.

Estudos instrumentais:
· Ultrassonografia dos órgãos abdominais: aumento no tamanho do fígado e baço.
· Ultrassonografia Doppler de artérias e veias: a presença de trombose de artérias e veias
· ECG: Condução prejudicada de impulsos no músculo cardíaco.
· EcoCG: sinais de insuficiência cardíaca (IC)<60%), снижение сократимости, диастолическая дисфункция, легочная гипертензия, пороки и регургитации клапанов.
· TC/RMN de corpo inteiro: detecção de trombose (cerebral, portal, etc.)
· Tomografia computadorizada do segmento torácico: alterações infiltrativas no tecido pulmonar, sinais de hipertensão pulmonar.
· FGDS: varizes do esôfago.
· Espirografia: Teste de função pulmonar.

Indicações para consulta com especialistas:
· médico para diagnóstico e tratamento endovascular radiográfico - instalação de cateter venoso central a partir de acesso periférico (PICC);
· hepatologista - para diagnóstico e tratamento de hepatites virais;
· ginecologista - gravidez, metrorragia, menorragia, consulta na prescrição de anticoncepcionais orais combinados;
· dermatovenerologista - síndrome cutânea nº.
· infectologista - suspeita de infecções virais;
· cardiologista - hipertensão não controlada, insuficiência cardíaca crônica, distúrbios do ritmo cardíaco e de condução;
· neurologista acidente vascular cerebral agudo, meningite, encefalite, neuroleucemia;
· neurocirurgião - acidente vascular cerebral agudo, síndrome de luxação;
· nefrologista (eferentologista) - insuficiência renal;
· oncologista – suspeita de tumores sólidos;
otorrinolaringologista - para diagnóstico e tratamento de doenças inflamatórias dos seios paranasais e ouvido médio;
· oftalmologista - deficiência visual, doenças inflamatórias dos olhos e anexos;
· proctologista - fissura anal, paraproctite;
· psiquiatra - psicose;
· psicólogo – depressão, anorexia, etc.;
· reanimador - tratamento de sepse grave, choque séptico, síndrome de lesão pulmonar aguda com síndrome de diferenciação e condições terminais, instalação de cateteres venosos centrais.
· reumatologista - síndrome de Sweet;
· cirurgião torácico - pleurisia exsudativa, pneumotórax, zigomicose pulmonar;
· transfusiologista - para seleção do meio de transfusão em caso de teste indireto de antiglobulina positivo, transfusões ineficazes, perda sanguínea maciça aguda;
· urologista - doenças infecciosas e inflamatórias do aparelho urinário;
· tisiatra - suspeita de tuberculose;
· cirurgião - complicações cirúrgicas (infecciosas, hemorrágicas);
· cirurgião maxilofacial - doenças infecciosas e inflamatórias do aparelho dentofacial.

Diagnóstico diferencial

Diagnóstico diferencial.
O diagnóstico diferencial é feito com outros tipos de anemia hemolítica e com a variante citopênica da HPN - com anemia aplástica.

Anemia por deficiência de B-12. Muitas vezes há necessidade de diagnóstico diferencial de HPN, que ocorre com pancitopenia e hemólise, e anemia por deficiência de vitamina B12 com síndrome hemolítica. Em ambas as doenças, a hemólise é bastante pronunciada. As diferenças entre essas doenças são apresentadas na tabela:

Mesa. Diferenças diagnósticas diferenciais entre anemia por deficiência de B12 e HPN.

Tratamento

Objetivos do tratamento:
Alcançar e manter a remissão (ver parágrafo 15 - Indicadores de eficácia do tratamento).

Táticas de tratamento:
Tratamento não medicamentoso:
Modo II: segurança geral.
Dieta: Pacientes neutropênicos não são recomendados a seguir uma dieta específica ( nível de evidência B).

Tratamento medicamentoso.
O algoritmo geral para tratamento de pacientes com HPN, dependendo da forma da doença e da gravidade da hemólise, é apresentado na figura.

Algoritmo de tratamento para pacientes com HPN.


