A invenção refere-se ao campo da biotecnologia, em particular a um método para entrega direcionada de DNA em células tumorais e tronco que expressam o receptor CXCR4. A invenção apresentada pode ser usada para entrega direcionada de construções genéticas em células-tronco e tumorais malignos com a finalidade de corrigir defeitos genéticos e prevenir doenças. O método envolve a preparação de transportadores de construções genéticas incluindo na composição das moléculas transportadoras, que é uma sequência de ligação ao DNA de oito resíduos de aminoácidos de lisina - KKKKKKKK, sequências de sinal. A ligação da sequência sinal à sequência de ligação ao DNA é realizada utilizando uma região ligante de duas moléculas de ácido ε-aminohexanóico. Complexos DNA/transportador são então formados. A transfecção é então realizada in vitro. A invenção proposta permite aumentar a eficiência de entrega do gene de interesse às células tumorais e estaminais. 2 salário voar, 4 doentes.

A invenção refere-se à medicina genética, terapia de genes, biotecnologia e produtos farmacêuticos e pode ser usado para entrega direcionada de construções genéticas em células-tronco e tumorais malignos com a finalidade de corrigir defeitos genéticos e prevenir doenças. A especificidade tecidual de entrega de construções genéticas é garantida através do uso de sequências de sinal para o receptor CXCR4, que é expresso em células deste tipo.

Terapia gênica a partir de abordagens Medicina tradicional Distingue-se pelo foco no combate à causa da doença, e não aos sintomas e consequências. Abordagens de terapia genética para tratamento ou prevenção estão atualmente sendo desenvolvidas ampla variedade doenças humanas. Estas abordagens podem ser aplicáveis ​​para terapia in vivo e ex vivo. A terapia in vivo baseia-se na introdução direta de construções genéticas diretamente nos tecidos do corpo. A administração pode ser intravenosa usando nebulizadores de aerossol ou injeções em tecidos específicos. A terapia genética ex vivo baseia-se no isolamento de um tipo específico de células do corpo, na introdução de uma construção genética “terapêutica” nelas, na seleção de células transfectadas e subsequente reimplantação no paciente.

Existem três direções principais nas abordagens para a entrega de construções genéticas atualmente em desenvolvimento:

1) clonagem como parte de vetores virais;

2) usar métodos físicos transfecções;

3) utilização de complexos de vetores de expressão plasmidiais e moléculas transportadoras não virais.

A transferência mediada por vírus é um método altamente eficiente de entrega de DNA às células-alvo, uma vez que a penetração do vetor viral modificado é semelhante ao processo que ocorre em condições naturais quando o genoma viral é transferido para as células hospedeiras. Os mais estudados são os vetores criados com base em vírus retro, adeno e adeno-associados. As vantagens dos vírus incluem, em primeiro lugar, a combinação das propriedades de um vetor de expressão e de um transportador, a possibilidade de entrega específica, a capacidade de transfectar células em divisão e não em divisão e a capacidade de integrar DNA no cromossomo para garantir expressão a longo prazo. Devido a estas vantagens, esta abordagem ainda é amplamente utilizada na investigação de entrega de genes, embora tenha algumas desvantagens. Os vírus retro e adeno-associados têm um tamanho limitado do fragmento de DNA clonado e o risco de mutagênese insercional quando o vírus é integrado ao genoma do hospedeiro. Uma séria desvantagem dos vetores adenovirais é a resposta imune pronunciada em altas doses e administrações repetidas construções adenovirais (Walther W., Stein U. Viral vectors for gene transfer: uma revisão de seu uso no tratamento de doenças humanas // Drugs. - 2000. - v.60. - P.249-271, patente RF No. 2252255, C12N 15/37, C12N 15/86, C12N 15/861, C12N 15/867, publicado em 20.05.2005).

A injeção de construções de DNA plasmídico nu foi uma das primeiras abordagens no desenvolvimento de estratégias de tratamento de terapia genética. A baixa eficiência da transfecção utilizando DNA nu levou ao desenvolvimento de novos métodos para entrega de construções genéticas. Vários métodos físicos entrega de DNA às células do corpo. Os mais populares entre eles são o método de transfecção balística e a eletroporação, amplamente utilizados para transfectar células da pele e musculares. O método de transfecção balística baseia-se na penetração na célula de DNA depositado em micropartículas de ouro ou tungstênio. A transfecção ocorre sob a pressão de uma corrente de gás ou líquido comprimido. O método de eletroporação é baseado em uma mudança local no potencial elétrico da membrana celular devido à exposição à corrente elétrica. Impulsos elétricos levam à formação de poros em membrana celular, tornando-o assim permeável a biomoléculas. Para superar a baixa eficiência da transfecção de DNA nu in vivo, também é utilizado o método do choque hidrodinâmico - administração intravenosa ou intra-arterial de um vetor plasmídico em uma solução de grande volume. As principais desvantagens dos métodos de transfecção física existentes são a baixa eficiência e a localização do efeito da entrega do DNA. Eles permitem que o plasmídeo supere a membrana celular e evite a inclusão nos endossomos, evitando assim a degradação enzimática, mas, via de regra, não garantem a persistência a longo prazo das construções genéticas introduzidas (Wells D.J. Progresso e perspectivas da terapia genética: eletroporação e outros métodos físicos // Gene Ther. - 2004. - v.11, No. 18. - P.1363-1369;Wang S., Joshi S, Lu S. Entrega de DNA à pele por bombardeio de partículas // Métodos Mol Biol. - 2004. - v.245. - P.185-196; Herweijer H., Wolff J.A. Progresso e perspectivas: transferência de genes de DNA nu e terapia // Terapia genética. - 2003. - v.10, No. 6. - P .453-458).

