Microbiologia da reação em cadeia da polimerase. PCR: o que é? Diagnóstico de doenças infecciosas através da reação em cadeia da polimerase. "Diaem": amplificadores de DNA para todos os gostos

S.V. Pospelova, M.V. Kuznetsova

Reação em cadeia da polimerase

S.V. Pospelov– Ph.D. mel. Ciências, Professor Associado do Departamento de Microbiologia, Virologia e Imunologia, M. V. Kuznetsova– Ph.D. biol. Ciências, funcionário do IEGM Ural Branch da Academia Russa de Ciências

Pospelova, S.V.

Projetado para o trabalho independente de alunos de todas as faculdades: médica, pediátrica, médica e preventiva, odontológica e da Faculdade de Ensino Superior em Enfermagem (FVSO) da Academia Médica.

Revisor:

cabeça Departamento de Biologia, Ecologia e Genética Médica PGMA, Professor A. B. Vinogradov

Impresso por decisão da coordenação central
Conselho Metodológico da Instituição Estadual de Ensino de Educação Profissional Superior PGMA
eles. ok. E.A. Wagner Roszdrav

UDC 616-078.33

Reação em cadeia da polimerase na clínica
diagnóstico microbiológico

A medicina moderna utiliza com sucesso as conquistas das ciências naturais e aplica intensamente novas tecnologias para o diagnóstico e tratamento de doenças. Recentemente, novos métodos baseados no uso de tecnologias genéticas moleculares foram adicionados aos tradicionais métodos microbiológicos e imunológicos para diagnóstico laboratorial de doenças infecciosas. A utilização destes métodos não só para fins científicos, mas também em diagnósticos laboratoriais práticos tornou-se possível, em grande medida, graças à criação, em meados dos anos 80, do processo de cópia artificial múltipla de ADN e ao rápido desenvolvimento desta tecnologia, atualmente conhecido como reação em cadeia da polimerase(PCR). Em menos de 15 anos de existência, a PCR realizou análises de rotina de sequências específicas de DNA de muitos microrganismos patogênicos. Sua versatilidade, alta sensibilidade e relativa facilidade de execução tornaram o método PCR indispensável para a resolução de diversos problemas de diagnóstico clínico, como detecção e identificação direta de patógenos, tipagem molecular e estudo das propriedades de microrganismos patogênicos, análise de mutações associadas a doenças genéticas. em humanos e identificação da personalidade humana.

O que é PCR?

Reação em cadeia da polimerase(PCR) - um processo artificial de cópia repetida (amplificação) sequência específica de DNA, realizada em vitro(Figura 1). A cópia do DNA durante a PCR é realizada por uma enzima especial - DNA polimerase como nas células dos organismos vivos. A DNA polimerase, movendo-se ao longo de uma única fita de DNA (modelo), sintetiza uma sequência de DNA complementar a ela. É importante que a DNA polimerase não possa começar a sintetizar uma fita de DNA “do zero”; ela precisa de uma pequena fita “semente” de RNA ou DNA à qual possa começar a anexar nucleotídeos. O princípio básico da PCR é que a reação de polimerização (síntese de uma cadeia polimérica de DNA a partir de unidades nucleotídicas monoméricas) é iniciada por reações específicas. primers(pequenos fragmentos de DNA “semente”) em cada um dos muitos ciclos repetidos. A especificidade da PCR é determinada pela capacidade dos primers de “reconhecer” uma seção estritamente definida de DNA e se ligar a ela de acordo com o princípio molecular complementaridade.

Uma reação típica de PCR utiliza um par de primers que “limitam” a região a ser amplificada em ambos os lados, ligando-se a fitas opostas do modelo de DNA. Para multiplicar o número de cópias do DNA original, é necessária uma reação cíclica. Como regra, cada um dos ciclos de PCR repetidos sequencialmente consiste em três etapas:

1)desnaturação, ou “derretimento” do DNA de fita dupla: antes do início da reação, o DNA alvo é de fita dupla; a uma temperatura de 94-95 0 C, as fitas complementares de DNA divergem e se transformam em um estado de fita simples;

2) vinculação (anelamento) primers: a uma temperatura ideal para os primers selecionados, eles se ligam à região complementar do DNA molde;

3)alongamento, ou alongamento de cadeia: a DNA polimerase adiciona nucleotídeos aos primers, sintetizando novas fitas de DNA que se tornam alvos para primers em ciclos de PCR subsequentes.

A alteração dos estágios de cada ciclo é realizada alterando a temperatura da mistura reacional (ver Fig. 1).

Arroz. 1. Principais etapas do ciclo PCR

No início, os primers só podem se ligar a uma sequência específica do DNA original, mas nos ciclos subsequentes eles se ligam a cópias dessa sequência sintetizadas em ciclos anteriores. Nesse caso, a quantidade do produto principal da PCR (uma cópia da sequência de DNA limitada pelos primers) teoricamente dobra a cada ciclo. Se no ciclo inicial havia apenas um alvo de DNA no material em estudo, após o primeiro ciclo já haverá duas cópias, após dois ciclos – 4 cópias, o resultado do terceiro ciclo será de 8 cópias, e as trinta e quinto – já 68 bilhões de cópias (Fig. 2).

Arroz. 2. Processo de cópia múltipla
DNA alvo durante sequencial
mudando ciclos

O principal método de análise de produtos de reação, tradicionalmente utilizado em muitos laboratórios para detectar DNA amplificado e determinar seu tamanho, é o método eletroforese em gel seguido de coloração com um corante específico de DNA, como o brometo de etídio (Fig. 3).

Controle - vários fragmentos de DNA com um número conhecido de nucleotídeos constituintes. Sabe-se que a distância entre os diferentes fragmentos tem uma dependência logarítmica do seu tamanho e massa. Linha 1 – Foram detectados fragmentos de PCR com aproximadamente 1850 bases de comprimento. As linhas 2 e 4 são fragmentos com cerca de 800 bases de comprimento.

Arroz. 3. Análise de produtos de reação por método
eletroforese em gel

Linha 3 – os fragmentos necessários não foram identificados, o resultado da reação é negativo. Linha 5 - múltiplas linhas foram formadas porque os primers eram complementares a vários fragmentos de DNA de diferentes comprimentos: cerca de 550, 800 e 1500 bases.

Melhoria da tecnologia PCR

Inicialmente, foram utilizadas DNA polimerases convencionais para a realização da PCR, que foram submetidas à inativação térmica em cada ciclo na fase de desnaturação do DNA. A polimerase teve que ser adicionada muitas vezes à mistura de reação, o que era bastante trabalhoso e não permitia a automatização do processo.

A reação usa termoestável DNA polimerases que podem suportar altas temperaturas em todos os estágios do ciclo de PCR por várias dezenas de ciclos. O número de DNA polimerases termoestáveis comercialmente disponíveis, diferindo em algumas de suas propriedades, é bastante grande. Mais comumente usado Polimerase Taq originalmente isolado de um microrganismo termofílico Termus aquático. Outras polimerases são mais comumente usadas para aplicações específicas de PCR. As preparações comerciais modernas de polimerases termoestáveis, via de regra, proporcionam atividade estável e reprodutível, o que permite o uso da tecnologia PCR na prática laboratorial padrão.

O projeto técnico de alteração da temperatura da mistura de reação também se desenvolveu rapidamente recentemente. Inicialmente, a PCR foi realizada em três banhos-maria regulados em diferentes temperaturas: para desnaturação do DNA, recozimento de primers e polimerização. Os tubos de ensaio foram transferidos de um banho-maria para outro “em círculo”, devido ao qual a temperatura mudou nas diferentes etapas do ciclo. Havia também variantes de dispositivos onde água de diferentes temperaturas era fornecida alternadamente a um banho-maria no qual estavam localizados tubos de ensaio com uma mistura de reação. A mudança de ciclos nesses casos demorava muito e o processo era difícil de automatizar. Para realizar PCR, são utilizados principalmente dispositivos (termocicladores), que alteram a temperatura automaticamente com base em um determinado programa. Nos termocicladores, os tubos com a mistura reacional são colocados em um bloco metálico, cuja temperatura muda em alta velocidade, o que reduz a duração de cada ciclo de PCR.

Os termocicladores modernos são adaptados para usar tubos plásticos especiais de paredes finas para a mistura de reação, o que acelera a troca de calor entre o bloco do dispositivo e a mistura de reação e, em última análise, reduz ainda mais o tempo de reação.

Assim, a PCR padrão pode ser realizada em 1-3 horas. Muitos dispositivos permitem a programação de perfis de temperatura especiais e sofisticados, necessários para modificações específicas do processo de PCR.

Paralelamente ao aprimoramento da tecnologia PCR, também foram desenvolvidos métodos de análise de produtos de reação. Método eletroforese em gel seguido de coloração com um corante específico de DNA, como o brometo de etídio, é tradicionalmente usado em muitos laboratórios para detectar DNA amplificado e determinar seu tamanho. Uso hibridização com sondas de DNA internas permite, em alguns casos, aumentar significativamente a sensibilidade e especificidade de detecção de produtos de PCR. Ao eliminar a necessidade de preparar e realizar separações eletroforéticas, a capacidade de automatizar a análise de um grande número de amostras e o uso de um formato de detecção não radioativo, este método está se tornando cada vez mais comum. Em alguns casos, o uso de “marcadores” fluorescentes especiais permite controlar a amplificação ou detecção de produtos finais de PCR diretamente no tubo de reação.

Uso de PCR
em microbiologia médica

Entre as diversas áreas do diagnóstico clínico, a microbiologia médica ocupa, talvez, uma posição de liderança no número e variedade de aplicações da tecnologia PCR. A introdução desse método na prática, juntamente com o diagnóstico sorológico, ampliou significativamente as capacidades da microbiologia clínica moderna, que ainda se baseia em métodos de isolamento e cultivo de microrganismos em meios nutrientes artificiais ou em cultura celular.

Oportunidades e limitações do tradicional
métodos de cultivo

O método tradicional de diagnóstico de cultura para laboratórios microbiológicos, via de regra, funciona bem para identificar e estudar propriedades como sensibilidade a antibióticos e virulência de microrganismos facilmente cultivados. Porém, alguns microrganismos (pneumococos, hemofílicos, neisseria, micoplasmas, anaeróbios obrigatórios, etc.) podem ser extremamente sensíveis às condições de coleta de material clínico, transporte e cultivo, presença de fatores de crescimento especiais, ou são capazes de se reproduzir. em vitro apenas em cultura de células (vírus, clamídia, riquétsias).

O lento crescimento de microrganismos como micobactérias e fungos em meios artificiais é outra limitação natural associada ao uso de métodos de cultura para o diagnóstico destes microrganismos. Além disso, trabalhar com culturas vivas de patógenos isolados, não apenas especialmente perigosos, mas às vezes também patógenos oportunistas, pode representar uma ameaça à saúde do pessoal do laboratório.

Entre os agentes causadores de doenças humanas, também são conhecidas espécies de bactérias não cultiváveis, por exemplo Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, e muitos tipos de vírus, incluindo os vírus do papiloma humano e da hepatite C, as tentativas de cultivá-los em cultura de células até agora não tiveram sucesso. Finalmente, mesmo com cultivo bem sucedido, existe a necessidade de posterior identificação dos microrganismos isolados.

Os métodos tradicionais de identificação microbiológica baseiam-se na utilização de vários testes fenotípicos, tais como a detecção de actividade enzimática específica, a capacidade de metabolizar açúcares ou apoiar o crescimento em meios com aditivos selectivos. A dificuldade de padronização das condições de tais testes, bem como a variabilidade fenotípica natural inerente a muitos microrganismos, pode causar erros de identificação.