Terapia com eclizumabe.
Eculizumabe é um anticorpo monoclonal humanizado que se liga ao componente C5 do complemento. Isto evita a clivagem de C5 em C5a e C5b, inibindo assim a formação de citocinas pró-inflamatórias (via C5a) e MAC (via C5b).
Atualmente, um ensaio multicêntrico, randomizado, duplo-cego e controlado por placebo, TRIUMPH, avaliou a eficácia do eculizumabe na estabilização dos níveis de hemoglobina e na redução da dependência de transfusão em 87 pacientes dependentes de transfusão com HPN ao longo de 6 meses de terapia.
O estudo incluiu pacientes com mais de 18 anos de idade que foram submetidos a pelo menos 4 transfusões de meios contendo eritrócitos durante o último ano, com um clone de HPN eritrocitário tipo III de pelo menos 10%, um nível de plaquetas de pelo menos 100 mil/μl, e um aumento no LDH de ³1,5 normal. Todos os pacientes receberam uma vacina anti-meningocócica antes de iniciar a terapia.
O principal resultado do estudo foi a estabilização dos níveis de hemoglobina em 49% dos pacientes que receberam eculizumabe (p.<0,001) и снижение необходимости в трансфузиях в этой группе до нуля (в группе плацебо за 6 месяцев потребовалось от 6 до 16 трансфузий), а также улучшение качества жизни.
Os resultados deste estudo forneceram a base para a aprovação do eculizumab pela FDA para HPN dependente de transfusão com hemólise.
Um estudo de R. Hillman et al. e estudos prospectivos subsequentes apresentam certas limitações que dificultam a extrapolação de seus resultados para todos os pacientes com HPN, descritas detalhadamente no relatório da FDA e na revisão Cochrane de Arturo J Martí-Carvajal:
· A eficácia foi estudada apenas em doentes com mais de 18 anos de idade;
· Os dados sobre pacientes idosos também são limitados (apenas 15 pacientes no estudo tinham mais de 65 anos);
· O estudo incluiu apenas pacientes dependentes de transfusão com hemólise;
· O pequeno número de pacientes com episódios trombóticos e a alta frequência de prescrição de profilaxia anticoagulante não nos permitem avaliar o efeito do eculizumabe no risco de complicações trombóticas e desaconselhamos o uso de anticoagulantes em pacientes que recebem eculizumabe. A redução relativa na frequência de episódios trombóticos durante a profilaxia anticoagulante e a terapia com eculizumabe é de 81%;
· O questionário de qualidade de vida utilizado não foi validado para pacientes com HPN e a melhoria da qualidade de vida só poderia estar associada ao aumento dos níveis de hemoglobina;
· Curto período de observação;
· O estudo foi patrocinado pelo fabricante do medicamento;
· Não existem dados sobre o efeito do eculizumab em comparação com o placebo na sobrevivência global, no risco de transformação para LMA e SMD. Um aumento na sobrevida global foi demonstrado em apenas um estudo com controle histórico (período de 1997 a 2004). Em 2013, foram publicados dados de três estudos prospectivos com 195 pacientes com HPN e hemólise que mostraram uma taxa de sobrevivência de 97,6% aos 36 meses, mas não foi feita comparação com um grupo placebo.
· Os dados sobre a utilização de eculizumab em mulheres grávidas são limitados. A gravidez aumenta a incidência de complicações graves da HPN com risco de vida. Existe uma grande probabilidade de o eculizumabe atravessar a barreira hematoplacentária e o leite materno. Devido à raridade da doença, atualmente não existem estudos controlados sobre a eficácia do eculizumab em mulheres grávidas. São descritos dois casos de prescrição de eculizumabe a gestantes de 4 e 5 semanas de gestação com subsequentes gestações sem complicações e nascimento de crianças saudáveis.
· Mesmo com tratamento prolongado, com duração de cerca de 30 meses, cerca de 18% dos pacientes permanecem dependentes de transfusões. Uma possível explicação para esse fenômeno é a participação do fragmento C3 do complemento nos processos de hemólise intravascular, que não é inibida pelo eculizumabe.

O eculizumabe pode ser recomendado para inclusão no programa de tratamento para as seguintes categorias de pacientes com HPN clássica acima de 18 anos de idade:
Dependência de transfusão devido a hemólise crônica ( nível de evidência A);
presença de complicações trombóticas ( nível de evidênciaD);
gravidez em pacientes com HPN ( nível de evidênciaD).

Ao determinar as indicações para a terapêutica com eculizumab, os níveis de LDH por si só não devem ser tidos em consideração.

Modo de administração e dosagem de eculizumabe
O medicamento é administrado por via intravenosa, por gotejamento, durante 25-45 minutos - para adultos.
O curso do tratamento inclui um ciclo inicial de 4 semanas seguido por um ciclo de manutenção. O ciclo inicial é de 600 mg do medicamento uma vez por semana durante 4 semanas. Terapia de manutenção - 900 mg na 5ª semana, seguido de 900 mg do medicamento a cada (14±2) dias.