Os transportadores não virais são uma alternativa à transferência de construções genéticas mediada por vírus para células de mamíferos. Os transportadores não virais são facilmente sintetizados e a facilidade de sua modificação permite que alterações sejam feitas na estrutura e na composição das moléculas, melhorando assim os veículos de entrega. Ao utilizar transportadores não virais, não há restrições quanto ao tamanho do vetor de expressão entregue. Além disso, são menos tóxicos, na maioria dos casos não causam resposta imune específica e são mais seguros para uso in vivo em comparação com vetores virais. Portanto, a introdução de uma construção genética embalada em transportadores não virais pode ser repetida. O estudo de transportadores não virais está se desenvolvendo no sentido de melhorar as propriedades de transfecção do DNA plasmídico, formando complexos de DNA com vários compostos sintéticos (lipídios, oligo e polipeptídeos, polímeros, etc.) (por exemplo, patente RF nº 2336090 , A61K 39/00, A61K 47/00, publicação 2008.10.20). A melhoria dos veículos de entrega não virais depende em grande parte de uma compreensão detalhada das barreiras à penetração do DNA nas células do corpo (Schmidt-Wolf G.D., Schmidt-Wolf I.G. Non-viral and hybrid vectors in human gene therapy: an atualização // Trends Mol Med. - 2003. - v.9, No. 2. - P.67-72; Gardlic R, Palffy R, Hodosy J., Turna J., Celec P. Vetores e sistemas de entrega em terapia genética // Med Sci Monit. - 2005. - v .11, No. 4. - P.110-121; Wiethoff C.M., Middaugh C.R. 2. - P.203-217).

Acredita-se que um portador não viral deva ter as seguintes características:

1) ser atóxico, compacto e proteger o DNA plasmídico da degradação enzimática, sendo excretado do corpo após o uso;

2) garantir a penetração do plasmídeo na célula por ligação específica à membrana plasmática da célula:

3) possuem a capacidade de liberar DNA do compartimento endossomal;

garantir a dissociação do DNA do complexo para posterior transporte do plasmídeo para o núcleo.

Para efeitos de terapia genética, o método mais preferido de distribuição de construções genéticas é a sua transferência específica de tecido para células e tecidos do corpo.

A primeira barreira à penetração intracelular dos complexos é a membrana plasmática. A maioria dos complexos interage com a superfície celular usando forças eletrostáticas. Um possível mecanismo de ligação dos complexos à célula é a sua interação com proteínas da superfície celular - glicosaminoglicanos. No entanto, quando este mecanismo penetração de complexos, não há transferência de construções genéticas específicas para tecidos. Ao mesmo tempo, o problema da entrega de construções genéticas específicas para tecidos é relevante para a terapia genética de uma série de doenças. Para interação específica com a superfície celular, os complexos incluem ligantes para receptores na superfície celular. Vários ligantes peptídicos de integrina foram agora caracterizados. Estes incluem, em particular, o fragmento tripeptídico RGD (integrinas estão presentes na superfície de muitas células), transferrina (seu receptor tem expressão aumentada em células em proliferação), asialorosomucóide (o receptor de asialoglicoproteína tem expressão específica em hepatócitos do fígado).

Para entrega específica de material genético a células nervosas Zeng e colegas propuseram o uso de um transportador que consiste em uma região de sinal para o receptor TrkA (80-108 aminoácidos do fator de crescimento nervoso) e uma sequência de ligação ao DNA de 10 resíduos de aminoácidos lisina. Este carreador, na presença do agente endossomolítico cloroquina, que promove a liberação de complexos do compartimento endossomal da célula, foi capaz de entregar especificamente o gene marcador ao tecido apenas para células com expressão do receptor TrkA. Este transportador pode ser usado para tratamento de terapia genética de vários doenças neurológicas, como epilepsia, doenças de Parkinson e Alzheimer. No entanto, não é adequado para entregar material genético a outros tipos de células (Zeng J, Too HP, Ma Y, Luo E, Wang S Um peptídeo sintético contendo alça 4 do fator de crescimento nervoso para entrega de genes direcionados // J Gene Med 2004; 6: 1247-1256).

Células-tronco humanas são consideradas agentes promissores para terapia celular e genética várias doenças pessoa. Ao mesmo tempo, são um dos tipos de células mais difíceis de transfectar. Durante o tratamento de terapia genética doenças cancerígenasé necessário garantir a entrega de genes diretamente às células tumorais.

CXCR4 é um receptor para a quimiocina SDF-1α do fator de migração de células-tronco. O CXCR4 é expresso em células hematopoiéticas, endotélio vascular e células satélites musculares. Um alto nível de expressão deste gene foi observado em mais de 20 tipos de tumores cancerígenos (câncer de mama, câncer de próstata, etc.), bem como em células-tronco em migração. O receptor CXCR4 também é capaz de se ligar à quimiocina viral vMIP-II (vírus do sarcoma de Kaposi). Assim, a inclusão de sequências sinal em moléculas transportadoras para ligação ao receptor CXCR4 é uma forma promissora de criar sistemas para entrega de genes direcionados a células tumorais e estaminais.

Para entregar material genético às células que expressam o receptor CXCR4, Le Bon e colegas usaram um ligante sintético para esse receptor - AMD3100, que foi combinado com polietilenimina ou lipídios catiônicos. Complexos de material genético com estes compostos não levaram a um aumento significativo na eficiência da entrega de genes marcadores em células CXCR4+ em comparação com compostos sem sinais. Os transportadores utilizados por Le Bon não foram eficazes porque a entrega específica com a ajuda deles só é possível com a adição de uma substância que promove a internalização do receptor CXCR4 (éster de forbol) ao meio de transfecção. (Le Bon B, Van Craynest N, Daoudi JM, Di Giorgio C, Domb AJ, Vierling P. Conjugados AMD3100 como componentes de sistemas de entrega de genes não virais direcionados: síntese e eficiência de transfecção in vitro de células que expressam CXCR4. // Bioconjugate Chem 2004 , 15: 413-423).