Usando PCR para diagnóstico direto
e identificação de patógenos
doenças infecciosas

Nos casos em que o uso de métodos culturais é problemático ou associado à eficiência diagnóstica insuficiente, é considerada a possibilidade de substituição da amplificação biológica (ou seja, crescimento em meio artificial) pela duplicação enzimática de ácidos nucléicos. in vitro com o uso de PCR parece particularmente atraente. Existem várias abordagens para usar PCR para diagnosticar agentes infecciosos. A opção de PCR mais comum (PCR específico) envolve o uso de primers complementares sequência específica DNA característico de um tipo de microrganismo estritamente definido. Por exemplo, a amplificação por PCR de uma região específica do gene que codifica a principal proteína da membrana externa (MOMP) Chlamydia trachomatis, em combinação com a hibridização não radioativa para detectar produtos de reação, permite detectar cópias únicas de DNA de clamídia nas amostras estudadas. Ao mesmo tempo, a PCR é significativamente superior em eficiência diagnóstica ao cultivo e aos métodos de detecção direta do antígeno da clamídia (microimunofluorescência e ensaio imunoenzimático), tradicionalmente usados para detectar C. trachomatis.

Também é possível utilizar vários pares de iniciadores específicos da espécie num tubo de reacção para amplificação simultânea de ADN de vários agentes patogénicos. Esta modificação é chamada de PCR multiplex. (PCR multiplex). A PCR multiplex pode ser usada para identificar o papel etiológico de vários microrganismos que causam um determinado tipo de doença. Por exemplo, opções para usar PCR múltiplo para a detecção simultânea de dois (S. trachomatis E N.gonorrhoeae para doenças do trato urogenital) ou mesmo quatro patógenos (I. influenzae, S. pneumoniae, M. catarrhalis E A. otitidis com otite purulenta crônica).

Uma abordagem alternativa ao diagnóstico por PCR envolve o uso de primers universais, que permitem a amplificação de fragmentos de genes presentes em todos os microrganismos de um determinado grupo taxonômico. O número de espécies que podem ser identificadas usando este método pode ser limitado tanto por pequenos grupos sistemáticos (gênero, família) quanto por grandes táxons em nível de ordem, classe e filo. Neste último caso, os alvos da PCR são na maioria das vezes genes ribossômicos (rRNA 16S e 23S), que possuem estrutura semelhante em vários microrganismos procarióticos.

A utilização de primers complementares às regiões conservadas destes genes permite a amplificação do DNA da maioria das espécies bacterianas. Os fragmentos de PCR resultantes de genes ribossômicos podem então ser analisados usando vários métodos laboratoriais para identificar as bactérias às quais pertencem. O método mais preciso de identificação "molecular" é determinar a sequência completa de nucleotídeos (sequenciamento) do DNA amplificado e compará-la com as sequências correspondentes de espécies conhecidas.

Apesar da disponibilidade de sistemas automatizados que utilizam o princípio de identificação descrito, na prática costumam ser utilizados métodos menos trabalhosos e dispendiosos, que, no entanto, permitem detectar com segurança certas diferenças na sequência dos fragmentos de DNA. Os métodos mais comuns baseiam-se na análise da localização dos sítios de clivagem do DNA com enzimas de restrição (método RFLP - polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição), ou determinando a mobilidade eletroforética do DNA na forma de fita simples (método SSCP polimorfismo conformacional de cadeia simples).

A PCR utilizando primers universais pode ser usada tanto para identificar microrganismos isolados em cultura pura quanto para diagnosticar diretamente uma ampla gama de patógenos diretamente em amostras clínicas. Deve-se notar, entretanto, que a sensibilidade da PCR de “amplo espectro” é geralmente menor em comparação com sistemas de teste “específicos para espécies”. Além disso, a PCR com primers universais não é normalmente utilizada para amostras que podem conter um grande número de microrganismos diferentes devido à dificuldade de analisar produtos de reação resultantes da amplificação de DNA de diferentes espécies.

Métodos de tipagem molecular
Microrganismos baseados em PCR

A PCR é amplamente utilizada não apenas para diagnóstico e identificação, mas também para tipagem de subespécies e análise de parentesco genético (clonalidade) de cepas isoladas de microrganismos, especialmente na realização de estudos epidemiológicos. Em comparação com os métodos fenotípicos tradicionais (bio, fago e serotipagem), a genotipagem baseada em PCR distingue-se pela sua versatilidade, um nível mais profundo de diferenciação, a capacidade de utilizar métodos quantitativos para avaliar a identidade das estirpes e elevada reprodutibilidade. Muitos métodos de genotipagem foram descritos que podem ser considerados derivados da tecnologia PCR.

Apesar da variedade de métodos de tipagem por PCR, o que a maioria tem em comum é o uso de eletroforese em gel para separar fragmentos de DNA de diferentes comprimentos obtidos de cada cepa individual. Ao mesmo tempo, uma análise comparativa dos perfis eletroforéticos individuais, realizada visualmente ou por computador, permite avaliar o grau de parentesco genético das cepas estudadas.

Usando PCR para detectar drogas
resistência em microrganismos

Recentemente, a PCR tem sido cada vez mais utilizada para estudar diversas propriedades de microrganismos patogênicos, em particular para identificar a resistência de certos tipos de patógenos a determinados medicamentos. Via de regra, o uso de PCR para determinar a sensibilidade de microrganismos é aconselhável apenas nos casos em que os métodos fenotípicos tradicionais não são aplicáveis ou não são suficientemente eficazes. Por exemplo, a definição de sensibilidade Mycobacterium tuberculose aos medicamentos antituberculose usando métodos de cultura geralmente leva de 4 a 8 semanas. Além disso, os resultados dos testes fenotípicos nesses casos podem ser distorcidos devido à diminuição da atividade dos medicamentos antimicrobianos durante o cultivo prolongado de microrganismos. Estudo dos mecanismos moleculares de resistência aos medicamentos M. tuberculose e alguns outros patógenos tornou possível o desenvolvimento de métodos baseados em PCR para a rápida identificação de marcadores genéticos de resistência.

Para tal análise, geralmente é usado DNA ou RNA do patógeno isolado em cultura pura. Contudo, em alguns casos existe a possibilidade de análise direta por PCR para resistência a antibióticos sem cultivo prévio do patógeno. A amostra estudada de material clínico é utilizada como fonte de DNA alvo para PCR, e o produto de PCR copiado é analisado para identificar mutações associadas à resistência a antibióticos. Por exemplo, foi desenvolvido um método que permite detectar, por PCR, a resistência do patógeno à rifampicina em pacientes que sofrem de meningite tuberculosa.

Existem, no entanto, limitações naturais ao uso de métodos genéticos para avaliar a resistência de microrganismos aos medicamentos:

Podem faltar dados sobre mecanismos genéticos específicos de resistência;

A resistência a certos medicamentos está frequentemente associada a diferentes mecanismos e mutações em diferentes genes que afetam independentemente o fenótipo.

Por exemplo, a resistência de bactérias Gram-negativas aos antibióticos aminoglicosídeos pode ser causada pela produção de várias enzimas modificadoras de aminoglicosídeos ou por alterações na permeabilidade da parede celular. Neste caso, os resultados da análise PCR, que caracterizam sempre uma secção específica de ADN estritamente definida, não podem servir de base para avaliar a sensibilidade do microrganismo como um todo.

Além disso, a falta de padrões e recomendações internacionais para o uso de PCR para determinar a sensibilidade a medicamentos antimicrobianos é um fator adicional que limita a possibilidade de uso generalizado desta abordagem em diagnósticos práticos.

PRINCÍPIO DO MÉTODO (base biológica molecular)

Entre a grande variedade de métodos de hibridização para análise de DNA, o método PCR é o mais amplamente utilizado em diagnósticos laboratoriais clínicos.

Princípio do método reação em cadeia da polimerase (PCR)(Reação em cadeia da polimerase (PCR)) foi desenvolvida por Kary Mullis (Cetus, EUA) em 1983. e atualmente é amplamente utilizado tanto para pesquisas científicas quanto para diagnósticos na prática assistencial e no Serviço de Vigilância Sanitária e Epidemiológica do Estado (genotipagem, diagnóstico de doenças infecciosas).

O método PCR é baseado em um processo natural - complementação complementar da matriz de DNA, realizada pela enzima DNA polimerase. Esta reação é chamada Replicação do DNA.

A replicação natural do DNA inclui vários estágios:

1) Desnaturação do DNA(desenrolamento da dupla hélice, divergência das fitas de DNA);

2) Formação de seções curtas de DNA de fita dupla(primers necessários para iniciar a síntese de DNA);

3) Síntese de uma nova fita de DNA(conclusão complementar de ambos os threads)

Este processo pode ser usado para obter cópias pequenas seções de DNA específicas para microrganismos específicos, aqueles. realizar uma busca direcionada para essas áreas específicas, que é o objetivo do diagnóstico genético para identificar patógenos de doenças infecciosas.

Descoberta de DNA polimerase termoestável (Taq polimerase) de bactérias termofílicas termis aquático, cujo ótimo está na região de 70-72°C, possibilitou tornar cíclico o processo de replicação do DNA e utilizá-lo para trabalhos in vitro. A criação de termostatos programáveis (amplificadores), que realizam mudanças cíclicas de temperatura de acordo com um determinado programa, criou os pré-requisitos para a introdução generalizada do método PCR na prática do diagnóstico clínico laboratorial. Com múltiplas repetições dos ciclos de síntese, ocorre um aumento exponencial no número de cópias de um determinado fragmento de DNA, o que permite obter um número suficiente de cópias de DNA a partir de uma pequena quantidade de material analisado, que pode conter células únicas de um microrganismo, para identificá-los por eletroforese.

A conclusão da cadeia complementar não começa em nenhum ponto da sequência de DNA, mas apenas em certos blocos iniciais - seções curtas de fita dupla. Ao anexar tais blocos a seções específicas de DNA, é possível direcionar o processo de síntese de uma nova cadeia apenas nesta seção, e não ao longo de toda a extensão da cadeia de DNA. Para criar blocos iniciais em determinadas seções de DNA, dois iniciadores oligonucleotídicos (20 pares de nucleotídeos), chamados primários. Os primers são complementares às sequências de DNA nos limites esquerdo e direito de um fragmento específico e são orientados de tal forma que a conclusão de uma nova cadeia de DNA ocorre apenas entre eles.

Assim, a PCR é um aumento múltiplo no número de cópias (amplificação) de uma região específica do DNA catalisada pela enzima DNA polimerase.

Para realizar a amplificação, são necessários os seguintes componentes:

Mistura de trifosfatos de desoxinucleotídeos (dNTPs)(uma mistura de quatro dNTPs, que são o material para a síntese de novas cadeias complementares de DNA)

Enzima Taq polimerase(uma DNA polimerase termoestável que catalisa o alongamento de cadeias de primers adicionando sequencialmente bases de nucleotídeos à cadeia crescente de DNA sintetizado).

Solução de buffer(meio de reação contendo íons Mg2+ necessários para manter a atividade enzimática)
Para identificar regiões específicas do genoma dos vírus RNA, uma cópia de DNA é primeiro obtida a partir de um modelo de RNA usando uma reação de transcrição reversa (RT) catalisada pela enzima revertase (transcriptase reversa).

Para obter um número suficiente de cópias do fragmento de ADN característico desejado, a amplificação inclui vários (20-40) ciclos.

Cada ciclo de amplificação inclui 3 estágios que ocorrem em diferentes condições de temperatura

Estágio 1: desnaturação do DNA(desentrançamento da dupla hélice). Ocorre a 93-95°C durante 30-40 segundos.

Etapa 2: Anexação de primers (recozimento). A união dos primers ocorre de forma complementar às sequências correspondentes em fitas opostas de DNA nos limites de uma região específica. Cada par de primers possui sua própria temperatura de recozimento, cujos valores estão na faixa de 50-65°C. Tempo de recozimento -20-60 seg.