Hemólise "inovadora".
O regime terapêutico padrão com eculizumabe é suficiente para o bloqueio completo e estável da hemólise mediada pelo complemento. Em alguns pacientes, devido
peculiaridades do metabolismo dos medicamentos ou durante infecções, pode ocorrer hemólise “inovadora”. Nesta situação, os sinais de hemólise aparecem dentro de 2-3 dias
antes da próxima administração de eculizumab. Os pacientes podem desenvolver hemoglobinúria, retorno dos sintomas originais (falta de ar, fraqueza, espasmo da musculatura lisa, etc.), necessidade de transfusões, aumento do nível de LDH, reticulócitos e diminuição do nível de haptoglobina. O tratamento da hemólise disruptiva envolve a redução do intervalo entre as administrações de eculizumab para 12 dias ou o aumento da dose para 1200 mg para 1-2 administrações.

Prevenção e tratamento da infecção menincocócica.
Durante o tratamento com eculizumabe, é necessário monitorar o aparecimento de sintomas de infecção e prescrever prontamente antibióticos para infecções bacterianas. Se for diagnosticada infecção meningocócica, a próxima administração do medicamento é cancelada.
O mecanismo de ação do medicamento eculizumabe sugere um risco aumentado de desenvolvimento de infecção meningocócica ( Neisseria meningitidis) no contexto da sua utilização (nível de evidência B).
Todos os pacientes devem ser vacinados contra meningococo 2 semanas antes do início do medicamento, bem como revacinação entre 2,5-3 anos de terapia. A vacina conjugada tetravalente mais preferida é contra os serotipos A, C, Y e W135. Se for necessário tratamento urgente com eculizumab num doente não vacinado, a terapêutica pode ser iniciada no contexto de profilaxia antibiótica apropriada, que deve continuar durante 2 semanas após a vacinação contra a infecção meningocócica.

Terapia sintomática.
No tratamento com eculizumabe, a terapia sintomática inclui a administração de ácido fólico (5 mg/dia), vitamina B12 (para deficiência), suplementos de ferro (para deficiência), anticoagulantes (varfarina, heparina de baixo peso molecular) para complicações trombóticas, transfusões de sangue produtos dependendo dos sintomas clínicos, hidratação durante o desenvolvimento de uma crise hemolítica. Suplementos de ferro devem ser prescritos com cautela devido à possibilidade de aumento da hemólise.

Terapia anticoagulante.
Após um evento trombótico, pode ser recomendada terapia de longo prazo (para toda a vida) com anticoagulantes (derivados cumarínicos ou heparinas). A terapia para a síndrome de Budd-Chiari exige que o paciente esteja em um departamento cirúrgico especializado para trombólise local e sistêmica. A terapia anticoagulante para prevenção primária de trombose pode ser indicada em casos selecionados quando um clone de HPN é detectado em ≥ 50% dos granulócitos e na presença de riscos adicionais de complicações trombóticas, com exceção de pacientes com aplasia de medula óssea.

Apoio transfusional.
Indicações para transfusão de hemocomponentes:

Suspensão/massa de eritrócitos.
· em relação à suspensão/massa eritrocitária é necessária a seleção por tipo sanguíneo e fator Rh;
· para pacientes com histórico de múltiplas transfusões, é aconselhável selecionar os seguintes antígenos: Kell, Duffy, Kidd, MNSs;
· imediatamente antes da transfusão de suspensão/massa eritrocitária é necessário realizar teste de compatibilidade com soros padrão;
· valores limite em que se considera a necessidade de transfusão de suspensão/massa de hemácias: Hb<80 г/мл, Ht <25%;
· o cálculo do volume máximo de suspensão/massa eritrocitária é determinado pela seguinte fórmula: Hb (g/dL) x4 x peso do receptor (kg).

Concentrado de plaquetas.
· O concentrado de plaquetas deve ser selecionado de acordo com tipo sanguíneo e fator Rh;
· transfusão de concentrado de plaquetas para prevenção de sangramento, realizada no nível de Tr<10 тыс кл/мкл;
· pacientes com febre febril, sangramento de mucosas são recomendados a serem submetidos a transfusão de concentrado de plaquetas no nível de Tr<20 тыс кл/мкл;
· ao planejar uma intervenção invasiva para um paciente, recomenda-se realizar uma transfusão de concentrado de plaquetas no nível Tr<50 тыс кл/мкл;
· dose terapêutica de plaquetas recomendada para adultos: 3 x 10 11 células/l num volume de 200-300 ml.