Assim, existe a necessidade de criar um transportador de construções genéticas que possa fornecer entrega específica às células CXCR4(+) e não afetar os tecidos próximos. Um tal método é fornecido pela presente invenção.

A invenção baseia-se na tarefa de desenvolver um método para entrega específica de construções genéticas em células que expressam o receptor CXCR4, no qual, através da utilização de transportadores de construções genéticas contendo sequências sinal para o receptor CXCR4, é obtido um aumento na eficiência de a entrega do gene de interesse é alcançada. É importante notar que a síntese dos transportadores reivindicados pode ser realizada utilizando qualquer um dos métodos conhecidos de síntese de péptidos em fase sólida.

A solução para o problema técnico declarado é garantida pelo fato de que no método de entrega direcionada de DNA em células tumorais e tronco que expressam o receptor CXCR4, incluindo a preparação de transportadores de construções genéticas, incluindo na composição das moléculas transportadoras, que é uma sequência de ligação ao DNA de oito resíduos de aminoácidos de lisina - KKKKKKKK, sequências sinal, formação de complexos DNA/transportador, transfecção in vitro, a sequência sinal é selecionada do grupo: fragmento de 1 a 8 aminoácidos do N-terminal sequência da proteína SDF-1α - KPVSLSYR; fragmento de 1 a 17 aminoácidos da sequência N-terminal da proteína SDF-1α - KPVSLSYRCPCRFFESH, onde os aminoácidos 9 e 11 são substituídos por serina; ou um fragmento de 1 a 10 aminoácidos da sequência N-terminal da quimiocina viral vMIP-II - LGASWHRPDK; A ligação da sequência sinal à sequência de ligação ao DNA é realizada utilizando uma região ligante de duas moléculas de ácido ε-aminohexanóico.

Neste caso, a sequência sinal pode ser um fragmento dos aminoácidos 1 a 8 da sequência N-terminal da proteína SDF-1α-KPVSLSYR.

Ou a sequência sinal pode ser um fragmento dos aminoácidos 1 a 17 da sequência N-terminal da proteína SDF-1α - KPVLSSYRCPCRFFESH, onde os aminoácidos 9 e 11 são substituídos por serina.

Um fragmento dos aminoácidos 1 a 10 da sequência N-terminal da quimiocina viral vMIP-II - LGASWHRPDK, sintetizada a partir de D-aminoácidos, também pode ser utilizado como região sinal.

Glicerol ou cloroquina podem ser utilizados como componente que garante a saída de complexos constituídos por transportadores e material genético dos endossomos.

O DNA plasmidial pode ser usado como material genético para transportadores.

O resultado técnico especificado na presente invenção é alcançado através da utilização de moléculas de oligolisina - KKKKKKKK (K8) como transportador, conjugadas com sequências sinal para o receptor CXCR4 das proteínas SDF-1 ou vMIP-II, nomeadamente a sequência N-terminal da quimiocina SDF-1 (c 1 a 8 aa) ou a sequência N-terminal da quimiocina SDF-1 (de 1 a 17 aa, com substituição de 9 e 11 aa por serina) ou a sequência N-terminal do quimiocina viral vMIP-II (de 1 a 10 aa na conformação D). A presença de oligolisina KKKKKKKK na composição transportadora permite que os conjugados formem complexos com ácidos nucleicos, em particular com ADN plasmídico, devido à interacção electrostática.

O resultado técnico especificado é alcançado por três variantes da transportadora reivindicada.

O resultado técnico especificado de acordo com a primeira opção é alcançado pelo fato de que na operadora CDP curta baseada em análogos sintéticos quimiocina SDF-1, incluindo um componente catiônico, que é uma oligolisina K8, usada para condensação de DNA plasmídico, e um componente ligante para interação com o receptor CXCR4, de acordo com a invenção reivindicada, um fragmento (1-8 aa) de a sequência N-terminal é usada como componente ligante da proteína SDF-1, que possui a estrutura KPVSLSYR e possui atividade de agonistas do receptor CXCR4, e o componente catiônico do conjugado possui a estrutura KKKKKKKK e está ligado ao componente ligante através de um espaçador - duas moléculas de ácido ε-aminohexanóico (Ahx).

O resultado técnico especificado na segunda variante é alcançado pelo fato de que em um carreador (CDP longo) baseado em análogos sintéticos da quimiocina SDF-1, inclui um componente catiônico, que é a oligolisina K8, usada para condensação do DNA plasmidial, e um componente ligante para interação com o receptor CXCR4, de acordo com a invenção reivindicada, um fragmento (1-17 aa; aa9 e aa11 são substituídos por serina) da sequência N-terminal da proteína SDF-1, que tem o estrutura KPVSLSYRSPSRFFESH e tem atividade de agonistas do receptor CXCR4, é utilizado como componente ligante, e o componente catiônico do conjugado tem a estrutura KKKKKKKK e ligado ao componente ligante através de um espaçador - duas moléculas de ácido ε-aminohexanóico.