Etapa 3: Conclusão das cadeias de DNA. A adição complementar de fitas de DNA ocorre da extremidade 5' à extremidade 3' da cadeia em direções opostas, começando nos locais de fixação do primer. O material para a síntese de novas cadeias de DNA são os trifosfatos de desoxirribonucleotídeos (dNTPs) adicionados à solução. O processo de síntese é catalisado pela enzima DNA polimerase termoestável (Taq polimerase) e ocorre a uma temperatura de 70-72°C. O tempo de síntese é de 20 a 40 segundos.

As novas cadeias de DNA formadas no primeiro ciclo de amplificação servem como modelos para o segundo ciclo de amplificação, no qual é formado o fragmento de DNA específico desejado (amplicon). (ver Fig. 2). Nos ciclos de amplificação subsequentes, os amplicons servem como modelo para a síntese de novas cadeias. Assim, os amplicons acumulam-se em solução de acordo com a fórmula 2n, onde n é o número de ciclos de amplificação. Portanto, mesmo que a solução inicial contivesse inicialmente apenas uma molécula de DNA de fita dupla, então, em 30-40 ciclos, cerca de 108 moléculas de amplicon se acumulam na solução. Esta quantidade é suficiente para uma detecção visual fiável deste fragmento por electroforese em gel de agarose. O processo de amplificação é realizado em um termostato programável especial (amplificador), que, de acordo com um determinado programa, altera automaticamente as temperaturas de acordo com o número de ciclos de amplificação.

ETAPAS DA ANÁLISE PCR

O método PCR, como ferramenta de diagnóstico laboratorial de doenças infecciosas, baseia-se na detecção de um pequeno fragmento de DNA do patógeno (várias centenas de pares de bases), específico apenas para um determinado microrganismo, utilizando uma reação em cadeia da polimerase para acumular o desejado fragmento.
O método de análise pelo método PCR inclui três etapas:

1. Isolamento de DNA (RNA) de uma amostra clínica

2. Amplificação de fragmentos específicos de DNA
3. Detecção de produtos de amplificação

Isolamento de DNA (RNA)
Nesta etapa da análise, a amostra clínica é submetida a um tratamento especial, em que ocorre a lise do material celular, remoção das frações proteicas e polissacarídicas e obtenção de solução de DNA ou RNA livre de
inibidores e pronto para amplificação adicional.
A escolha da técnica de isolamento de DNA (RNA) é determinada principalmente pela natureza do material clínico que está sendo processado.

Amplificação de fragmentos específicos de DNA
Nesta fase, pequenos fragmentos específicos de DNA se acumulam na quantidade necessária para sua posterior detecção. A maioria dos métodos para determinar fragmentos específicos do genoma usa os chamados. “uma versão clássica de PCR direcionado. Para aumentar a especificidade e sensibilidade da análise, alguns métodos utilizam o método PCR “aninhado”, que utiliza 2 pares de primers (“externo” - para estágio 1, e “interno” - para estágio 2).

Detecção de produtos de amplificação
Na maioria dos métodos, nesta etapa, a mistura dos produtos de amplificação obtidos na 2ª etapa é separada por eletroforese horizontal em gel de agarose. Antes da separação eletroforética, uma solução de brometo de etídio é adicionada à mistura de amplificação, que forma compostos intersticiais fortes com fragmentos de DNA de fita dupla. Esses compostos são capazes de apresentar fluorescência sob irradiação UV, o que é registrado na forma de faixas luminosas vermelho-alaranjadas após separação eletroforética da mistura de amplificação em gel de agarose.

Como alternativa ao método de detecção eletroforética, que apresenta algumas desvantagens: subjetividade na leitura dos resultados, limitações na determinação do DNA de vários microrganismos em uma reação, pode ser proposto esquemas de detecção de hibridização. Nestes esquemas, o fragmento de DNA formado como resultado da amplificação hibridiza (forma complexos de 2 cadeias - “híbridos”) com uma sonda oligonucleotídica específica. O registro de tais complexos pode ser realizado colorimetricamente ou fluorimetricamente. SPF "Litekh" criou kits de detecção baseados em hibridização com registro fluorimétrico de resultados

VANTAGENS DO MÉTODO PCR como método de diagnóstico de doenças infecciosas:

- Determinação direta da presença de patógenos

Muitos métodos diagnósticos tradicionais, como o imunoensaio enzimático, identificam proteínas marcadoras que são produtos residuais de agentes infecciosos, o que fornece apenas evidências indiretas da presença de infecção. A identificação de uma secção específica do ADN do agente patogénico por PCR dá uma indicação directa da presença do agente infeccioso.

- Alta especificidade
A alta especificidade do método PCR se deve ao fato de um fragmento único de DNA, característico apenas de um determinado patógeno, ser detectado no material em estudo. A especificidade é determinada pela sequência de nucleotídeos dos primers, o que elimina
a possibilidade de obtenção de resultados falsos, ao contrário do método de imunoensaio enzimático, onde são comuns erros devido a reação cruzada de antígenos.

- Alta sensibilidade
O método PCR permite detectar até mesmo células únicas de bactérias ou vírus. O diagnóstico por PCR detecta a presença de patógenos de doenças infecciosas nos casos em que outros métodos (imunológicos, bacteriológicos,
microscópico) isso não pode ser feito. A sensibilidade da análise PCR é de 10 a 1000 células por amostra (a sensibilidade dos testes imunológicos e microscópicos é de 103 a 105 células).

-Universidade do procedimento para identificação de vários patógenos
O material para pesquisa pelo método PCR é o DNA do patógeno. O método baseia-se na identificação de um fragmento de DNA ou RNA específico de um determinado organismo. A semelhança da composição química de todos os ácidos nucléicos permite a utilização de métodos unificados para a realização de pesquisas laboratoriais. Isto torna possível diagnosticar vários patógenos a partir de uma bioamostra. Várias secreções biológicas (muco, urina, expectoração), raspados de células epiteliais, sangue e soro podem ser usados como material de teste.

- Alta velocidade na obtenção de resultados de análises
A análise PCR não requer o isolamento e cultivo de uma cultura do patógeno, o que leva muito tempo. Um método unificado de processamento de biomateriais e detecção de produtos de reação e a automação do processo de amplificação permitem realizar uma análise completa em 4 a 4,5 horas.

Deve-se notar que o método PCR pode detectar patógenos não apenas em material clínico obtido de um paciente, mas também em material obtido de objetos ambientais (água, solo, etc.)

APLICAÇÃO DO MÉTODO PCR NA PRÁTICA DE SAÚDE

A utilização do método PCR para diagnóstico de doenças infecciosas de natureza bacteriana e viral é de enorme importância para a resolução de muitos problemas de microbiologia e epidemiologia. A utilização desse método também contribui para o desenvolvimento de pesquisas básicas na área de estudo de doenças infecciosas crônicas e pouco compreendidas.

O uso mais eficaz e economicamente viável do método é em:

prática uroginecológica- para detectar clamídia, ureaplasmose, gonorréia, herpes, gardnerelose, infecção por micoplasma;

em pneumologia- para diagnóstico diferencial de pneumonia viral e bacteriana, tuberculose;

em gastroenterologia- identificar helicobacteriose;

na clínica de doenças infecciosas- como método expresso para diagnóstico de salmonelose, difteria, hepatites virais B, C e G;

em hematologia- para detectar infecção por citomegalovírus, oncovírus.

Princípios de diagnóstico de PCR

ABSTRATO

seções, 34 páginas, 5 figuras, 5 referências

O objetivo deste trabalho é um breve resumo dos princípios básicos e características tecnológicas do método PCR, sua aplicação científica e prática no diagnóstico de doenças infecciosas.

LISTA DE ABREVIATURAS CONVENCIONAIS

HCV - vírus da hepatite C

dATP - trifosfato de desoxiadenosina

dGTP - trifosfato de desoxiguanosina

dNTP - desoxinucleotídeo trifosfato

dTTP - trifosfato de desoxitimidina

dCTP - trifosfato de desoxicitosina

DNA - ácido desoxirribonucléico

PCR - reação em cadeia da polimerase

RNA - ácido ribonucleico - classe de imunoglobulina GTime PCR - método PCR em tempo real

INTRODUÇÃO

PRINCÍPIO DO MÉTODO PCR

ETAPAS DA ANÁLISE PCR

MÉTODO PCR EM TEMPO REAL

VANTAGENS DO MÉTODO PCR

LIMITAÇÕES DO MÉTODO PCR

APLICAÇÃO DO MÉTODO PCR

CONCLUSÃO

LISTA DE REFERÊNCIAS USADAS

INTRODUÇÃO

A descoberta do método da reação em cadeia da polimerase (PCR) tornou-se um dos desenvolvimentos mais notáveis no campo da biologia molecular nas últimas décadas. Isso tornou possível elevar o diagnóstico médico a um nível qualitativamente novo. O princípio do método da reação em cadeia da polimerase foi desenvolvido por Carrie Mullis em 1983. Pelo desenvolvimento da análise PCR, K. Mullis recebeu o Prêmio Nobel de Química em 1993.

Após a descoberta do PCR, ele foi rapidamente introduzido na prática. O método se tornou tão popular que hoje é difícil imaginar trabalhar na área de biologia molecular sem seu uso. O método PCR recebeu um desenvolvimento particularmente rápido graças ao programa internacional do Genoma Humano. Foram criadas tecnologias modernas de sequenciamento a laser (decodificação de sequências de nucleotídeos de DNA). Se no passado recente demorava uma semana para decifrar uma sequência de DNA de 250 pares de nucleotídeos (pb), os sequenciadores a laser modernos podem determinar até 5.000 pb. Em um dia. Isto, por sua vez, contribui para o crescimento significativo de bases de dados de informação contendo sequências de DNA. Atualmente, diversas modificações da PCR foram propostas, foi demonstrada a possibilidade de criação de sistemas de testes para detecção de microrganismos e identificação de mutações pontuais e dezenas de possíveis aplicações do método foram descritas.

O surgimento do método PCR deveu-se a certas conquistas no campo da genética molecular, principalmente a decodificação da sequência de nucleotídeos dos genomas de vários microrganismos. De referir que esta descoberta foi acompanhada pelo desenvolvimento de determinadas tecnologias. Em particular, o surgimento de dispositivos que permitem sintetizar automaticamente fragmentos de DNA de fita simples (oligonucleotídeos). Durante o mesmo período, foram descobertos microrganismos únicos que viviam em gêiseres. Seu sistema enzimático, em particular a DNA polimerase, resiste às altas temperaturas das fontes termais e mantém sua atividade biológica até 95 ° C, condição necessária para a realização da reação em cadeia da polimerase.

A reação em cadeia da polimerase é atualmente o método diagnóstico mais avançado de biologia molecular, genética molecular e diagnóstico laboratorial clínico, permitindo a identificação de células únicas de patógenos de muitas doenças infecciosas nos tecidos e fluidos biológicos do corpo.

O método de PCR baseia-se na complementação complementar de uma seção de DNA genômico ou RNA do patógeno, realizada in vitro por meio da enzima DNA polimerase termoestável. A especificidade do método é determinada pela singularidade do material genético dos agentes infecciosos detectados, para os quais são selecionados os iniciadores oligonucleotídicos envolvidos no processo de amplificação.

Diagnóstico de doenças infecciosas, inclusive aquelas causadas por agentes de difícil cultivo, genotipagem de microrganismos, avaliação de sua virulência, determinação da resistência da microflora a antibióticos, diagnóstico pré-natal, monitoramento biológico de hemoderivados - esta é uma lista incompleta de áreas da medicina usando PCR. Hoje, a análise PCR continua sendo a tecnologia mais difundida e em desenvolvimento dinâmico. Todos os anos, surgem no mercado dezenas de novos sistemas de testes para análise de PCR, projetados tanto para identificar as sequências de nucleotídeos de diversos microrganismos causadores de doenças, quanto para estudar genes humanos. O custo da análise PCR está diminuindo constantemente, o que contribui para o uso cada vez mais difundido do método em instituições médicas e diagnósticas. O número de laboratórios de PCR nos países da CEI está crescendo exponencialmente e, aparentemente, num futuro próximo, a análise de PCR se tornará um dos métodos de diagnóstico laboratorial mais comuns.