Avaliando a eficácia da transfusão:
parar o sangramento;
Determinação do nível de plaquetas no dia seguinte - nível de Tr persistente<20 тыс кл/мкл свидетельствует о рефрактерности к трансфузиям;
· se todas as causas de trombocitopenia forem excluídas, é necessário testar a presença de anticorpos antileucócitos;
· Se forem detectados anticorpos, a transfusão de plaquetas deve ser realizada de um doador compatível com HLA.

Plasma fresco congelado.
Como o FFP contém complemento, suas transfusões podem provocar o desenvolvimento de hemólise em pacientes com HPN. É aconselhável evitar transfusões de PFC na HPN.

Tratamento medicamentoso prestado em regime ambulatorial:
− lista de medicamentos essenciais com indicação da forma de liberação (com 100% de probabilidade de uso):

Medicamentos antineoplásicos e imunossupressores
. eculizumab*300 mg, concentrado para solução para perfusão, 10 mg/ml.

· filgrastim, solução injetável 0,3 mg/ml, 1 ml;
· ondansetrona, solução injetável 8 mg/4ml.

Agentes antibacterianos
Azitromicina, comprimido/cápsula, 500 mg;
· amoxicilina/ácido clavulânico, comprimido revestido por película, 1000 mg;
· moxifloxacina, comprimido, 400 mg;
Ofloxacina, comprimido, 400 mg;
· comprimido de ciprofloxacina, 500 mg;
· metronidazol, comprimido, 250 mg, gel dental 20g;
· eritromicina, comprimido 250 mg.

· anidulafungina, pó liofilizado para solução injetável, 100 mg/frasco;



· clotrimazol, solução para uso externo 1% 15ml;

Fluconazol, cápsula/comprimido 150 mg.

· aciclovir, comprimido, 400 mg, gel em bisnaga 100.000 unidades 50 g;


Fanciclovir, comprimidos, 500 mg.

Soluções usadas para corrigir distúrbios no equilíbrio hídrico, eletrolítico e ácido-base

· dextrose, solução para perfusão 5% 250ml;
· cloreto de sódio, solução para perfusão 0,9% 500ml.

· heparina, solução injetável 5000 UI/ml, 5 ml; (para lavar o cateter)

· rivaroxabana, comprimido;
ácido tranexâmico, cápsula/comprimido 250 mg;

· ambroxol, solução para administração oral e inalação, 15 mg/2 ml, 100 ml;

· atenolol, comprimido 25 mg;



· drotaverina, comprimido 40 mg;


Levofloxacina, comprimido, 500 mg;

Lisinopril, comprimido de 5 mg;
· metilprednisolona, ​​comprimido, 16 mg;

· omeprazol, cápsula 20 mg;

Prednisolona, ​​comprimido, 5 mg;
· esmectita dioctaédrica, pó para preparação de suspensão para administração oral 3,0 g;

· torasemida, comprimido 10 mg;
· fentanil, sistema transdérmico terapêutico 75 mcg/h; (para o tratamento da dor crônica em pacientes com câncer)

Tratamento medicamentoso prestado em nível de internação:
− lista de medicamentos essenciais com indicação da forma de liberação (com 100% de probabilidade de uso):

· eculizumab*300 mg, concentrado para solução para perfusão, 10 mg/ml.

− lista de medicamentos adicionais indicando a forma de liberação (menos de 100% de probabilidade de uso):

Medicamentos que enfraquecem o efeito tóxico dos medicamentos anticâncer
. filgrastim, solução injetável 0,3 mg/ml, 1 ml;
. ondansetrona, solução injetável 8 mg/4ml.