O resultado técnico especificado na terceira modalidade é alcançado pelo fato de que em um carreador (CDP viral) baseado em análogos sintéticos da proteína vMIP-II do vírus do sarcoma de Kaposi, incluindo um componente catiônico, que é uma oligolisina K8, usada para condensação de DNA plasmidial, e um componente ligante para interação com o receptor CXCR4, de acordo com a invenção reivindicada, um fragmento (1-10 Daa - sintetizado a partir de D-aminoácidos) da sequência N-terminal da proteína vMIP-II, possuindo a estrutura LGASWHRPDK e tendo atividade de antagonistas do receptor CXCR4, é usada como componente ligante, e o componente catiônico do conjugado tem a estrutura KKKKKKKK e está ligado ao componente ligante através de um espaçador - duas moléculas de ácido ε-aminohexanóico .

Todas as três variantes do transportador reivindicado podem ser sintetizadas usando métodos conhecidos de síntese de peptídeos, por exemplo, o método Boc em fase sólida (Merrifield, R.B. Solid phase peptídeo síntese. I. A síntese de um tetrapeptídeo // Journal of the American Chemical Society 1963. V.85 (14), pp.2149-2154).

Exemplos de implementação específica

A invenção é ilustrada com a ajuda da Fig. 1, que mostra a alteração na intensidade de fluorescência do brometo de etídio com o aumento das proporções de carga transportadora/DNA em complexos CDP/DNA curtos, CDP/DNA longos e CDP/DNA viral. Uma diminuição na intensidade da fluorescência indica um aumento na densidade dos complexos formados. As curvas de fluorescência atingindo um patamar indicam que os complexos atingiram uma densidade suficiente para extinguir a fluorescência do brometo de etídio.

A Figura 2 mostra a dependência da atividade da luciferase em células HeLa (CXCR4+) após transfecção com CDP/DNA curto, CDP/DNA longo e complexos CDP/DNA virais na presença do agente endossomolítico glicerol. Neste caso, foram utilizados complexos formados nas seguintes razões portador/carga de DNA: 3/1, 6/1, 9/1, 12/1. Os controles experimentais foram uma molécula intacta, DNA, complexos PEI/DNA 1/8 (um controle experimental positivo foi o carreador comercial polietilenoimina ramificada 25 kDa - PEI) e complexos contendo DNA e um peptídeo controle (CP). A CP difere dos transportadores da presente invenção na ausência de um sinal de ligação ao receptor CXCR4 e é estruturalmente uma oligolisina KKKKKKKK. A eficiência de entrega do gene marcador por portadores de CDP curta, CDP longa e CDP viral foi 10-100 vezes maior do que pelo controle CP.

A Figura 3 mostra a dependência da atividade da luciferase em células A172 (CXCR4+) após transfecção com CDP/DNA curto, CDP/DNA longo e complexos CDP/DNA virais na presença do agente endossomolítico glicerol. Aqui usamos complexos formados nas seguintes proporções de carga transportadora/DNA: 9/1, 12/1. Uma molécula de DNA intacta, complexos PEI/DNA 1/8 e complexos contendo DNA e peptídeo CP serviram como controles experimentais. A eficiência de entrega do gene marcador por portadores de CDP curta, CDP longa e CDP viral foi 10 vezes maior do que pelo controle CP.

Os resultados na Figura 2 e na Figura 3 apoiam a especificidade dos transportadores da presente invenção para o receptor CXCR4.

A Figura 4 mostra a dependência da atividade da luciferase em células CHO (CXCR4-) após transfecção com CDP/DNA curto, CDP/DNA longo e complexos CDP/DNA virais na presença do agente endossomolítico glicerol. Foram utilizados complexos formados nas seguintes razões portador/carga de DNA: 9/1, 12/1. Uma molécula de DNA intacta, complexos PEI/DNA 1/8 e complexos contendo DNA e peptídeo CP serviram como controles experimentais. A eficiência da entrega do gene marcador por portadores de CDP curto, CDP longo e CDP viral foi quase a mesma que usando o controle CP.

Os portadores com sinal não são capazes de fornecer um nível significativamente mais elevado de entrega de material genético em células sem expressão de receptor em comparação com o controle.

A implementação da invenção pode ser explicada como se segue. O objetivo da presente invenção é fornecer entrega direcionada de construções genéticas em células que expressam o receptor CXCR4 utilizando transportadores de material genético contendo sequências de sinal para este receptor.

Na primeira etapa, é realizada a formação de complexos de uma das modalidades do transportador com uma construção genética contendo o gene de “interesse”. Os complexos formados são usados ​​para entregar material genético às células alvo apropriadas. A análise da eficiência de penetração celular é avaliada utilizando métodos enzimáticos ou imuno-histoquímicos.

A formação de complexos é realizada em solução isotônica. O manitol tamponado com Hepes (manitol tamponado com Hepes) é o preferido. O tamanho dos complexos resultantes é 170-230 nm.

O DNA plasmídico é utilizado como construções genéticas em uma modalidade.

O DNA plasmidial contém um marcador (luc, lacZ) ou gene terapêutico (dependendo da doença), sob o controle de promotores e intensificadores apropriados (CMV, SV40, etc.) e outros elementos necessários, por exemplo, para replicação na célula hospedeira ou integração no genoma. No tratamento de terapia gênica do câncer, podem ser utilizados os genes HLA-B7, IL-2, IL-4, TNF, IFN, P53, timidina quinase, etc.

Numa outra modalidade, oligonucleotídeos que consistem em DNA ou RNA pequeno, complementares a uma sequência específica no mRNA ou no seu precursor, são usados ​​como uma construção genética para suprimir a síntese. produto proteico ou ejeção de um éxon carregando uma mutação do mRNA. Os complexos formados são usados ​​para entregar material genético em células que expressam o receptor CXCR4. A entrada dos complexos transportadores da presente invenção ocorre predominantemente através do transporte mediado pelo receptor através da ligação aos domínios extracelulares do receptor CXCR4 e subsequente internalização do receptor.