1. PRINCÍPIO DO MÉTODO PCR

A reação em cadeia da polimerase é um método que imita a replicação natural do DNA e permite a detecção de uma única molécula específica de DNA na presença de milhões de outras moléculas.

A essência do método é copiar (amplificar) repetidamente certas seções de DNA em um tubo de ensaio durante repetidos ciclos de temperatura. A cada ciclo de amplificação, fragmentos previamente sintetizados são novamente copiados pela DNA polimerase. Devido a isso, há um aumento múltiplo no número de fragmentos específicos de DNA, o que simplifica muito análises posteriores.

O método PCR é baseado em um processo natural - complementação complementar da matriz de DNA, realizada pela enzima DNA polimerase. Essa reação é chamada de replicação do DNA.

A replicação natural do DNA inclui vários estágios:

) desnaturação do DNA (desenrolamento da dupla hélice, divergência das fitas de DNA);

) Formação de seções curtas de DNA de fita dupla (primers necessários para iniciar a síntese de DNA);

) Síntese de uma nova fita de DNA (completação complementar de ambas as fitas).

Este processo pode ser usado para produzir cópias de pequenas seções de DNA que são específicas de microrganismos específicos, ou seja, realizar uma busca direcionada para essas áreas específicas, que é o objetivo do diagnóstico genético para identificar patógenos de doenças infecciosas.

Descoberta de DNA polimerase termoestável (Taq polimerase) de bactérias termofílicas Termisaquaticus, cujo ótimo está na região de 70-72°C, possibilitou tornar cíclico o processo de replicação do DNA e utilizá-lo para trabalhos in vitro. A criação de termostatos programáveis (amplificadores), que realizam mudanças cíclicas de temperatura de acordo com um determinado programa, criou os pré-requisitos para a introdução generalizada do método PCR na prática do diagnóstico clínico laboratorial. Com múltiplas repetições dos ciclos de síntese, ocorre um aumento exponencial no número de cópias de um determinado fragmento de DNA, o que permite obter um número suficiente de cópias de DNA para sua identificação a partir de uma pequena quantidade de material analisado, que pode conter células únicas de microrganismos.

A conclusão da cadeia complementar não começa em nenhum ponto da sequência de DNA, mas apenas em certos blocos iniciais - seções curtas de fita dupla. Ao anexar tais blocos a seções específicas de DNA, é possível direcionar o processo de síntese de uma nova cadeia apenas nesta seção, e não ao longo de toda a extensão da cadeia de DNA. Para criar blocos iniciais em determinadas seções de DNA, são usados dois iniciadores oligonucleotídicos (20 pares de nucleotídeos), chamados iniciadores. Os primers são complementares às sequências de DNA nos limites esquerdo e direito de um fragmento específico e são orientados de tal forma que a conclusão de uma nova cadeia de DNA ocorre apenas entre eles.

Assim, a PCR é um aumento múltiplo no número de cópias (amplificação) de uma região específica do DNA catalisada pela enzima DNA polimerase.

. ETAPAS DA ANÁLISE PCR

O método de análise pelo método PCR inclui três etapas:

1. Isolamento de DNA (RNA) de amostra clínica;

2. Amplificação de fragmentos específicos de DNA;

. Detecção de produtos de amplificação.

. Isolamento de DNA (RNA)

Nesta fase da análise, a amostra clínica é submetida a um processamento especial, em que o material celular é lisado, são retiradas as frações proteicas e polissacarídicas e obtida uma solução de DNA ou RNA, livre de inibidores e pronta para uso. amplificação adicional. A escolha da técnica de extração de DNA (RNA) é determinada principalmente pela natureza do material clínico que está sendo processado.

2.Amplificação de fragmentos específicos de DNA

Nesta fase, pequenos fragmentos específicos de DNA se acumulam na quantidade necessária para sua posterior detecção.

Para realizar uma reação em cadeia da polimerase, vários componentes devem estar presentes na mistura de reação:

· Primers- oligonucleotídeos sintetizados artificialmente, geralmente variando em tamanho de 15 a 30 pb, idênticos às seções correspondentes do DNA alvo. Eles desempenham um papel fundamental na formação de produtos de reação de amplificação. Primers corretamente selecionados garantem a especificidade e sensibilidade do sistema de teste.

· Polimerase Taq- enzima termoestável que garante a conclusão de 3 - o fim da segunda cadeia de ADN de acordo com o princípio da complementaridade.

· Mistura de trifosfatos de desoxinucleotídeos (dNTPs)- trifosfato de desoxiadenosina (dATP), trifosfato de desoxiguanosina (dGTP), trifosfato de desoxicitosina (dCTP) e trifosfato de desoxitimidina (dTTP) - o “material de construção” usado pela Taq polimerase para sintetizar a segunda fita de DNA.

· Amortecedor -uma mistura de cátions e ânions em uma determinada concentração, proporcionando condições ideais para a reação, bem como um valor de pH estável.

· Amostra analisada- uma preparação preparada para adição à mistura reaccional, que pode conter o ADN desejado, por exemplo, o ADN de microrganismos, que serve de alvo para subsequentes cópias repetidas.

Fig.1 Componentes da mistura reacional

Cada ciclo de amplificação inclui 3 estágios que ocorrem em diferentes condições de temperatura:

Estágio 1:Desnaturação do DNA (desentrançamento da dupla hélice). Ocorre a 93-95°C durante 30-40 segundos.

Um dos circuitos (+) é usado como matriz principal. Suas cinco pontas de barra são fixadas pela enzima DNA polimerase, que garante a construção de uma segunda fita de DNA, complementar à primeira, a partir de nucleotídeos individuais. O mesmo, só que no sentido oposto, acontece na segunda fita de DNA, porém, como o desenrolamento da molécula de DNA ocorre na ordem inversa, a nova fita é construída em pequenos fragmentos, que são então costurados. Para que a enzima DNA polimerase comece seu trabalho, é necessária a presença de uma semente ou primer - um pequeno fragmento de DNA de fita simples, que, quando conectado à região complementar de uma das fitas originais do DNA, forma um bloco inicial. para o crescimento da vertente filha.

Etapa 2:Anexação de primers (recozimento). A ligação dos primers ocorre de forma complementar às sequências correspondentes em fitas opostas de DNA nos limites de uma região específica. Cada par de primers possui sua própria temperatura de recozimento, cujos valores estão na faixa de 50-65°C. A temperatura de recozimento de primers calculada com precisão e verificada experimentalmente é uma das características que determina a especificidade da reação, excluindo a ligação de primers a sequências incompletamente complementares.

Como o crescimento das fitas filhas de DNA pode ocorrer simultaneamente em ambas as fitas do DNA materno, a DNA polimerase na segunda fita também requer seu próprio iniciador. Assim, dois iniciadores são adicionados à mistura reaccional. Na verdade, os primers, ligados às fitas opostas da molécula de DNA, limitam a parte dela que será posteriormente duplicada ou amplificada muitas vezes. Esses fragmentos de DNA são chamados amplicons. O comprimento de um amplicon pode ser de várias centenas de nucleotídeos. Ao alterar um par de primers, podemos passar da análise de um patógeno para a análise de outro.

Tempo de recozimento -20-60 seg.

Etapa 3:Conclusão das cadeias de DNA (alongamento).

O mecanismo de cópia é tal que a adição complementar de fitas não pode começar em nenhum ponto da sequência de DNA, mas apenas em certos blocos iniciais (seções curtas de fita dupla). Para criar blocos iniciais em determinadas seções de DNA, são usados primers, que são oligonucleotídeos com cerca de 20 pb de comprimento, também chamados de primers. Eles são complementares às sequências de DNA nos limites esquerdo e direito de um fragmento específico e são orientados de tal forma que a síntese de DNA realizada pela DNA polimerase ocorre apenas entre eles.

A conclusão complementar das cadeias de DNA ocorre da extremidade 5' para a extremidade 3' da cadeia em direções opostas, começando nos locais de fixação do primer. O material para a síntese de novas cadeias de DNA é o desoxirribonucleotídeo fosfato introduzido. Este processo é catalisado pela enzima Tag polimerase. O novo DNA formado no primeiro ciclo de síntese serve como material de partida para o segundo ciclo, no qual o fragmento de DNA específico desejado (amplicon) é formado, etc.

Fig.2 Princípio da amplificação do DNA

Atualmente, vários métodos são utilizados para preparar uma amostra para PCR. O procedimento de preparação da amostra inclui lise microbiana e extração de ácido nucleico. Para destruir a célula microbiana, utiliza-se fervura simples, congelamento-descongelamento na presença de lisozima, bem como tampões de lise especiais contendo detergentes e proteinase. A escolha do método é geralmente ditada pela natureza do micróbio, mais precisamente, pela natureza de sua parede celular. O método de obtenção de uma preparação de DNA puro, descrito por B.R. Marmionetal, é considerado padrão e já se tornou clássico. (1993). Envolve proteólise enzimática seguida de desproteinização e precipitação de DNA com álcool. Este método permite obter uma preparação de DNA puro, mas é bastante trabalhoso e envolve trabalhar com substâncias agressivas e de cheiro forte como fenol e clorofórmio.

Um dos mais populares é o método de extração de DNA proposto por R.Boometal. (1990), baseado no uso de um forte agente de lise - tiocianato de guanidina (GuSCN) para lise celular e posterior sorção de DNA em um transportador (esferas de vidro, terra diatomácea, “leite” de vidro, etc.). Após a lavagem, o DNA permanece na amostra, sorvido no transportador, do qual é facilmente removido por meio de um tampão de eluição. O método é conveniente, tecnologicamente avançado e adequado para preparar uma amostra para amplificação. No entanto, a perda de DNA é possível devido à sorção irreversível no transportador, bem como durante inúmeras lavagens. Isto é especialmente importante quando se trabalha com pequenas quantidades de DNA em uma amostra. Além disso, mesmo pequenas quantidades de GuSCN podem inibir a PCR, portanto, ao utilizar este método, a escolha correta do sorvente e o cumprimento cuidadoso das nuances tecnológicas são muito importantes. Ressalta-se que devido ao grande número de etapas de adição e remoção de soluções, é necessário cuidado no manuseio da amostra, pois é possível a contaminação cruzada entre as amostras e o aerossol de DNA resultante.

Com o procedimento clássico de extração de DNA com fenol-clorofórmio, consegue-se uma boa purificação do DNA, principalmente dos inibidores da polimerase Tag, mas grandes perdas de ácido nucleico são inevitáveis, especialmente perceptíveis quando se trabalha com amostras pequenas com baixa concentração do agente infeccioso.

Outro grupo de métodos de preparo de amostras baseia-se na utilização de trocadores de íons como o Chilex (EUA), que, diferentemente do vidro, não absorvem DNA, mas impurezas que interferem na reação. Via de regra, essa tecnologia inclui duas etapas: fervura da amostra e sorção das impurezas em um trocador iônico. O método é extremamente atrativo devido à sua simplicidade de execução. Na maioria dos casos é adequado para trabalhar com material clínico. Infelizmente, às vezes há amostras com impurezas que não podem ser removidas com trocadores de íons. Além disso, alguns microrganismos não podem ser destruídos pela simples fervura. Nestes casos, é necessário introduzir etapas adicionais de processamento da amostra.

Durante a triagem em massa, quando é importante obter dados estatísticos, é possível utilizar métodos simples utilizando detergentes ou tratando material biológico com álcalis e posteriormente neutralizando-os. Ao mesmo tempo, o uso de tais métodos para diagnóstico clínico pode levar a resultados falsos negativos devido ao uso de preparação de DNA de baixa qualidade na mistura de reação. Assim, a escolha do método de preparo da amostra deve ser levada em consideração com a compreensão dos objetivos da análise pretendida.