Agentes antibacterianos
· azitromicina, comprimido/cápsula, 500 mg, pó liofilizado para preparo de solução para infusão intravenosa, 500 mg;
· amicacina, pó para injeção, 500 mg/2 ml ou pó para solução injetável, 0,5 g;
· amoxicilina/ácido clavulânico, comprimido revestido por película, 1000 mg, pó para solução para administração intravenosa e intramuscular 1000 mg+500 mg;
· vancomicina, pó/liofilizado para solução para perfusão 1000 mg;
· gentamicina, solução injetável 80 mg/2 ml 2 ml;
· imipinem, cilastatina pó para solução para perfusão, 500 mg/500 mg;
· colistimetato de sódio*, liofilizado para preparação de solução para perfusão, 1 milhão de unidades/frasco;
· comprimido de metronidazol, 250 mg, solução para perfusão 0,5% 100 ml, gel dental 20 g;
Levofloxacina, solução para perfusão 500 mg/100 ml, comprimido 500 mg;
linezolida, solução para perfusão 2 mg/ml;
· meropenem, liofilizado/pó para solução injetável 1,0 g;
· moxifloxacina, comprimido 400 mg, solução para perfusão 400 mg/250 ml
· ofloxacina, comprimido 400 mg, solução para perfusão 200 mg/100 ml;
· piperacilina, tazobactam pó para solução injetável 4,5 g;
tigeciclina*, pó liofilizado para solução injetável 50 mg/frasco;
Ticarcilina/ácido clavulânico, pó liofilizado para preparação de solução para perfusão 3000 mg/200 mg;
cefepima, pó para solução injetável 500 mg, 1000 mg;
· cefoperazona, sulbactam pó para solução injetável 2 g;
· ciprofloxacina, solução para perfusão 200 mg/100 ml, 100 ml, comprimido de 500 mg;
· eritromicina, comprimido 250 mg;
Liofilizado de ertapenem, para preparação de solução para injeções intravenosas e intramusculares 1 g.

Medicamentos antifúngicos
· anfotericina B*, pó liofilizado para solução injetável, 50 mg/frasco;
· anidulofungina, pó liofilizado para solução injetável, 100 mg/frasco;
voriconazol, pó para solução para perfusão 200 mg/frasco;
voriconazol, comprimido, 50 mg;
· itraconazol, solução oral 10 mg/ml 150,0;
· caspofungina, liofilizado para preparação de solução para perfusão 50 mg;
· clotrimazol, creme para uso externo 1% 30g, solução para uso externo 1% 15ml;
· micafungina, pó liofilizado para preparação de solução injetável 50 mg, 100 mg;
· fluconazol, cápsula/comprimido 150 mg, solução para perfusão 200 mg/100 ml, 100 ml.

Medicamentos antivirais
· aciclovir, creme para uso externo, 5% - 5,0, comprimido - 400 mg, pó para solução para perfusão, 250 mg;
· valaciclovir, comprimido, 500 mg;
· valganciclovir, comprimido, 450 mg;
· ganciclovir*, liofilizado para solução para perfusão 500 mg;
Famciclovir, comprimidos, 500 mg nº 14.

Medicamentos usados ​​para pneumocistose
· sulfametoxazol/trimetoprim, concentrado para solução para perfusão (80mg+16mg)/ml, 5 ml;
· sulfametoxazol/trimetoprim, comprimido 480 mg.

Medicamentos imunossupressores adicionais:
· dexametasona, solução injetável 4 mg/ml 1 ml;
· metilprednisolona, ​​comprimido 16 mg, solução injetável 250 mg;
· prednisolona, ​​solução injetável 30 mg/ml 1 ml, comprimido 5 mg.

Soluções utilizadas para corrigir distúrbios do equilíbrio hídrico, eletrolítico e ácido-base, nutrição parenteral
· albumina, solução para perfusão 10%, 100 ml;
· albumina, solução para perfusão 20% 100 ml;
· água para preparações injetáveis, solução injetável 5 ml;
· dextrose, solução para perfusão 5% - 250 m, 5% - 500 ml; 40% - 10ml, 40% - 20ml;
· cloreto de potássio, solução para administração intravenosa 40 mg/ml, 10 ml;
· gluconato de cálcio, solução injetável 10%, 5 ml;
· cloreto de cálcio, solução injetável 10% 5ml;
· sulfato de magnésio, solução injetável 25% 5 ml;
· manitol, solução injetável 15% -200,0;
· cloreto de sódio, solução para perfusão 0,9% 500ml;
· cloreto de sódio, solução para perfusão 0,9% 250ml;
· cloreto de sódio, cloreto de potássio, solução de acetato de sódio para perfusão em frasco de 200 ml, 400 ml;
· cloreto de sódio, cloreto de potássio, solução de acetato de sódio para perfusão 200ml, 400ml;
· cloreto de sódio, cloreto de potássio, solução de bicarbonato de sódio para perfusão 400ml;
L-alanina, L-arginina, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, cloridrato de L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano , L-tirosina, L-valina, acetato de sódio tri-hidratado, glicerofosfato de sódio penti-hidratado, cloreto de potássio, cloreto de magnésio hexa-hidratado, glicose, cloreto de cálcio di-hidratado, mistura de emulsão de óleos de oliva e soja para inf.: recipientes de três câmaras 2 l
· hidroxietilamido (pentamido), solução para perfusão 6% 500 ml;
· complexo de aminoácidos, emulsão para infusão contendo mistura de óleos de oliva e soja na proporção de 80:20, solução de aminoácidos com eletrólitos, solução de dextrose, com teor calórico total de 1.800 kcal Recipiente de três seções de 1.500 ml .