A dose de transportadores e material genético é determinada individualmente e depende do tipo de células, da quantidade de receptor CXCR4 em sua superfície e da complexidade da transfecção dessas células.

Para aumentar a eficiência destes transportadores, a transfecção celular é preferencialmente realizada utilizando um agente endossomolítico. Estes incluem glicerol, cloroquina, etc. Estas substâncias são adicionadas ao meio de transfecção imediatamente antes da adição dos complexos às células. Eles permanecem não associados aos complexos e, portanto, não afetam a sua estrutura.

Peptídeos, outros compostos poliméricos e lipossomas que são capazes de compactação podem ser usados ​​como parte de ligação ao DNA do transportador. ácidos nucleicos. Além disso, podem ter propriedades endossomolíticas (não há necessidade de utilização de agente endossomolítico adicional) e, quando necessário (por exemplo, para entrega de genes terapêuticos ou marcadores), entregar material genético ao núcleo.

Ao selecionar as condições de transfecção, elas são criadas para garantir a maior eficiência de entrega. É preferível incubar os complexos com células durante 4 horas. Porém, você pode variar esse tempo de 3 a 6 horas. Após o tempo de incubação, o meio é trocado e as células são deixadas por 24-48 horas (dependendo do tipo celular e do material genético) para expressão das construções introduzidas com o gene de interesse ou manifestação efeito terapêutico oligonucleotídeos.

A análise da eficiência de entrega é realizada por métodos enzimáticos ou imuno-histoquímicos, dependendo do tipo de construção genética introduzida.

Exemplo 1. Formação de complexos DNA/transportador e estudo do processo de formação do complexo.

O plasmídeo pCLUC4, contendo o gene da luciferase do pirilampo sob o controle do promotor do citomegalovírus, foi utilizado como material genético para entrega direcionada de genes nas células. Foi utilizada uma modalidade do transportador.

Soluções de 1 μg de DNA em 40 μl de tampão 1X HBM (5% p / v manitol, 5 mM Hepes, pH 7,5) e soluções transportadoras correspondentes a diferentes proporções de carga de DNA / transportador foram preparadas em um volume igual de tampão. A solução carreadora foi gradualmente adicionada ao tubo Eppendorf contendo a solução de DNA e misturada vigorosamente por 20 segundos. A mistura resultante foi deixada em temperatura ambiente por 30 minutos para completar o processo de formação do complexo.

Os resultados da complexação são analisados ​​pelo método de deslocamento do brometo de etídio. A fluorescência do brometo de etídio é medida utilizando um leitor multimodo de varrimento espectral Varioscan Flash (Thermo, Finlândia). O deslocamento do brometo de etídio foi observado na emissão de 590 nm (excitação a 544 nm) após adição do transportador ao DNA (20 μg/ml) pré-incubado com o agente intercalante brometo de etídio (400 ng/ml). O deslocamento foi calculado utilizando a fórmula (F-Ff)/(Fb-Ff), onde Ff e Fb são as intensidades de fluorescência do brometo de etídio na ausência e presença de DNA, respectivamente. Os resultados são apresentados na Figura 1.

Exemplo 2. Realização de transfecção in vitro.

Células HeLa, A172 e CHO foram semeadas em placas de cultura de 48 poços (Nunc) 24 horas antes da transfecção a uma taxa de 50.000 células por poço contendo 500 μl de uma mistura de cultura padrão consistindo em meio de cultura DMEM (GIBCO), 10% de bovino fetal soro (GIBCO), glutamina 2 mM, com adição de penicilina (50 U/ml), estreptomicina (50 μg/ml) e piruvato de sódio 1 mM. Uma suspensão dos complexos foi preparada de acordo com o método descrito no exemplo 1 à taxa de 2 μg de DNA por poço de uma placa de cultura. 10 minutos antes de adicionar uma suspensão de complexos DNA/transportador, as células foram lavadas várias vezes com DMEM e 500 μl de meio contendo 15% de glicerol e 1,5% de etanol foram adicionados a cada poço. A transfecção foi realizada adicionando uma suspensão de complexos DNA/transportador ao meio. Após a adição dos complexos, as placas com células foram colocadas em termostato com temperatura de 37°C e 5% de CO 2 por 4 horas. Após o tempo de incubação, as células foram lavadas com DMEM e 500 μl de mistura de cultura padrão foram adicionados a cada poço. A placa de cultura foi incubada em termostato a 37°C e 5% de CO2 por 48 horas, após o que foi detectada a expressão do gene marcador.

Exemplo 3: Detecção da expressão do gene da luciferase após transfecção in vitro.

O meio foi removido das placas de cultura e as células foram lavadas em 1x PBS (pH 7,2). 80 μl de tampão de lise (25 MM Gly-Gly, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF; pH 7,8) foram adicionados a cada poço. 50 μl de lisado foram transferidos para placas de poliestireno com paredes opacas para medir a atividade da luciferase. A medição foi realizada utilizando um leitor multimodo de varredura espectral Varioscan Flash (Thermo, Finlândia). A medição foi realizada utilizando uma solução de mistura flash de luciferase (Tricina 20 mM, 1,07 mM (MgCO 3) 4 Mg (OH) 2 × 5 H 2 O, MgSO 4 2,67 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 33,3 mM, 530 μM ATP, 270 μM de acetil coenzima A, 470 μM de luciferina). Cada medição foi realizada durante 10 segundos. As leituras do instrumento foram obtidas em unidades relativas de luz (RLU). Os resultados experimentais foram avaliados em unidades relativas de luz por 1 mg de proteína total de extratos celulares em um poço de uma placa de cultura. Total A proteína em cada poço foi medida utilizando um kit de ensaio de proteínas (Bio-Rad), em relação a uma curva de calibração de albumina de soro bovino. Os resultados são apresentados nas Figuras 2, 3, 4.