Durante o procedimento seguinte - amplificação - uma amostra contendo o DNA do patógeno é introduzida em um pequeno tubo de ensaio com componentes que garantem a reação da polimerase, dois tipos de primers, duas enzimas (Tag polimerase e N-uracil glicolase) e quatro tipos de nucleotídeo A, G, Ts, U. Para realizar a reação da polimerase, é utilizado um dispositivo especial (termociclador ou amplificador de DNA), que permite alterar automaticamente a temperatura da mistura reacional de acordo com um determinado programa. Na primeira rodada de PCR, a amostra é aquecida a uma temperatura de 94°C para separar as duas fitas complementares de DNA. A temperatura cai então para 40-60°C, altura em que os iniciadores são ligados a uma única cadeia de ADN, após o que a temperatura sobe novamente para 72°C, quando a actividade da polimerase é mais pronunciada. Todo o ciclo com mudanças de temperatura dura menos de 3 minutos.

Para avaliar corretamente os resultados da PCR, é importante compreender que este método não é quantitativo. Teoricamente, os produtos de amplificação de moléculas de DNA de alvo único podem ser detectados usando eletroforese após 30-35 ciclos. Porém, na prática, isso só é feito nos casos em que a reação ocorre em condições próximas do ideal, o que é raro. O grau de pureza da preparação de DNA tem uma influência particularmente grande na eficiência da amplificação, ou seja, a presença na mistura de reação de certos inibidores, dos quais em alguns casos pode ser extremamente difícil eliminar. Às vezes, devido à sua presença, mesmo dezenas de milhares de moléculas alvo de DNA não podem ser amplificadas. Assim, muitas vezes não existe uma relação directa entre a quantidade inicial de ADN alvo e a quantidade final de produtos de amplificação.

Vários métodos são usados para visualizar os resultados da amplificação. O mais comum hoje é a eletroforese, baseada na separação das moléculas de DNA por tamanho. Para isso, prepare uma placa de gel de agarose, que é a agarose solidificada após fusão em tampão de eletroforese na concentração de 1,5-2,5% com adição de um corante especial de DNA, por exemplo, brometo de etídio. A agarose solidificada forma uma rede espacial. Ao vazar com pentes, formam-se poços especiais no gel, aos quais são posteriormente adicionados produtos de amplificação. A placa de gel é colocada num aparelho de eletroforese em gel horizontal e uma fonte de tensão constante é conectada. O DNA carregado negativamente começa a se mover no gel de menos para mais. Neste caso, as moléculas de DNA mais curtas movem-se mais rapidamente do que as mais longas. A velocidade do movimento do DNA no gel é influenciada pela concentração de agarose, pela intensidade do campo elétrico, pela temperatura, pela composição do tampão de eletroforese e, em menor grau, pela composição do DNA. Todas as moléculas do mesmo tamanho se movem na mesma velocidade. O corante é incorporado (intercalado) por grupos planares em moléculas de DNA. Após o término da eletroforese, que dura de 10 minutos a 1 hora, o gel é colocado sobre um filtro transiluminador que emite luz na faixa ultravioleta (254 - 310 nm). A energia ultravioleta absorvida pelo DNA a 260 nm é transferida para o corante, fazendo com que ele fique fluorescente na região vermelho-alaranjada do espectro visível (590 nm).

O padrão de DNA do microrganismo desejado é usado como “controle positivo”. O tamanho dos amplicons inespecíficos pode ser maior ou menor em comparação com o “controle positivo”. Na pior das hipóteses, esses tamanhos podem coincidir e ser lidos como positivos na eletroforese.

O “controle positivo” permite garantir que todos os componentes incluídos na mistura de reação garantem o progresso normal da reação. Ao mesmo tempo, uma preparação de DNA preparada para PCR a partir de material biológico pode conter impurezas de inibidores, o que reduz significativamente a eficiência da reação e, em alguns casos, leva à ausência de amplicons específicos mesmo na presença do patógeno desejado. É necessário monitorar o progresso da amplificação em cada tubo de ensaio com a mistura de reação, para a qual é utilizado um chamado “controle interno” adicional, que é qualquer padrão de DNA diferente do DNA do microrganismo desejado.

Para sistemas de teste infecciosos, às vezes, por exemplo, é usado o gene da p-globina, em cujas extremidades, por meio de manipulações de engenharia genética, são costuradas seções de DNA homólogas aos primers incluídos no sistema de teste. Se um “controle interno” for adicionado à mistura de reação, ele se tornará o mesmo alvo para o recozimento do primer que o DNA cromossômico do agente infeccioso desejado. O tamanho do produto de amplificação de controle interno é selecionado de modo que seja 2 ou mais vezes maior que os amplicons formados a partir da amplificação do DNA do microrganismo desejado. Como resultado, se o DNA de “controle interno” for adicionado à mistura de reação junto com a amostra de teste, então, independentemente da presença de um microrganismo na amostra biológica, o “controle interno” causará a formação de amplicons específicos, mas significativamente mais longo (mais pesado) do que o amplicon do microrganismo. A presença de amplicons pesados na mistura de reação indica o progresso normal da reação de amplificação e a ausência de inibidores. Caso não sejam formados amplicons do tamanho requerido e do “controle interno”, podemos concluir que há impurezas indesejáveis na amostra analisada que devem ser eliminadas, mas não sobre a ausência do DNA desejado.

Apesar de toda a atratividade desta abordagem, ela apresenta uma falha significativa. Assim, se o DNA desejado estiver presente na mistura reacional, então a eficiência de sua amplificação diminui drasticamente devido à competição com o “controle interno” por primers. Isto é fundamentalmente importante em baixas concentrações de DNA na amostra de teste e pode levar a resultados falsos negativos. No entanto, desde que o problema da competição pelos iniciadores seja resolvido, este método de monitorização da eficiência da amplificação será certamente muito útil.

Fig. 3 Segundo ciclo de amplificação de DNA

. Detecção de produtos de amplificação

). Método de eletroforese horizontal

Um dos métodos de visualização dos resultados da amplificação é o método de eletroforese, baseado na separação das moléculas de DNA por tamanho. Na maioria dos métodos, nesta etapa, a mistura dos produtos de amplificação obtidos na 2ª etapa é separada por eletroforese horizontal em gel de agarose. Antes da separação eletroforética, uma solução de brometo de etídio é adicionada à mistura de amplificação, que forma compostos intersticiais fortes com fragmentos de DNA de fita dupla. Esses compostos são capazes de apresentar fluorescência sob irradiação UV, o que é registrado na forma de bandas luminosas após separação eletroforética da mistura de amplificação em gel de agarose. O brilho das bandas do produto de amplificação pode variar. Portanto, é frequentemente habitual nos laboratórios de PCR avaliar o resultado usando um sistema de três, quatro ou cinco pontos. No entanto, não pode ser associado à quantidade inicial de DNA alvo na amostra. Muitas vezes, uma diminuição no brilho das bandas está associada a uma diminuição na eficiência da amplificação sob a influência de inibidores ou outros fatores.

Fig.4 Detecção de produtos de amplificação por eletroforese horizontal

). Método de eletroforese vertical

O método de eletroforese vertical é fundamentalmente semelhante à eletroforese horizontal. A diferença é que neste caso se utiliza poliacrilamida em vez de agarose. É realizado em câmara especial para eletroforese vertical. A eletroforese em gel de poliacrilamida tem maior resolução em comparação à eletroforese em agarose e permite distinguir moléculas de DNA de diferentes tamanhos com precisão de um nucleotídeo. A preparação do gel de poliacrilamida é um pouco mais complicada do que o gel de agarose. Além disso, a acrilamida é uma substância tóxica. Como raramente surge a necessidade de determinar o tamanho de um produto de amplificação com uma precisão de 1 nucleotídeo, este método não é usado em trabalhos de rotina.

3). Método de sonda de hibridização

Como alternativa ao método de detecção eletroforética, que apresenta algumas desvantagens: subjetividade na leitura dos resultados, limitações na determinação do DNA de vários microrganismos em uma reação, podem ser propostos esquemas de detecção de hibridização. Nestes esquemas, o fragmento de DNA formado como resultado da amplificação hibridiza (forma complexos de 2 cadeias - “híbridos”) com uma sonda oligonucleotídica específica. O registro de tais complexos pode ser realizado colorimetricamente ou fluorimetricamente.

3. MÉTODO PCR EM TEMPO REAL (PCR em tempo real)

O método PCR em tempo real permite detectar produtos de amplificação durante a reação e monitorar a cinética de acumulação de produtos amplificados. Para detectar um produto de PCR, são utilizados corantes fluorescentes que fornecem fluorescência diretamente proporcional à quantidade de produto de PCR - fluorescência repórter. Os mecanismos para sua geração variam dependendo do tipo específico de PCR em Tempo Real.

A curva cinética nas coordenadas “Nível de fluorescência do repórter - ciclo de amplificação” tem formato de S.

Pode ser dividido em três etapas:

1.Estágio de iniciação (quando os produtos de PCR ainda não são detectados por um rótulo fluorescente).

2.Estágio exponencial (no qual existe uma dependência exponencial da quantidade de fluorescência no ciclo de PCR).

.Platô (estágio de saturação).

Fig.5 Gráfico da curva cinética de fluorescência usando PCR em tempo real

O registro do sinal fluorescente é realizado durante o processo de amplificação em um dispositivo especial - um termociclador para PCR em tempo real. Com base no aumento da intensidade do sinal fluorescente, a concentração do modelo inicial de DNA é calculada utilizando o software fornecido com o amplificador.

Vantagens do método PCR em tempo real

n a capacidade de detectar a acumulação de produtos de amplificação directamente durante a amplificação;

n a vantagem fundamental é a capacidade de detectar o acúmulo de amplicons sem abrir o tubo, o que minimiza o risco de resultados falso-positivos devido à contaminação de amostras e reagentes com produtos de amplificação;

n uma redução significativa no número de manipulações com a amostra de teste reduz o tempo, simplifica a análise e reduz a probabilidade de erros;

n Esta abordagem permite eliminar a etapa de eletroforese, o que leva a uma diminuição acentuada da probabilidade de contaminação das amostras de teste com produtos de amplificação;

n redução de exigências para laboratórios de PCR;

n aumentar a objetividade na interpretação dos resultados de um estudo de PCR, uma vez que o processamento é realizado por meio do software do dispositivo;

n O tempo total de pesquisa é reduzido significativamente, quase pela metade, permitindo que os resultados sejam obtidos em 1,5 a 2 horas após a chegada do material clínico ao laboratório;

n Este método permite pela primeira vez quantificar o conteúdo de DNA de um microrganismo em uma amostra clínica;

n o uso de sondas de hibridização juntamente com primers aumenta a especificidade da análise;

n a possibilidade de registo simultâneo independente do sinal fluorescente de várias sondas de ADN de hibridização permite a identificação num estudo de várias regiões diferentes do mesmo ou de diferentes alvos de ADN.