Medicamentos utilizados em terapia intensiva (medicamentos cardiotônicos para tratamento de choque séptico, relaxantes musculares, vasopressores e anestésicos):
· aminofilina, solução injetável 2,4%, 5 ml;
· amiodarona, solução injetável, 150 mg/3 ml;
· atenolol, comprimido 25 mg;
· besilato de atracúrio, solução injetável, 25 mg/2,5 ml;
· atropina, solução injetável, 1 mg/ml;
· diazepam, solução para uso intramuscular e intravenoso 5 mg/ml 2 ml;
· dobutamina*, solução injetável 250 mg/50,0 ml;
· dopamina, solução/concentrado para preparação de solução injetável 4%, 5 ml;
· insulina simples;
· cetamina, solução injetável 500 mg/10 ml;
· morfina, solução injetável 1% 1 ml;
· norepinefrina*, solução injetável 20 mg/ml 4,0;
· brometo de pipecurônio, pó liofilizado para injeção 4 mg;
· propofol, emulsão para administração intravenosa 10 mg/ml 20 ml, 10 mg/ml 50 ml;
· brometo de rocurônio, solução para administração intravenosa 10 mg/ml, 5 ml;
· tiopental sódico, pó para preparação de solução para administração intravenosa 500 mg;
· fenilefrina, solução injetável 1% 1ml;
· fenobarbital, comprimido 100 mg;
imunoglobulina humana normal, solução para perfusão;
· epinefrina, solução injetável 0,18% 1 ml.

Medicamentos que afetam o sistema de coagulação sanguínea
· ácido aminocapróico, solução 5% -100 ml;
· complexo coagulante anti-inibitório, pó liofilizado para preparo de solução injetável, 500 UI;
· heparina, solução injetável 5.000 UI/ml, 5 ml, gel em bisnaga 100.000 UI 50g;
· esponja hemostática, tamanho 7*5*1, 8*3;
· nadroparina, solução injetável em seringas pré-cheias, 2.850 UI anti-Xa/0,3 ml, 5.700 UI anti-Xa/0,6 ml;
· enoxaparina, solução injetável em seringas 4.000 UI anti-Xa/0,4 ml, 8.000 UI anti-Xa/0,8 ml.

Outros medicamentos
· bupivacaína, solução injetável 5 mg/ml, 4 ml;
· lidocaína, solução injetável, 2%, 2 ml;
· procaína, solução injetável 0,5%, 10 ml;
· solução normal de imunoglobulina humana para administração intravenosa 50 mg/ml - 50 ml;
· omeprazol, cápsula 20 mg, pó liofilizado para preparação de solução injetável 40 mg;
· famotidina, pó liofilizado para preparação de solução injetável 20 mg;
Ambroxol, solução injetável, 15 mg/2 ml, solução para administração oral e inalação, 15 mg/2 ml, 100 ml;
· amlodipina, comprimido/cápsula 5 mg;
· acetilcisteína, pó para solução para administração oral, 3 g;
· dexametasona, colírio 0,1% 8 ml;
Difenidramina, solução injetável 1% 1 ml;
· drotaverina, solução injetável 2%, 2 ml;
· captopril, comprimido 50 mg;
· cetoprofeno, solução injetável 100 mg/2ml;
lactulose, xarope 667 g/l, 500 ml;
· cloranfenicol, sulfadimetoxina, metiluracil, pomada de trimecaína para uso externo 40g;
Lisinopril, comprimido de 5 mg;
· metiluracila, pomada para uso tópico em bisnaga 10% 25g;
· nafazolina, gotas nasais 0,1% 10ml;
· nicergolina, liofilizado para preparação de solução injetável 4 mg;
· iodopovidona, solução para uso externo 1 l;
· salbutamol, solução para nebulizador 5 mg/ml-20 ml;
· esmectitedioctaédrica, pó para preparação de suspensão para administração oral 3,0 g;
· espironolactona, cápsula 100 mg;
· tobramicina, colírio 0,3% 5ml;
· torasemida, comprimido 10 mg;
· tramadol, solução injetável 100 mg/2ml;
tramadol, solução oral (gotas) 100 mg/1 ml 10 ml;
· fentanil, sistema terapêutico transdérmico 75 mcg/h (para tratamento de dor crônica em pacientes oncológicos);
· ácido fólico, comprimido, 5 mg;
· furosemida, solução injetável 1% 2 ml;
· cloranfenicol, sulfadimetoxina, metiluracil, pomada de trimecaína para uso externo 40g;
· clorexidina, solução 0,05% 100ml;
· cloropiramina, solução injetável 20 mg/ml 1 ml.