Introdução

1 Principais grupos de enzimas geneticamente modificadas

1.1 Enzimas de restrição

1.1.1 Mecanismo de ação das enzimas de restrição

1.1.2 Construção de mapas de restrições

1.3 Ligases

2 Introdução de um novo gene em uma célula

2.1 Regulação da expressão genética em procariontes

2.2 Métodos administração direta gene em uma célula

2.3 Introdução de genes em células de mamíferos

2.4 Transformação genética células somáticas mamíferos

2.5 Terapia genética

2.6 Produção de animais transgênicos

Conclusão

Bibliografia

Introdução

A engenharia genética é a construção in vitro de estruturas genéticas funcionalmente ativas (DNA recombinante), ou em outras palavras, a criação de programas genéticos artificiais (Baev A. A.). Segundo E. S. Piruzyan, a engenharia genética é um sistema de técnicas experimentais que permite construir estruturas genéticas artificiais em laboratório (in vitro) na forma das chamadas moléculas de DNA recombinantes ou híbridas.

Estamos falando de direcionado, antecipadamente determinado programa construção de sistemas genéticos moleculares fora do corpo com sua subsequente introdução em um organismo vivo. Neste caso, o DNA recombinante torna-se parte integral aparato genético do organismo receptor e conferir-lhe novas propriedades genéticas, bioquímicas e, em seguida, fisiológicas únicas.

O objetivo da engenharia genética aplicada é projetar moléculas de DNA recombinante que, quando introduzidas no aparato genético, dariam ao corpo propriedades úteis aos humanos.

A tecnologia de DNA recombinante usa os seguintes métodos:

Clivagem específica do DNA por nucleases de restrição, acelerando o isolamento e manipulação de genes individuais;

Sequenciamento rápido de todos os nucleotídeos de um fragmento de DNA purificado, que permite determinar os limites do gene e a sequência de aminoácidos por ele codificada;

Construção de DNA recombinante;

Hibridização de ácidos nucleicos, que permite a detecção de sequências específicas de RNA ou DNA com maior precisão e sensibilidade, com base na sua capacidade de ligação a sequências de ácidos nucleicos complementares;

Clonagem de DNA: amplificação in vitro usando elo de cadeia reação da polimerase ou introdução de um fragmento de DNA em célula bacteriana, que, após tal transformação, reproduz este fragmento em milhões de cópias;

Introdução de DNA recombinante em células ou organismos.

História da engenharia genética

A engenharia genética surgiu graças ao trabalho de diversos pesquisadores em diversos ramos da bioquímica e da genética molecular. Durante muitos anos, as proteínas foram consideradas a principal classe de macromoléculas. Havia até a suposição de que os genes eram de natureza proteica. Somente em 1944 Avery, McLeod e McCarthy mostraram que o DNA é o portador da informação hereditária. A partir dessa época, iniciou-se um estudo intensivo dos ácidos nucléicos. Uma década depois, em 1953, J. Watson e F. Crick criaram um modelo de DNA de fita dupla. Este ano é considerado o ano de nascimento da biologia molecular.

Na virada das décadas de 50 e 60, as propriedades de Código genético, e no final da década de 60 sua universalidade foi confirmada experimentalmente. Houve um intenso desenvolvimento da genética molecular, cujos objetos eram a E. coli, seus vírus e plasmídeos. Foram desenvolvidos métodos para isolar preparações altamente purificadas de moléculas de DNA intactas, plasmídeos e vírus. O DNA de vírus e plasmídeos foi introduzido nas células de forma biologicamente ativa, garantindo sua replicação e expressão dos genes correspondentes. Na década de 70, foram descobertas várias enzimas que catalisam as reações de conversão do DNA. Papel especial no desenvolvimento de métodos Engenharia genética pertence a enzimas de restrição e DNA ligases.

A história do desenvolvimento da engenharia genética pode ser dividida em três etapas. A primeira etapa está associada à comprovação da possibilidade fundamental de obtenção de moléculas de DNA recombinante in vitro. Estes trabalhos dizem respeito à produção de híbridos entre diferentes plasmídeos. A possibilidade de criar moléculas recombinantes usando as moléculas originais de DNA de Vários tipos e cepas bacterianas, sua viabilidade, estabilidade e funcionamento.

A segunda etapa está associada ao início dos trabalhos de obtenção de moléculas de DNA recombinante entre os genes cromossômicos de procariontes e diversos plasmídeos, comprovando sua estabilidade e viabilidade.

A terceira etapa é o início dos trabalhos de inclusão de genes eucarióticos, principalmente animais, em moléculas de DNA vetorial (DNA utilizado para transferência de genes e capaz de ser integrado ao aparato genético da célula receptora).

Formalmente, a data de nascimento da engenharia genética deve ser considerada 1972, quando na Universidade de Stanford P. Berg, S. Cohen, H. Boyer e colaboradores criaram o primeiro DNA recombinante contendo fragmentos de DNA do vírus SV40, bacteriófago e E. coli .

1 Principais grupos de enzimas geneticamente modificadas

A engenharia genética é descendente da genética molecular, mas deve seu nascimento aos sucessos da enzimologia genética e da química dos ácidos nucléicos, uma vez que as enzimas são as ferramentas de manipulação molecular. Embora às vezes possamos trabalhar com células e organelas celulares usando micromanipuladores, mesmo os menores instrumentos microcirúrgicos não ajudarão ao trabalhar com macromoléculas de DNA e RNA. O que fazer? As enzimas atuam como “bisturi”, “tesoura” e “linha para costura”.