. VANTAGENS DO MÉTODO PCR

n Identificação direta de patógenos de doenças infecciosas

O método PCR dá uma indicação direta da presença de um fragmento específico de DNA do patógeno no material retirado do paciente.

n Alta especificidade de PCR

Usando o método PCR, um fragmento de DNA é isolado no material em estudo que é exclusivo de um patógeno específico - uma bactéria ou um vírus. Esta seção de DNA é única e não é típica de nenhuma infecção na Terra. A especificidade é determinada pela sequência de nucleotídeos dos primers, o que elimina a possibilidade de obtenção de resultados falsos, ao contrário do método de ensaio imunoenzimático, onde são comuns erros devido a reação cruzada de antígenos.

n PCR de alta sensibilidade

O método PCR permite detectar até mesmo células únicas de bactérias ou vírus. O diagnóstico por PCR detecta a presença de patógenos de doenças infecciosas nos casos em que isso não pode ser feito por outros métodos (imunológico, bacteriológico, microscópico). A sensibilidade da análise PCR é de 10 a 1000 células por amostra (a sensibilidade dos testes imunológicos e microscópicos é de 103 a 105 células).

n A versatilidade do PCR

Como o patógeno pode estar contido em quaisquer secreções e tecidos biológicos, a pesquisa de PCR pode usar quase todos os materiais, incluindo aqueles inacessíveis para pesquisa por outros métodos - muco, urina, sangue, soro, escarro, ejaculação, raspagens de células epiteliais.

n Alta velocidade na obtenção de resultados de análises PCR

A análise PCR não requer o isolamento e cultivo de uma cultura do patógeno, o que leva muito tempo. Um método unificado de processamento de biomateriais e detecção de produtos de reação e a automação do processo de amplificação permitem realizar uma análise completa em 4 a 4,5 horas.

n Capacidade de diagnosticar qualquer tipo de infecção

A alta sensibilidade do método PCR permite diagnosticar infecções não apenas na fase aguda da doença, mas também infecções crônicas e até mesmo a presença de bactérias ou vírus únicos.

Atualmente, a vantagem da análise PCR sobre o método cultural para detecção de microrganismos é a seguinte:

Maior frequência de detecção do micróbio, superando o mesmo indicador ao utilizar o método de cultura em 6-7%. Essas diferenças são explicadas pela possível morte do micróbio durante o armazenamento e transporte, enquanto a PCR é capaz de detectar formas inviáveis do microrganismo.

O tempo necessário para detectar um patógeno pelo método de cultura é de cerca de 4 dias, enquanto o uso da PCR permite a detecção do micróbio em 4-5 horas.

O uso da tecnologia PCR permite a detecção de patógenos, como a clamídia, em amostras colhidas de forma não invasiva, como a urina.

O método PCR é especialmente eficaz para diagnosticar formas de microrganismos difíceis de cultivar, não cultiváveis e persistentes, frequentemente encontradas em infecções latentes e crônicas, uma vez que este método evita as dificuldades associadas ao cultivo de tais microrganismos em condições laboratoriais.

n Possibilidade de realizar monitorar e avaliar a eficácia da terapia, especialmente para doenças virais.

n Possibilidade de detecção subtipos e cepas individuais de vírus e bactérias.

n Possibilidade de definição vários tipos de patógenos (Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Trichomonas vaginalis, Ureaplasmaurealyticum) de um tubo com material biológico.

Este método é comparável em intensidade de trabalho aos métodos clássicos (imunoensaio enzimático, imunofluorescência, etc.), mas fornece informações diagnósticas mais confiáveis, permitindo a detecção direta de DNA ou RNA de um agente infeccioso em material clínico. Portanto, o método PCR, juntamente com o método de cultura, é reconhecido como “padrão ouro” para o diagnóstico de doenças infecciosas.

5. LIMITAÇÕES DO MÉTODO PCR

· Durante a reação, o DNA de microrganismos vivos e mortos é amplificado

· Possibilidade de reação cruzada

A seleção de primers é baseada no conhecimento existente sobre o genoma de um determinado microrganismo e de microrganismos semelhantes. Teoricamente, existe a possibilidade de o mesmo fragmento estar presente em outros microrganismos cujo genoma ainda não foi decifrado e que não foram testados quanto à possibilidade de reação cruzada. A presença de tais microrganismos na amostra pode levar a um resultado de teste falso positivo.

· Variabilidade de microrganismos

Embora na construção de um sistema de teste o fragmento do genoma utilizado para amplificação seja selecionado de uma região altamente conservada, a variabilidade dos microrganismos pode levar ao fato de que alguns genótipos ou cepas do patógeno em estudo podem adquirir mutações na região amplificada do genoma , e assim se tornar indescritível para este sistema de teste.

Os dois últimos pontos são importantes para desenvolvedores de kits de diagnóstico PCR. Foram agora desenvolvidas normas para regular a quantidade de testes (incluindo testes para reações cruzadas, bem como testes de estirpes conhecidas do agente patogénico que está a ser detetado) que um sistema de teste deve ser submetido antes de chegar ao mercado.

6. APLICAÇÃO DO MÉTODO PCR

diagnóstico de polimerase doença infecciosa

A PCR é usada em muitas áreas para análises e experimentos científicos:

1. perícia

A PCR é usada para comparar as chamadas “impressões digitais genéticas”. É necessária uma amostra de material genético da cena do crime - sangue, saliva, sêmen, cabelo, etc. Uma quantidade muito pequena de DNA é suficiente, teoricamente uma cópia. O DNA é dividido em fragmentos e depois amplificado por PCR. Os fragmentos são separados por eletroforese de DNA. O padrão resultante do arranjo das bandas de DNA é chamado de impressão digital genética.

2. estabelecimento de paternidade

Ao analisar os resultados da eletroforese de fragmentos de DNA amplificados por PCR pai-filho-mãe, descobre-se que a criança herdará algumas características da impressão genética de ambos os pais, o que dá uma impressão única. Embora as impressões digitais genéticas sejam únicas (exceto no caso de gêmeos idênticos), as relações familiares ainda podem ser estabelecidas através da coleta de várias impressões digitais. O mesmo método pode ser aplicado, ligeiramente modificado, para estabelecer a relação evolutiva entre os organismos.

3. diagnóstico médico

A PCR permite acelerar e facilitar significativamente o diagnóstico de doenças hereditárias e virais. O gene de interesse é amplificado por PCR utilizando primers apropriados e depois sequenciado para identificar mutações. As infecções virais podem ser detectadas imediatamente após a infecção, semanas ou meses antes do aparecimento dos sintomas.

4. clonagem genética

A clonagem de genes é o processo de isolamento de genes e, como resultado de manipulações de engenharia genética, a obtenção de uma grande quantidade do produto de um determinado gene. A PCR é usada para amplificar um gene, que é então inserido em um vetor - um pedaço de DNA que transfere um gene estranho para o mesmo ou outro organismo conveniente para cultivo. Por exemplo, plasmídeos ou DNA viral são usados como vetores. A inserção de genes em um organismo estranho é geralmente usada para produzir o produto desse gene – RNA ou, mais frequentemente, uma proteína. Desta forma, muitas proteínas são obtidas em quantidades industriais para utilização na agricultura, medicina, etc.

5. Sequenciamento de DNA

No método de sequenciamento utilizando didesoxinucleotídeos marcados com marcador fluorescente ou isótopo radioativo, a PCR é parte integrante, pois é durante a polimerização que os derivados de nucleotídeos marcados com marcador fluorescente ou radioativo são inseridos na cadeia de DNA. Isto interrompe a reação, permitindo que as posições de nucleotídeos específicos sejam determinadas após as cadeias sintetizadas serem separadas no gel.

6. mutagênese

Atualmente, a PCR tornou-se o principal método para realizar a mutagênese (alteração da sequência de nucleotídeos do DNA). A utilização da PCR permitiu simplificar e agilizar o procedimento de mutagênese, além de torná-lo mais confiável e reprodutível.

7. diagnóstico de doenças infecciosas

8. diagnóstico de doenças virais

Os benefícios mais abrangentes da PCR no diagnóstico de doenças virais podem ser demonstrados considerando o processo infeccioso causado pelo vírus da hepatite C (HCV). A PCR tem um valor diagnóstico especial para detectar este vírus pelas seguintes razões:

) falta de método de cultivo do HCV; 2) não existem kits de diagnóstico de antígeno; 3) a reação de formação de anticorpos ao HCV é tão lenta que o diagnóstico durante a fase aguda da infecção, via de regra, não pode ser feito.

Portanto, a utilização da tecnologia PCR para diagnóstico, controlo de qualidade do tratamento e análise epidemiológica da morbilidade causada pelo VHC está agora a tornar-se geralmente aceite.

Ao mesmo tempo, apenas a tecnologia PCR permite resolver os seguintes problemas: 1) diagnosticar infecção aguda com detecção tardia de anticorpos contra HCV; 2) realizar diagnóstico etiológico de hepatite C crônica em pacientes imunossuprimidos; 3) avaliar a eficácia da terapia antiviral; 4) detectar viremia em doadores de sangue com níveis normais de aminotransferases; 5) determinar possível contaminação de hemoderivados; 6) avaliar a prevalência do HCV.

9. aplicação da PCR em pneumologia e tisiologia

Uma causa comum de pneumonia atípica e bronquite crônica recorrente são os micoplasmas e a clamídia. O diagnóstico desses patógenos utilizando métodos tradicionais de microscopia e cultura bacteriana é ineficaz. A PCR permite não só diagnosticar clamídia e micoplasmose, mas também identificar espécies do patógeno (C. pneumoniae, C. trachomatis, M. hominis, M. pneumoniae). A utilização do método PCR pode melhorar significativamente o diagnóstico precoce da tuberculose. Atualmente, kits de PCR foram desenvolvidos e surgiram no mercado para determinar a resistência das micobactérias aos antibióticos.

10. Aplicação de PCR na prática de serviços de sangue

O exame do sangue do doador para hepatite, sífilis, HIV por métodos sorológicos não exclui o perigo de utilização de sangue infectado devido à presença de um determinado período soronegativo para essas doenças, que pode durar até várias semanas a partir do momento em que o patógeno aparece no sangue. O método mais eficaz de testar o sangue quanto à presença desses patógenos é o método PCR.

11. aplicação de PCR em neonatologia

Vários microrganismos podem infectar o feto durante a gravidez. São eles citomegalovírus, toxoplasma, vírus do herpes, vírus da rubéola, micoplasma, clamídia, etc. O uso de testes sorológicos para determinar essas infecções em recém-nascidos é ineficaz, pois a formação do sistema imunológico da criança ocorre ao longo de vários meses, e a presença de um agente infeccioso pode não ser acompanhado pela produção de anticorpos específicos. Por outro lado, anticorpos maternos da classe IgG podem estar presentes por muito tempo no sangue do recém-nascido, capazes de penetrar na barreira placentária. Assim, a presença de IgG específica em uma criança nos primeiros meses de vida não indica a presença de um patógeno. O uso da análise PCR aumenta significativamente as possibilidades de diagnóstico de infecções neonatais, inclusive na fase intrauterina.

12. aplicação da PCR na prática uroginecológica

Entre os agentes infecciosos que afetam o trato urogenital, muita atenção tem sido dada recentemente aos agentes causadores de infecções latentes e crônicas - clamídia e micoplasma. As doenças causadas por esses patógenos são caracterizadas por sintomas clínicos turvos e curso crônico, muitas vezes levando a danos às funções reprodutivas - aborto espontâneo, infertilidade. Numerosos estudos que examinaram o uso do método PCR para detecção de Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Ureaplasmaurealiticum, realizados em grandes clínicas em diferentes países, demonstraram a alta eficiência deste método. É reconhecido que em termos de sensibilidade e eficiência, a PCR é superior ao método de cultura, aceito como “padrão ouro”.

CONCLUSÃO

Assim, a tecnologia PCR é uma ferramenta poderosa que permite estudar e diagnosticar processos infecciosos crônicos e a ecologia de patógenos de doenças infecciosas. O método de diagnóstico PCR complementa os métodos de diagnóstico microbiológico já existentes e altera qualitativamente a metodologia de resolução de problemas aplicados de microbiologia médica e epidemiologia.

Tendo em conta o exposto, formularemos áreas de investigação em patologia infecciosa, nas quais a PCR começa a desempenhar um papel de liderança.

Diagnóstico de condições infecciosas crônicas causadas pela persistência de bactérias ou vírus. Esta é a aplicação mais óbvia da PCR para fins diagnósticos.