Tratamento medicamentoso prestado na fase de emergência: não é realizado.

Outros tipos de tratamento:
Outros tipos de tratamento prestados em regime ambulatorial: não se aplica.

Outros tipos de serviços prestados a nível estacionário:

Transplante de medula óssea (nível de evidência B)
As indicações para TMO na HPN são semelhantes às da anemia aplástica grave.
Embora o eculizumabe ajude a controlar a hemólise intravascular e as complicações associadas à HPN, principalmente a dependência de transfusão, o transplante alogênico de medula óssea (TMO) continua sendo o único método radical para alcançar a cura desta doença. No entanto, o TMO está associado a alta mortalidade. Assim, em um estudo retrospectivo em 26 pacientes com HPN da Itália que receberam TMO, a taxa de sobrevida em 10 anos foi de 42%, e a probabilidade de sobrevida em 2 anos em 48 pacientes que receberam TMO de um irmão HLA idêntico, de acordo com o Registro Internacional de Transplante de Medula Óssea, totalizou 56%. Independentemente das indicações para a realização do TMO, a incidência de complicações permanece muito elevada. A incidência de doença do enxerto contra hospedeiro em pacientes com HPN é de 42-54%, metade dos pacientes desenvolve doença hepática veno-oclusiva, não enxerto ou rejeição e, além disso, permanece o risco de expansão do clone HPN. O TMO e as complicações associadas afetam negativamente a qualidade de vida dos pacientes.

Outros tipos de tratamento prestados durante atendimento médico de emergência: não se aplica.

Características do manejo de pacientes grávidas.
A gravidez na HPN está associada a elevados níveis de mortalidade materna e infantil (11,6% e 7,2%, respectivamente).
Atualmente, foram descritos apenas casos isolados de terapia com eculizumabe durante a gravidez com desfecho favorável para a mãe e o feto. Não há efeitos teratogênicos da droga. Durante a gravidez, a terapêutica com eculizumab não deve ser descontinuada. Caso a paciente não tenha recebido eculizumabe anteriormente, o medicamento pode ser prescrito durante a gravidez. Neste caso, a terapêutica com eculizumab deve ser continuada durante 3 meses após o parto. Em casos de hemólise disruptiva durante a gravidez, pode ser necessário um ajuste de dose do medicamento (por exemplo, terapia de manutenção 900 mg por semana).

Intervenção cirúrgica:
Intervenção cirúrgica realizada em regime ambulatorial: não é realizado.

Intervenção cirúrgica realizada em ambiente hospitalar:
Com o desenvolvimento de complicações infecciosas e sangramentos com risco de vida, os pacientes são submetidos a intervenções cirúrgicas por motivos de emergência.

Gestão adicional:
Durante a terapia com eculizumabe são recomendados os seguintes exames laboratoriais: hemograma completo com determinação de reticulócitos, LDH, creatinina sanguínea, peptídeo natriurético B cerebral (se possível), dímero D, ferro sérico, ferritina, teste direto de antiglobulina. O tamanho do clone HPN é monitorado com base nos resultados da citometria de fluxo altamente sensível.
Em pacientes que recebem eculizumabe, observa-se um aumento estatisticamente significativo no tamanho do clone HPN. No estudo TRIUMPH, o clone de eritrócitos HPN tipo III aumentou de 28,1% para 56,9% ao longo de 26 semanas, embora não tenha mudado no grupo placebo. Se o eculizumabe for descontinuado, é necessário monitorar o tamanho do clone HPN, o nível de reticulócitos, haptoglobina, LDH, bilirrubina e dímeros D para detecção oportuna de hemólise e prevenção de possíveis complicações.

Indicadores de eficácia do tratamento:
Ainda não foi desenvolvido um sistema específico para avaliar a resposta à terapia na HPN. Ao avaliar o efeito do tratamento, são levados em consideração:
· manifestações clínicas - fraqueza;
· nível de hemoglobina;
· a necessidade de transfusões de hemocomponentes;
episódios trombóticos;
· atividade de hemólise (nível de reticulócitos, LDH, haptoglobina).