Só eles podem encontrar certas sequências de nucleotídeos, “cortar” uma molécula ali ou, inversamente, “consertar” um buraco em uma cadeia de DNA. Essas enzimas atuam nas células há muito tempo, realizando trabalhos de replicação (duplicação) do DNA durante a divisão celular, reparo de danos (restauração da integridade da molécula), nos processos de leitura e transferência Informação genética de célula em célula ou dentro de uma célula. A tarefa do engenheiro genético é selecionar uma enzima que cumpra as tarefas atribuídas, ou seja, seja capaz de trabalhar com uma determinada seção do ácido nucléico.

Deve-se notar que as enzimas utilizadas na engenharia genética carecem de especificidade de espécie, de modo que o experimentador pode combinar fragmentos de DNA de qualquer origem na sequência de sua escolha em um único todo. Isso permite que a engenharia genética supere as barreiras de espécies estabelecidas pela natureza e realize cruzamentos interespecíficos.

As enzimas utilizadas na construção do DNA recombinante podem ser divididas em vários grupos:

Enzimas que produzem fragmentos de DNA (enzimas de restrição);

Enzimas que sintetizam DNA em um molde de DNA (polimerases) ou RNA (transcriptases reversas);

Enzimas que conectam fragmentos de DNA (ligases);

Enzimas que permitem alterações na estrutura das extremidades dos fragmentos de DNA.

1.1 Enzimas de restrição

É geralmente aceito que os termos “enzima de restrição”, “endonuclease de restrição” e “endodesoxirribonuclease específica de sítio” são sinônimos.

Todas as endonucleases de restrição bacteriana reconhecem sequências de DNA específicas e bastante curtas e ligam-se a elas. Este processo é acompanhado pelo corte da molécula de DNA no próprio sítio de reconhecimento ou em algum outro sítio, que é determinado pelo tipo de enzima. Juntamente com a atividade de restrição, a cepa bacteriana tem a capacidade de metilar o DNA; Este processo é caracterizado pela mesma especificidade de sequência de DNA que a restrição. A metilase adiciona grupos metil aos resíduos de adenina ou citosina no mesmo local onde a enzima de restrição se liga. Como resultado da metilação, o sítio torna-se resistente à restrição. Portanto, a metilação protege o DNA de ser cortado.

Existem 3 classes principais de enzimas de restrição: 1, 2 e 3.

Todas as enzimas de restrição reconhecem sequências estritamente definidas na fita dupla de DNA, mas as enzimas de restrição de classe 1 fazem quebras em pontos arbitrários na molécula de DNA, e as enzimas de restrição de classes 2 e 3 reconhecem e clivam o DNA em pontos estritamente definidos dentro dos locais de reconhecimento ou em um localização fixada a partir deles distância.

As enzimas dos tipos 1 e 3 possuem uma estrutura de subunidade complexa e possuem dois tipos de atividades - modificadora (metilação) e endonuclease dependente de ATP.

As enzimas de classe 2 consistem em 2 proteínas separadas: uma endonuclease de restrição e uma metilase modificadora; portanto, apenas enzimas de classe 2 são usadas em engenharia genética. Eles requerem íons de magnésio como cofatores.

Atualmente, mais de 500 enzimas de restrição de classe 2 foram isoladas, mas entre as enzimas isoladas de diversos microrganismos, existem aquelas que reconhecem as mesmas sequências no DNA. Esses pares ou grupos são chamados de isosquizômeros. É feita uma distinção entre o verdadeiro isosquisomerismo, quando as enzimas reconhecem a mesma sequência de nucleotídeos e quebram o DNA nos mesmos pontos, e o falso isosquisomerismo, quando as enzimas, reconhecendo o mesmo local no DNA, fazem quebras nos mesmos pontos. pontos diferentes dentro do mesmo site.

A maioria das enzimas de restrição de classe 2 reconhece sequências contendo de 4 a 6 pares de nucleotídeos, portanto, as enzimas de restrição são divididas em cortes pequenos e grandes. As enzimas de restrição de corte pequeno reconhecem tetranucleotídeos e introduzem muito mais quebras nas moléculas do que as enzimas de restrição de corte grande, que reconhecem uma sequência de seis pares de nucleotídeos. Isso se deve ao fato de que a probabilidade de ocorrência de uma determinada sequência de quatro nucleotídeos é muito maior do que a de uma sequência de seis nucleotídeos. Por exemplo, o DNA do bacteriófago T7, que consiste em 40.000 pares de bases, não possui uma sequência reconhecida pela enzima de restrição R1 de E. coli.

As enzimas de restrição Hpa II e Alu (de Arthrobacter luteus) são de divisão pequena; Eco R I (de Escherichia coli) e Traseira III. Se assumirmos que os sítios de reconhecimento de enzimas de restrição são distribuídos aleatoriamente ao longo da cadeia de DNA, então o alvo para enzimas que reconhecem uma sequência (sítio) de quatro nucleotídeos deve ocorrer em média uma vez a cada 256 pares de bases, e para enzimas que reconhecem seis nucleotídeos - a cada 4.096 pares de bases. pares. Se o sítio de restrição estiver dentro do gene, o tratamento com enzima de restrição de DNA levará à sua inativação. A probabilidade de tal evento é muito alta quando tratada com enzimas de restrição de corte pequeno e insignificante quando se utilizam endonucleases de corte grande. Portanto, para obter um gene intacto, a clivagem é realizada alternadamente com várias enzimas de restrição de corte grande, ou é utilizada a técnica de “sub-restrição”, ou seja, a restrição é realizada sob condições em que a clivagem ocorre em apenas um local.