A PCR é o método mais eficaz para identificar e estudar patógenos que, estando em estado “não cultivado”, conseguem aí persistir, sobrevivendo a condições externas desfavoráveis.

A PCR permite a determinação da resistência aos antibióticos em bactérias de crescimento lento e difíceis de cultivar.

As áreas promissoras para o uso prático do diagnóstico PCR são:

· diagnóstico de doenças oncológicas;

· diagnóstico de leucemia e linfomas;

· diagnóstico de câncer de mama;

· diagnóstico de outras doenças malignas;

O diagnóstico de DNA de neoplasias benignas e malignas é limitado por uma pequena mas crescente quantidade de informações sobre os genes associados a essas doenças;

· diagnóstico de doenças genéticas.

O diagnóstico de doenças genéticas só pode ser desenvolvido após uma extensa investigação científica sobre o genoma humano. No entanto, a comunidade médica já reconheceu a importância de estudar a base genética das doenças, bem como a possibilidade de diagnosticar e tratar uma doença antes do aparecimento dos seus sintomas;

· identificação pessoal: medicina legal, criminologia; transplante de órgãos e tecidos; determinação da paternidade. Especialistas avaliam esta área do mercado de diagnóstico de DNA como uma das maiores e de mais rápido crescimento;

No final do artigo, veja
Reação em cadeia da polimerase (PCR) inventado em 1983 por Kary Mullis (cientista americano). Posteriormente, ele recebeu o Prêmio Nobel por esta invenção. Atualmente, o diagnóstico por PCR é um dos métodos mais precisos e sensíveis para o diagnóstico de doenças infecciosas.
Reação em cadeia da polimerase (PCR)- um método experimental de biologia molecular, um método para aumentar significativamente pequenas concentrações de certos fragmentos de ácido nucleico (DNA) em material biológico (amostra).
O método PCR baseia-se na duplicação repetida de uma determinada seção de DNA por meio de enzimas em condições artificiais (in vitro). Como resultado, são produzidas quantidades de DNA suficientes para detecção visual. Neste caso, apenas é copiada a seção que atende às condições especificadas, e somente se estiver presente na amostra em estudo.
Além de simplesmente aumentar o número de cópias de DNA (esse processo é chamado de amplificação), a PCR permite muitas outras manipulações com material genético (introdução de mutações, splicing de fragmentos de DNA), e é amplamente utilizada na prática biológica e médica, por exemplo , para diagnosticar doenças (hereditárias, infecciosas), para estabelecer paternidade, clonar genes, introduzir mutações e isolar novos genes.

Especificidade e Aplicação

Realizando PCR

Para realizar o PCR no caso mais simples, são necessários os seguintes componentes:

Molde de DNA contendo a seção de DNA que precisa ser amplificada;
dois iniciadores complementares às extremidades do fragmento desejado;
polimerase de DNA termoestável;
trifosfatos de desoxinucleotídeos (A, G, C, T);
Íons Mg2+ necessários para o funcionamento da polimerase;
solução de buffer.

A PCR é realizada em um termociclador - dispositivo que fornece resfriamento e aquecimento periódicos de tubos de ensaio, geralmente com precisão de pelo menos 0,1°C. Para evitar a evaporação da mistura de reação, adicione óleo de alto ponto de ebulição, como vaselina, ao tubo de ensaio. A adição de enzimas específicas pode aumentar o rendimento da reação PCR.
Progresso da reação

Normalmente, a PCR realiza de 20 a 35 ciclos, cada um dos quais consiste em três etapas. O molde de ADN de cadeia dupla é aquecido a 94 - 96°C (ou 98°C se for utilizada uma polimerase particularmente termoestável) durante 0,5 - 2 minutos para separar as cadeias de ADN. Esta fase é chamada de desnaturação - as ligações de hidrogênio entre as duas cadeias são destruídas. Às vezes, antes do primeiro ciclo, a mistura de reação é pré-aquecida durante 2 a 5 minutos para desnaturar completamente a matriz e os primers.
Uma vez separadas as cadeias, a temperatura é reduzida para permitir que os iniciadores se liguem ao modelo de cadeia simples. Esta etapa é chamada de recozimento. A temperatura de recozimento depende dos primers e geralmente é escolhida 4 - 5°C abaixo da temperatura de fusão. O tempo de palco é de 0,5 a 2 minutos.

A DNA polimerase replica a fita modelo usando um primer como primer. Este é o estágio de alongamento. A temperatura de alongamento depende da polimerase. As polimerases comumente usadas são mais ativas a 72°C. O tempo de alongamento depende tanto do tipo de DNA polimerase quanto do comprimento do fragmento amplificado. Normalmente, o tempo de alongamento é considerado um minuto por mil pares de bases. Após a conclusão de todos os ciclos, uma etapa adicional de alongamento final é frequentemente realizada para completar todos os fragmentos de fita simples. Esta etapa dura de 10 a 15 minutos.
Preparar material para pesquisa e transportá-lo para o laboratório

Para uma análise bem-sucedida, é importante coletar corretamente o material do paciente e prepará-lo adequadamente. Sabe-se que no diagnóstico laboratorial a maioria dos erros (até 70%) são cometidos justamente na etapa de preparo da amostra. Para a coleta de sangue no laboratório INVITRO são utilizados atualmente sistemas de vácuo que, por um lado, prejudicam minimamente o paciente e, por outro lado, permitem que o material seja coletado de forma que não entre em contato com tanto para o pessoal quanto para o meio ambiente. Isso evita a contaminação (contaminação) do material e garante a objetividade da análise PCR.

O DNA – ácido desoxirribonucléico – é um polímero biológico, um dos dois tipos de ácidos nucléicos que garantem o armazenamento, a transmissão de geração em geração e a implementação do programa genético para o desenvolvimento e funcionamento dos organismos vivos. O principal papel do DNA nas células é o armazenamento a longo prazo de informações sobre a estrutura do RNA e das proteínas.

O RNA-ácido ribonucleico é um polímero biológico semelhante em sua estrutura química ao DNA. A molécula de RNA é construída a partir das mesmas unidades monoméricas - nucleotídeos - do DNA. Na natureza, o RNA geralmente existe como uma fita simples. Em alguns vírus, o RNA é o portador da informação genética. Na célula, desempenha um papel importante na transferência de informações do DNA para as proteínas. O RNA é sintetizado em um modelo de DNA. Este processo é chamado de transcrição. Existem áreas no DNA que contêm informações responsáveis pela síntese de três tipos de RNA, que se diferenciam nas funções que desempenham: RNA mensageiro ou mensageiro (mRNA), RNA ribossômico (rRNA) e RNA transportador (tRNA). Todos os três tipos de RNA estão envolvidos na síntese de proteínas de uma forma ou de outra. No entanto, a informação sobre a síntese proteica está contida apenas no mRNA.

Os nucleotídeos são a unidade básica de repetição nas moléculas de ácido nucleico, o produto de uma combinação química de uma base nitrogenada, um açúcar de cinco carbonos (pentose) e um ou mais grupos fosfato. Os nucleotídeos presentes nos ácidos nucléicos contêm um grupo fosfato. São nomeados de acordo com a base nitrogenada que contêm - adenina (A), contendo adenina, guanina (G) - guanina, citosina (C) - citosina, timina (T) - timina, uracila (U) - uracila. O DNA contém 4 tipos de nucleotídeos - A, T, G, C, o RNA também contém 4 tipos - A, U, G, C. O açúcar em todos os nucleotídeos do DNA é a desoxirribose, o RNA é a ribose. Quando os ácidos nucleicos são formados, os nucleotídeos se ligam para formar uma estrutura açúcar-fosfato da molécula, em um lado da qual existem bases.

Primer é um DNA curto usado para replicar a fita modelo. Cada um dos primers é complementar a uma das fitas do molde de fita dupla, enquadrando o início e o fim da região amplificada.

Literatura

Glick B., Pasternak J. Biotecnologia molecular. Princípios e Aplicação. Por. do inglês - M.: Mir, 2002. - 589 p., ilus. ISBN5-03-003328-9
Schelkunov S.N. Engenharia genética - Novosibirsk: Sibirsk. Univ. editora, 2004. - 496 pp.; doente. ISBN5-94087-098-8
Patrushev L.I. Sistemas genéticos artificiais - M.: Nauka, 2005 - Em 2 volumes - ISBN 5-02-033278-X

IMPORTANTE!

As informações nesta seção não podem ser usadas para autodiagnóstico e autotratamento. Em caso de dor ou outra exacerbação da doença, os exames diagnósticos devem ser prescritos apenas pelo médico assistente. Para fazer um diagnóstico e prescrever o tratamento corretamente, você deve entrar em contato com seu médico.

No entanto, naquela época, essa ideia não foi reivindicada. A reação em cadeia da polimerase foi redescoberta em 1983 por Kary Mullis. Seu objetivo era criar um método que permitisse amplificar o DNA através de múltiplas duplicações sucessivas da molécula de DNA original usando a enzima DNA polimerase. 7 anos após a publicação desta ideia, em 1993, Mullis recebeu o Prêmio Nobel por ela.

No início da utilização do método, após cada ciclo de aquecimento-resfriamento, a DNA polimerase teve que ser adicionada à mistura reacional, pois ela era rapidamente inativada na alta temperatura necessária para separar as fitas da hélice de DNA. O procedimento foi muito ineficiente e exigiu muito tempo e enzimas. Em 1986 foi significativamente melhorado. Foi proposto o uso de DNA polimerases de bactérias termofílicas. Essas enzimas revelaram-se termoestáveis e capazes de resistir a muitos ciclos de reação. A sua utilização permitiu simplificar e automatizar a PCR. Uma das primeiras DNA polimerases termoestáveis foi isolada de bactérias Termus aquático e nomeado Taq-polimerase. A desvantagem desta polimerase é que a probabilidade de introdução de um nucleotídeo errado é bastante elevada, uma vez que esta enzima não possui mecanismos de correção de erros (atividade de exonuclease 3"→5"). Polimerases Pfu E Uau, isolados de archaea, possuem tal mecanismo; seu uso reduz significativamente o número de mutações no DNA, mas a velocidade de seu trabalho (processabilidade) é menor que a de Taq. Hoje em dia são utilizadas misturas Taq E Pfu para alcançar alta velocidade de polimerização e alta precisão de cópia.

Na época da invenção do método, Mullis trabalhava para a Cetus Corporation, que patenteou o método PCR. Em 1992, a Cetus vendeu os direitos do método e a patente de uso Taq empresa de polimerase Hoffmann-La Roche (en: Hoffmann-La Roche) por US$ 300 milhões. No entanto, descobriu-se que Taq A -polimerase foi caracterizada pelo bioquímico russo Alexei Kaledin em 1980, e a Promega tentou forçar a Roche a abrir mão dos direitos exclusivos desta enzima. A patente dos EUA para o método PCR expirou em março de 2005.

Realizando PCR

O método é baseado na cópia seletiva repetida de uma determinada seção de DNA usando enzimas sob condições artificiais ( em vitro). Neste caso, apenas é copiada a seção que atende às condições especificadas, e somente se estiver presente na amostra em estudo. Ao contrário da amplificação do DNA em organismos vivos (replicação), seções relativamente curtas de DNA são amplificadas por PCR. Num processo de PCR convencional, o comprimento das secções de ADN copiadas não é superior a 3000 pares de bases (3 kpb). Utilizando uma mistura de várias polimerases, utilizando aditivos e sob certas condições, o comprimento de um fragmento de PCR pode atingir 20-40 mil pares de nucleotídeos. Isto ainda é significativamente menor que o comprimento do DNA cromossômico de uma célula eucariótica. Por exemplo, o genoma humano consiste em aproximadamente 3 bilhões de pares de bases.