Medicamentos (princípios ativos) utilizados no tratamento

Grupos de medicamentos de acordo com ATC utilizados no tratamento

Hospitalização

Indicações para internação:
Indicações para internação de emergência:
· HPN recém-diagnosticada;
· complicações trombóticas;
· crise hemolítica;
neutropenia febril.

Indicações para internação planejada:
· exame, determinação de novas táticas de tratamento;
transplante alogênico de medula óssea.

Prevenção

Ações preventivas: Não.

Informação

Fontes e literatura

1. Atas de reuniões do Conselho de Especialistas da RCHR do Ministério da Saúde da República do Cazaquistão, 2015
   1. Referências: 1. Rede Escocesa de Diretrizes Intercolegiais (SIGN). SIGN 50: um manual para desenvolvedores de diretrizes. Edimburgo: SINAL; 2014. (publicação SIGN nº 50). . Disponível em URL: http://www.sign.ac.uk 2. Kulagin A.D., Lisukov I.A., Ptushkin V.V., Shilova E.R., Tsvetaeva N.V., Mikhailova E.A. Diretrizes clínicas nacionais para o diagnóstico e tratamento da hemoglobinúria paroxística noturna, Oncohematology 2/2014 p.20-28 3. Parker C., Omine M., Richards S. et al. Diagnóstico e tratamento da hemoglobinúria paroxística noturna. Sangue 2005; 106:3699–709. 4. de Latour RP, Mary JY, Salanoubat C. et al. Hemoglobinúria paroxística noturna: história natural das subcategorias da doença. Sangue 2008; 112:3099–106. 5. Brodsky R. A. Como trato a hemoglobinúria paroxística noturna. Sangue 2009; 113:6522–7. 6. Movalia M. K., Weitz I., Lim S. H., Illingworth A. Incidência de clones de HPN por código de diagnóstico utilizando citometria de fluxo de alta sensibilidade. 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Informação

Lista de desenvolvedores de protocolo com detalhes de qualificação:

1) Kemaykin Vadim Matveevich - Candidato em Ciências Médicas, JSC "Centro Científico Nacional de Oncologia e Transplantologia", Chefe do Departamento de Oncohematologia e Transplante de Medula Óssea.
2) Anton Anatolyevich Klodzinsky - Candidato em Ciências Médicas, JSC Centro Científico Nacional de Oncologia e Transplantologia, hematologista do Departamento de Oncohematologia e Transplante de Medula Óssea.
3) Ramazanova Raigul Mukhambetovna - Doutor em Ciências Médicas, Professor do JSC "Universidade Médica de Educação Continuada do Cazaquistão", chefe do curso de hematologia.
4) Gabbasova Saule Telembaevna - RSE do RSE "Instituto de Pesquisa Cazaque de Oncologia e Radiologia", chefe do departamento de hemoblastose.
5) Karakulov Roman Karakulovich - Doutor em Ciências Médicas, Professor, Acadêmico do MAI RSE do Instituto de Pesquisa de Oncologia e Radiologia do Cazaquistão, pesquisador-chefe do departamento de hemoblastose.
6) Tabarov Adlet Berikbolovich - Chefe do Departamento de Gestão Inovadora do RSE do RSE "Hospital da Administração do Centro Médico do Presidente da República do Cazaquistão", farmacologista clínico, pediatra.
7) Rapilbekova Gulmira Kurbanovna, Doutor em Ciências Médicas. JSC “Centro Científico Nacional de Maternidade e Infância” - chefe do departamento obstétrico nº 1.

Divulgação de não conflito de interesses: ausente.

Revisores:
1) Afanasyev Boris Vladimirovich - Doutor em Ciências Médicas, Diretor do Instituto de Pesquisa em Oncologia, Hematologia e Transplantologia Infantil em homenagem a R.M. Gorbacheva, Chefe do Departamento de Hematologia, Transfusiologia e Transplantologia, Instituição Orçamentária do Estado de Educação Profissional Superior, Primeira Universidade Médica do Estado de São Petersburgo. I.P. Pavlova.
2) Rakhimbakova Gulnar Ayapbekkyzy - Doutor em Ciências Médicas, Professor, JSC National Scientific Medical Center, Chefe de Departamento.
3) Pivovarova Irina Alekseevna - Médica Médica, Mestre em Administração de Empresas, Hematologista freelance-chefe do Ministério da Saúde e Desenvolvimento Social da República do Cazaquistão.

Indicação das condições para revisão do protocolo: revisão do protocolo após 3 anos e/ou quando novos métodos de diagnóstico e/ou tratamento com maior nível de evidência estiverem disponíveis.

Arquivos anexados

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