A técnica, desenvolvida por cientistas da Universidade da Califórnia, Irvine, sob a direção do Dr. Peter Donovan e baseada em uma combinação de dois métodos conhecidos de manipulação de células-tronco embrionárias, duplica a eficiência da entrega de DNA às células-tronco embrionárias humanas.

Os métodos modernos de introdução de DNA em hESCs usando transfecção química, nucleofecção e eletroporação têm uma séria desvantagem - baixa eficiência. A entrega de material genético a hESCs usando uma infecção viral é mais eficaz, mas tem muitos consequências indesejáveis para células estaminais e não pode ser considerado completamente seguro do ponto de vista médico se as células se destinarem a transplantes adicionais.

Uma nova técnica baseada em uma combinação de nucleofecção de uma única célula-tronco e um método otimizado para selecionar as colônias transgênicas resultantes garante a expressão oportuna e estável de transgenes nas células. A nucleofecção envolve a formação de poros na membrana celular por meio de impulsos elétricos e a subsequente introdução de DNA na célula.

Além do gene de interesse, a construção modificadora do DNA carrega um gene que permite fácil rastreamento da célula transformada, por exemplo, o gene que codifica a proteína fluorescente verde Renilla humanizada (hrGFP). Este método de marcação celular permite observar o movimento das células transformadas quando são transplantadas para animais.

Potencialmente, este método poderia ser útil para o tratamento de doenças monogênicas causadas por mutações de um gene em todas as células de uma pessoa doente. De acordo com Organização Mundial Saúde, mais de 10.000 doenças humanas são de natureza monogênica. Milhões de pessoas em todo o mundo sofrem de doenças monogénicas, que incluem a doença de Huntington, anemia falciforme, hemofilia e fibrose cística.

Novo método expandirá as possibilidades de manipulação de células hES, permitirá modelar doenças humanas e encontrar medicamentos adequados. Usando esta técnica, os cientistas serão capazes de corrigir distúrbios genéticos em células-tronco e usar células saudáveis ​​em Medicina regenerativa.

Colônia de células hES expressando proteínas verdes fluorescentes hrGFP.

Artigo de Hohenstein KA et al. “Nucleofection Mediates High-efficiency Stable Gene Knockdown and Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells” está disponível na versão on-line da revista Células-tronco desde 6 de março de 2008.

O DNA recombinante é introduzido nas células receptoras. Na engenharia genética, essas células receptoras desempenham duas funções. 1. Eles permitem pesquisar clones de DNA recombinante sintetizado no banco de genes. 2 Posteriormente, essas células receptoras podem ser utilizadas para obter produtos alvo.

O método de introdução do DNA recombinante é levado em consideração com base no tipo de vetor em que esse DNA recombinante foi obtido e nas células de quais organismos ele deve ser introduzido pela transformação de uma célula ou protoplasto, ou pelo método de eletroporação. Se o DNA recombinante for obtido de fagos, ele pode ser introduzido no DNA isolado - isto é transvecção. Você pode introduzir partículas fágicas intactas - isso é uma infecção (cosmídeos, fasmídeos).

Dr. caminhos troca genética– conjugação, transdução.

Em células vegetais – transformação de protoplastos vegetais, processamento de células ou tecidos vegetais com DNA recombinante; a injeção de DNA recombinante no núcleo é amplamente utilizada; uso de lipossomas. Os lipossomas são estruturas esféricas que possuem uma concha lipídica, dentro da qual existe DNA recombinante. Para introdução em células animais - infecções virais, método de eletroporação, microinjeção no núcleo. Se, após a introdução do DNA recombinante, todas as células do corpo o herdam, então se fala em obter um organismo transgênico.

Eletroporação - células ou protoplastos são expostos a corrente de alta tensão (2.000-4.000 volts) por um curto período de tempo. Como resultado, são formados poros de aproximadamente 100 mm na membrana celular. 30 nm, que pode existir por 1-2 minutos e através do qual o DNA recombinante pode entrar na célula. Os poros então se fecham e o DNA permanece na célula. Este é um método universal.

Método balístico– são usados ​​principalmente em eucariotos. São utilizadas armas balísticas, nas quais são introduzidas partículas AK ou W, sobre as quais é pulverizado DNA recombinante. Então, com a ajuda de gases inertes em P, essas partículas são disparadas de uma arma para a cultura celular. De acordo com vários padrões, algumas das partículas entram no núcleo e o DNA recombinante é retido ali.

Procure clones com DNA recombinante.

Esta fase é difícil e imprevisível.

O método mais simples é procurar clones por fenótipo após a introdução de DNA recombinante(por exemplo, pigmentação). Pode-se utilizar testes de complementação, mas é necessário ter células mutantes que apresentem defeito na síntese do produto ativo.

Os métodos de hibridização requerem a presença de sondas específicas de DNA ou RNA marcadas. Mais frequentemente, eles são rotulados como P 32. Sondas m.b. sequências oligonucleotídicas curtas que correspondem à parte mais conservada do gene que está sendo pesquisado. Estas sequências conservadas podem incluir até 100 nucleotídeos para procariontes e até 1.000 para eucariotos.

Após a introdução do DNA recombinante, as colônias formadas no meio são transferidas para um filtro especial de nitrocelulose. Eles são submetidos à lise e subsequente desnaturação do DNA usando álcali. O DNA se liga firmemente ao filtro. O filtro é lavado e tratado com uma sonda marcada radioativamente, e o clone ao qual esta sonda se ligou é determinado.

Métodos imunoquímicos– após a introdução do DNA recombinante, os clones são lisados ​​e tratados com anticorpos para o produto correspondente. Esses anticorpos são marcados.