Componentes de reação

Para realizar o PCR no caso mais simples, são necessários os seguintes componentes:

Matriz de DNA, contendo a seção de DNA que precisa ser amplificada.
Duas cartilhas, complementares às extremidades opostas de diferentes fitas do fragmento de DNA desejado.
Termicamente estável DNA polimerase- uma enzima que catalisa a reação de polimerização do DNA. A polimerase para uso em PCR deve permanecer ativa em altas temperaturas por muito tempo, por isso são utilizadas enzimas isoladas de termófilos - Termus aquático(Taq polimerase), Pyrococcus furioso(polimerase Pfu), Pyrococcus woesei(Pwo polimerase) e outros.
Trifosfatos de desoxinucleosídeos(dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Íons Mg 2+ necessários para o funcionamento da polimerase.
Solução de buffer, fornecendo as condições de reação necessárias - pH, força iônica da solução. Contém sais, albumina sérica bovina.

Para evitar a evaporação da mistura de reação, adicione óleo de alto ponto de ebulição, como vaselina, ao tubo de ensaio. Se você estiver usando um termociclador com tampa aquecida, isso não será necessário.

A adição de pirofosfatase pode aumentar o rendimento da reação de PCR. Esta enzima catalisa a hidrólise do pirofosfato, um subproduto da adição de trifosfatos de nucleotídeos à cadeia de DNA em crescimento, ao ortofosfato. O pirofosfato pode inibir a reação de PCR.

Primers

A especificidade da PCR baseia-se na formação de complexos complementares entre o molde e os iniciadores, oligonucleótidos sintéticos curtos com 18-30 bases de comprimento. Cada primer é complementar a uma das fitas do molde de fita dupla e limita o início e o fim da região amplificada.

Após a hibridização do molde com o primer (recozimento), este último serve como primer para a DNA polimerase durante a síntese da fita molde complementar (ver).

A característica mais importante dos primers é a temperatura de fusão (Tm) do complexo primer-matriz. Tm é a temperatura à qual metade dos moldes de ADN formam um complexo com o iniciador oligonucleotídico. A temperatura de fusão pode ser determinada aproximadamente pela fórmula , onde n X é o número de nucleotídeos X no primer. Se o comprimento e a composição de nucleotídeos do primer ou a temperatura de recozimento forem selecionados incorretamente, é possível a formação de complexos parcialmente complementares com outras regiões do DNA molde, o que pode levar ao aparecimento de produtos inespecíficos. O limite superior da temperatura de fusão é limitado pela temperatura óptima de acção da polimerase, cuja actividade diminui a temperaturas superiores a 80°C.

Ao escolher os primers, é aconselhável seguir os seguintes critérios:

Amplificador

Arroz. 1: Ciclador para PCR

A PCR é realizada em um termociclador - dispositivo que fornece resfriamento e aquecimento periódicos de tubos de ensaio, geralmente com precisão de pelo menos 0,1 °C. Os cicladores modernos permitem definir programas complexos, incluindo a capacidade de “inicialização a quente”, Touchdown PCR (veja abaixo) e armazenamento subsequente de moléculas amplificadas a 4 °C. Para PCR em tempo real, são produzidos dispositivos equipados com detector fluorescente. Existem também dispositivos com tampa automática e compartimento para microplacas, o que permite sua integração em sistemas automatizados.

Progresso da reação

Fotografia de um gel contendo DNA marcador (1) e produtos de reação PCR (2,3). Os números mostram o comprimento dos fragmentos de DNA em pares de nucleotídeos

Normalmente, a PCR envolve 20-35 ciclos, cada um dos quais consiste em três estágios (Fig. 2).

Desnaturação

O molde de ADN de cadeia dupla é aquecido a 94-96°C (ou a 98°C se for utilizada uma polimerase particularmente termoestável) durante 0,5-2 minutos para separar as cadeias de ADN. Esta etapa é chamada desnaturação, uma vez que as ligações de hidrogênio entre as duas fitas de DNA são destruídas. Às vezes, antes do primeiro ciclo (antes da adição da polimerase), a mistura reacional é pré-aquecida durante 2-5 minutos. para desnaturação completa do modelo e dos primers. Essa técnica é chamada início quente, permite reduzir a quantidade de produtos de reação inespecíficos.

anelamento

Uma vez separadas as cadeias, a temperatura é reduzida para permitir que os iniciadores se liguem ao modelo de cadeia simples. Esta etapa é chamada anelamento. A temperatura de recozimento depende da composição dos primers e é normalmente selecionada 4-5°C abaixo da sua temperatura de fusão. Tempo de palco - 0,5-2 minutos. Uma escolha incorreta da temperatura de recozimento leva a uma má ligação dos primers ao molde (a uma temperatura muito alta) ou à ligação no local errado e ao aparecimento de produtos inespecíficos (a uma temperatura muito baixa).

Alongamento

Tipos de PCR

PCR “nested” (Nested PCR) é usado para reduzir o número de subprodutos da reação. Dois pares de primers são usados e duas reações sequenciais são realizadas. O segundo par de iniciadores amplifica uma região de DNA dentro do produto da primeira reação.
PCR “invertida” (PCR inversa) - é usada se apenas uma pequena região dentro da sequência desejada for conhecida. Este método é particularmente útil quando se trata de determinar sequências vizinhas após a inserção do DNA no genoma. Para a realização da PCR invertida são realizados uma série de cortes de DNA com enzimas de restrição, seguidos de união dos fragmentos (ligação). Como resultado, os fragmentos conhecidos acabam em ambas as extremidades da região desconhecida, após o que a PCR pode ser realizada normalmente.
PCR de transcrição reversa (RT-PCR) é usado para amplificar, isolar ou identificar uma sequência conhecida de uma biblioteca de RNA. Antes da PCR convencional, uma molécula de DNA de fita simples é sintetizada em um molde de mRNA usando reversease e é obtido um cDNA de fita simples, que é usado como molde para PCR. Este método geralmente determina onde e quando esses genes são expressos.
PCR assimétrica PCR assimétrica) - é realizada quando é necessário amplificar predominantemente uma das fitas do DNA original. Usado em algumas técnicas de sequenciamento e análise de hibridização. A PCR é realizada normalmente, exceto que um dos iniciadores é tomado em grande excesso.
A PCR quantitativa (Q-PCR) é usada para medir rapidamente a quantidade de DNA, cDNA ou RNA específico em uma amostra.
PCR quantitativo em tempo real - este método utiliza reagentes marcados com fluorescência para medir com precisão a quantidade de produto de reação à medida que ele se acumula.
Touchdown (Stepdown) PCR (Touchdown PCR) - usando este método, o efeito da ligação inespecífica de primers na formação do produto é reduzido. Os primeiros ciclos são realizados a uma temperatura acima da temperatura de recozimento, depois a temperatura é reduzida a cada poucos ciclos. A uma determinada temperatura, o sistema passará através da banda de especificidade ideal do iniciador para o DNA.
Método de colônia molecular (PCR em gel, inglês. Polonia - Colônia PCR) - o gel de acrilamida é polimerizado com todos os componentes da PCR na superfície e a PCR é realizada. Nos pontos que contêm o DNA analisado, ocorre a amplificação com formação de colônias moleculares.
PCR com amplificação rápida de cDNA termina Amplificação rápida de extremidades de cDNA, RACE-PCR )
PCR de fragmento longo PCR de longo alcance) - uma modificação da PCR para amplificação de seções estendidas de DNA (10 mil bases ou mais). São utilizadas duas polimerases, uma das quais é a Taq polimerase com alta processabilidade (isto é, capaz de sintetizar uma longa cadeia de DNA em uma passagem), e a segunda é a DNA polimerase com atividade de endonuclease de 3"-5". A segunda polimerase é necessária para corrigir os erros introduzidos pela primeira.
PCR RAPD Amplificação Aleatória de PCR de DNA Polimórfico , PCR com amplificação aleatória de DNA polimórfico - é utilizado quando é necessário distinguir entre organismos com sequência genética próxima, por exemplo, diferentes variedades de plantas cultivadas, raças de cães ou microrganismos intimamente relacionados. Este método geralmente usa um pequeno primer (20 - 25 pb). Este primer será parcialmente complementar a seções aleatórias do DNA dos organismos em estudo. Ao selecionar as condições (comprimento do primer, sua composição, temperatura, etc.), é possível obter uma diferença satisfatória no padrão de PCR para dois organismos.

Se a sequência de nucleotídeos do modelo for parcialmente conhecida ou desconhecida, você poderá usar iniciadores degenerados, cuja sequência contém posições degeneradas nas quais quaisquer bases podem ser localizadas. Por exemplo, a sequência iniciadora poderia ser: ...ATH..., onde H é A, T ou C.

Aplicação de PCR

A PCR é usada em muitas áreas para testes e experimentos científicos.

forense

A PCR é usada para comparar as chamadas “impressões digitais genéticas”. É necessária uma amostra de material genético da cena do crime - sangue, saliva, sêmen, cabelo, etc. Uma quantidade muito pequena de DNA é suficiente, teoricamente uma cópia. O DNA é dividido em fragmentos e depois amplificado por PCR. Os fragmentos são separados por eletroforese de DNA. A imagem resultante do arranjo das bandas de DNA é chamada impressão digital genética(Inglês) impressão digital genética).

Estabelecendo paternidade

Arroz. 3: Resultados da eletroforese de fragmentos de DNA amplificados por PCR. (1) Pai. (2) Criança. (3) Mãe. A criança herdou algumas características da impressão genética de ambos os pais, resultando em uma impressão nova e única.

Embora as impressões digitais genéticas sejam únicas (exceto no caso de gêmeos idênticos), as relações familiares ainda podem ser estabelecidas através da criação de várias impressões digitais (Figura 3). O mesmo método pode ser aplicado, ligeiramente modificado, para estabelecer a relação evolutiva entre os organismos.

Diagnóstico médico

Medicina personalizada

Sabe-se que a maioria dos medicamentos não atua em todos os pacientes a que se destinam, mas apenas em 30-70% deles. Além disso, muitos medicamentos revelam-se tóxicos ou alergênicos para alguns pacientes. As razões para isto devem-se em parte às diferenças individuais na susceptibilidade e no metabolismo dos medicamentos e seus derivados. Essas diferenças são determinadas no nível genético. Por exemplo, num paciente um certo citocromo (uma proteína do fígado responsável pelo metabolismo de substâncias estranhas) pode ser mais activo, noutro - menos. Para determinar que tipo de citocromo um determinado paciente possui, propõe-se a realização de uma análise PCR antes do uso do medicamento. Esta análise é chamada de genotipagem preliminar. genotipagem prospectiva).

Clonagem genética

A clonagem de genes (não confundir com clonagem de organismos) é o processo de isolamento de genes e, a partir de manipulações de engenharia genética, obtenção de grande quantidade do produto de um determinado gene. PCR é usado para amplificar um gene, que é então inserido em vetor- um fragmento de DNA que transfere um gene estranho para o mesmo ou outro organismo conveniente para cultivo. Por exemplo, plasmídeos ou DNA viral são usados como vetores. A inserção de genes em um organismo estranho é geralmente usada para produzir o produto desse gene – RNA ou, mais frequentemente, uma proteína. Desta forma, muitas proteínas são obtidas em quantidades industriais para utilização na agricultura, medicina, etc.

Arroz. 4: Clonagem de genes usando um plasmídeo. .
(1) DNA cromossômico do organismo A. (2) PCR. (3) Muitas cópias do gene do organismo A. (4) Inserção do gene em um plasmídeo. (5) Plasmídeo com o gene do organismo A. (6) Introdução do plasmídeo no organismo B. (7) Multiplicação do número de cópias do gene do organismo A no organismo B.

Sequenciamento de DNA

Mutagênese

Atualmente, a PCR tornou-se o principal método de mutagênese. A utilização da PCR permitiu simplificar e agilizar o procedimento de mutagênese, além de torná-lo mais confiável e reprodutível.